一種高效缺血性損傷修復(fù)的hUCMSCs及其制備方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肢動脈缺血性疾病，涵蓋下肢動脈硬化性閉塞癥(aso)、血栓閉塞性脈管炎(tao)及糖尿病肢體動脈閉塞癥(dlao)等多種病癥，其臨床表現(xiàn)多樣，包括患肢乏力、間歇性跛行、靜息痛、肌肉萎縮，嚴重時甚至出現(xiàn)潰瘍、壞死乃至截肢的風險。這類疾病不僅給患者帶來極大的痛苦，治療過程漫長且復(fù)雜，還伴隨著高致殘率與死亡率，嚴重降低了患者的生活質(zhì)量，并造成了沉重的經(jīng)濟與社會負擔。當前，臨床治療主要依賴于動脈旁路移植和血管腔內(nèi)技術(shù)，但這些方法受限于嚴格的適應(yīng)癥，且預(yù)后效果往往不盡人意，特別是對于年老體弱、無法耐受手術(shù)或腔內(nèi)治療效果不佳、面臨截肢風險的患者，缺乏有效的治療手段。因此，探索新的治療方法與藥物，以應(yīng)對周圍動脈閉塞癥，成為臨床上的迫切需求。

2、近年來，大量研究表明，間充質(zhì)干細胞(ucmscs)的旁分泌機制在改善下肢缺血方面扮演著至關(guān)重要的角色。這些干細胞通過分泌一系列生物活性分子，如上皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、成纖維因子、血細胞生長因子、黏連蛋白及血管蛋白-1等，作用于特定的信號調(diào)節(jié)通路，激活并促進成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的遷移、增殖與分化，進而加速血管新生。這一過程能夠顯著增加缺血區(qū)域的血液供應(yīng)，從而提升缺血性潰瘍的愈合能力。此外，這些細胞因子還具備抑制傷口處炎癥反應(yīng)的功能，有助于加速傷口愈合進程。然而，常規(guī)的間充質(zhì)干細胞(ucmscs)在應(yīng)用中面臨挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在其旁分泌的促血管生成因子及抗炎癥反應(yīng)因子含量較低，且對體內(nèi)微環(huán)境的適應(yīng)能力有限，這極大地限制了其治療效果。

3、另一方面，氧氣濃度作為影響細胞和微生物生長的關(guān)鍵因素，其調(diào)控對于細胞培養(yǎng)至關(guān)重要。例如，小鼠胚胎成纖維細胞在3％的低氧環(huán)境下培養(yǎng)，相較于20％的常規(guī)氧濃度，展現(xiàn)出更健康的生長狀態(tài)，dna損傷減少，應(yīng)激反應(yīng)也更為輕微。在模擬急性炎癥環(huán)境的實驗中，tnf-α和il-1β作為缺血和損傷組織中高表達的炎性細胞因子，常被用于研究。然而，常規(guī)的間充質(zhì)干細胞(如hucmscs，人臍帶間充質(zhì)干細胞等)由于旁分泌因子含量不足及對體內(nèi)微環(huán)境適應(yīng)性差，難以充分發(fā)揮其在組織缺血性損傷修復(fù)中的潛力。

4、綜上所述，針對肢動脈缺血性疾病的治療，亟需開發(fā)能夠高效促進血管生成、抑制炎癥反應(yīng)，并適應(yīng)體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境的新型間充質(zhì)干細胞療法或相關(guān)藥物，以滿足臨床需求，改善患者預(yù)后。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs及其制備方法和應(yīng)用。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

3、得到p2代hucmscs細胞；

4、于氧濃度體積分數(shù)范圍1％-10％和添加有炎性因子預(yù)激活組合物的條件下，將所述p2代hucmscs細胞進行傳代擴增培養(yǎng)，得到所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs；

5、其中，所述炎性因子預(yù)激活組合物包括以下組分：10-50ng/ml?tnf-a、10-50ng/mlil-1β、0-20umol/llpa、10-100ng/ml?hgf。

6、進一步地，得到p2代hucmscs細胞的步驟包括：從臍帶組織中分離，貼壁培養(yǎng)法獲得p2代hucmscs細胞。

7、進一步地，得到p2代hucmscs細胞的步驟包括以下過程：

8、步驟1：氏膠，剪碎并清洗，置于培養(yǎng)皿中備用；

9、步驟2：將處理后的組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，組織塊間貼壁接種間隔距離1-2cm，于37℃、5.0％的co2條件下孵育；

10、步驟3：加入人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，接種標記hucmscs?p0，定期觀察細胞生長情況并換液；

11、步驟4：hucmscs?p0細胞生長至融合度80％-90％，消化并收集p0代細胞，離心過濾去除組織塊，得到p0代臍帶間充質(zhì)干細胞hucmscs?p0；

12、步驟5：按1*10^6-2*10^6個/t75cm2瓶接種hucmscs?p1，培養(yǎng)至融合度80％-90％后再次收集，傳代培養(yǎng)和收集細胞，得到p2代hucmscs細胞。

13、進一步地，所述步驟4包括以下過程：培養(yǎng)12-15天，hucmscs?p0細胞生長至融合度80％-90％，棄去上清培養(yǎng)液，加生理鹽水3-5ml/瓶洗滌1-2次，用0.25％胰蛋白酶/edta消化液，0.5-1ml/瓶消化下爬出細胞及組織塊，并用無血清胰蛋白酶終止液1-3ml/瓶終止消化；用50ml收集組織塊及細胞懸液，1000-2000rpm離心5min,棄上清液，加入適量生理鹽水混勻，用70-100μm濾網(wǎng)過濾去除組織塊，即得到p0代臍帶間充質(zhì)干細胞hucmscs?p0。

14、進一步地，所述步驟5包括以下過程：按1*10^6-2*10^6個/t75cm2瓶接種hucmscsp1，每瓶加入10-20ml人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，置于37℃?5.0％?co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)每2-4天待細胞融合率達到80％-90％時，重復(fù)步驟4收集hucmscs?p1代細胞，細胞計數(shù)按1:3傳代hucmscs?p2，待細胞融合率達到80％-90％時，重復(fù)步驟4收集hucmscs?p2代細胞。

15、進一步地，于氧濃度體積分數(shù)范圍1％-10％和添加有炎性因子預(yù)激活組合物的條件下，將所述p2代hucmscs細胞進行傳代擴增培養(yǎng)，得到所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs的步驟包括以下過程：

16、hucmscs-p2代細胞進行傳代擴增培養(yǎng)，采用氧體積分數(shù)濃度范圍額1％-10％的三氣培養(yǎng)箱、20-30ml/t175cm2人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基、炎性因子預(yù)激活組合物、按細胞計數(shù)按1:3傳代hucmscs-p3，培養(yǎng)2-4天，待細胞融合率達到80％-90％時，重復(fù)步驟4收集hucmscs?p3代細胞及其細胞上清液。

17、第二方面，本發(fā)明提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs，所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs是采用第一方面任一項所述的制備方法制得。

18、進一步地，所述高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs分泌vegf蛋白水平為483.76±92.34pg/ml。

19、第三方面，本發(fā)明提供了一種第一方面和第二方面任一項所述的高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs在制備治療肢動脈缺血性疾病藥物中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明實施例提供的上述技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比至少具有如下優(yōu)點：

21、本發(fā)明實施例提供了一種高效缺血性損傷修復(fù)的hucmscs及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明通過于氧濃度體積分數(shù)范圍1％-10％和添加有炎性因子預(yù)激活組合物的特定條件下，將所述p2代hucmscs細胞進行傳代擴增培養(yǎng)，使ucmscs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)階段適應(yīng)體內(nèi)缺氧的病理微環(huán)境，誘導(dǎo)ucmscs對損傷微環(huán)境的記憶,保護ucmscs對抗不利的微環(huán)境，維持基因的穩(wěn)定性。維持ucmscs的未分化狀態(tài),促進了ucmscs的增殖和存活,同時促進其旁分泌功能增強，如促血管生成因子vegf、hgf和堿性成纖維細胞生長因子bfgf、egf等的分泌增加，使其表現(xiàn)出更好的特性并具有更好的下肢缺血性損傷的修復(fù)效果，解決了現(xiàn)有hucmscs存在旁分泌的促血管生成和抑制炎癥反應(yīng)的細胞因子含量比較低，適應(yīng)體內(nèi)微環(huán)境能力差等問題，彌補了現(xiàn)有技術(shù)的不足。