一種角蛋白CF4、制法和其藥物組合物與用途

本發(fā)明涉及一種角蛋白cf4，編碼角蛋白cf4的核酸分子，含有該核酸分子的表達(dá)載體，以及含有該表達(dá)載體或基因組整合該核酸分子的宿主細(xì)胞，以及角蛋白cf4的制備方法，含有這種角蛋白的藥物組合物，以及這種角蛋白和所述藥物組合物在制備解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰、抗驚厥、抗癲癇、降血壓、抗炎、抗病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、角蛋白是蛋白質(zhì)的一種，廣泛存在于人和動(dòng)物的表皮，并且是毛發(fā)、羽毛、蹄、殼、爪、角等的主要成分，是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，起著保護(hù)機(jī)體的作用。

2、角蛋白廣泛存在于生物體中，是一種可再生資源，具有很大的利用價(jià)值，但并沒(méi)有得到廣泛有效的利用。主要原因是角蛋白不溶于各種溶劑，并且角蛋白一般都較其他蛋白質(zhì)更耐蛋白酶的酶解。因此提取制備天然角蛋白的難度非常大。

3、隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因工程、微生物工程等現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)。而利用蛋白表達(dá)系統(tǒng)制備生產(chǎn)目的蛋白是研究基因或蛋白的生物功能的重要手段。

4、利用蛋白表達(dá)系統(tǒng)制備目的角蛋白，進(jìn)而研究其結(jié)構(gòu)與功能，未見(jiàn)其他文獻(xiàn)報(bào)道，具有新穎性和創(chuàng)造性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種角蛋白cf4，編碼角蛋白cf4的核酸分子，含有該核酸分子的表達(dá)載體，以及含有該表達(dá)載體或基因組整合該核酸分子的宿主細(xì)胞，以及角蛋白cf4的制備方法，含有角蛋白cf4的藥物組合物，以及上述角蛋白cf4、核酸分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、或藥物組合物在制備解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰、抗驚厥、抗癲癇、降血壓、抗炎、抗病毒藥物中的應(yīng)用。

2、為解決本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明技術(shù)方案的第一方面是提供了一種角蛋白cf4，其特征在于，所述角蛋白cf4的氨基酸序列為：

4、(1)序列表中seq?id?no.1所示的氨基酸序列；

5、(2)序列表中seq?id?no.1所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加1-35個(gè)氨基酸形成的基本上保持相同生物學(xué)功能的氨基酸序列。

6、進(jìn)一步的，在角蛋白cf4上可進(jìn)行常規(guī)修飾；或者在角蛋白cf4上還連接有用于檢測(cè)或純化的標(biāo)簽。

7、更進(jìn)一步的，所述的常規(guī)修飾包括乙?；Ⅴ０坊?、環(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、熒光基團(tuán)修飾、聚乙二醇peg修飾、固定化修飾、硫酸化、氧化、甲基化、脫氨化、形成二硫鍵或二硫鍵斷裂；所述的標(biāo)簽包括his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc、profinity?exact。

8、本發(fā)明技術(shù)方案的第二方面是提供了一種編碼第一方面所述角蛋白cf4的核酸分子。

9、進(jìn)一步的，所述的核酸分子的核苷酸序列為：

10、(1)序列表中seq?id?no.2所示的核苷酸序列；

11、(2)基于seq?id?no.2所示的核苷酸序列進(jìn)行序列優(yōu)化得到的核苷酸序列；

12、(3)與上述(1)或(2)中的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。

13、本發(fā)明技術(shù)方案的第三方面是提供了一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有第二方面所述的核酸分子。

14、進(jìn)一步的，表達(dá)載體可以為pet系列、puc系列、pqe系列、pbv系列、pmal系列，ppic9、ppic9k、phil-s1、ppiczα/a、pyam75p，phil-d2、pa0815、ppic3k、ppicz、phwo10、pgapz、pgapza、ppic3.5k等；優(yōu)選的表達(dá)載體為pet系列載體；最優(yōu)選的表達(dá)載體為pet-28a(+)。

15、本發(fā)明技術(shù)方案的第四方面是提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有第三方面所述的表達(dá)載體或者基因組中整合有第二方面所述的核酸分子。

16、進(jìn)一步的，所述的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母、曲霉菌、植物細(xì)胞、或昆蟲(chóng)細(xì)胞。

17、更進(jìn)一步的，所述的細(xì)菌包括大腸桿菌或酵母。

18、感受態(tài)宿主細(xì)胞可以為bl21系列，transetta系列，rosetta系列，dh5α系列，jm系列，top系列，orgami系列，trans1-t1，tg1，tb1；y11430，mg1003，gs115(aox1)，km71，smd1168等；優(yōu)選的表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞為bl21(de3)，transetta(de3)。

19、本發(fā)明技術(shù)方案的第五方面是提供了一種制備第一方面所述角蛋白cf4的方法，其特征在于，包括以下步驟：

20、a.合成第一方面所述的角蛋白cf4對(duì)應(yīng)的核酸分子，將核酸分子連入相應(yīng)的表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞，在一定條件下在發(fā)酵設(shè)備中培養(yǎng)帶表達(dá)載體的宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)角蛋白cf4，得到含有角蛋白cf4的粗蛋白溶液；

21、b.對(duì)步驟a中所表達(dá)的粗蛋白溶液進(jìn)行分離純化干燥得到角蛋白cf4。

22、進(jìn)一步的，在步驟a中，所述的宿主細(xì)胞主要為選自大腸桿菌，所述的角蛋白cf4在大腸桿菌包涵體中表達(dá)，所述的發(fā)酵設(shè)備包括搖瓶或發(fā)酵罐。

23、進(jìn)一步的，在步驟a中，誘導(dǎo)表達(dá)角蛋白cf4后，可用清洗劑清洗雜質(zhì)，再用尿素溶液溶解得到粗蛋白溶液。

24、進(jìn)一步的，步驟a中的培養(yǎng)基可以為lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基、sb培養(yǎng)基、sob培養(yǎng)基、soc培養(yǎng)基，pda培養(yǎng)基、ypd培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、doba培養(yǎng)基、米曲培養(yǎng)基及其改良配方等；搖瓶發(fā)酵優(yōu)選lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基，最優(yōu)選為tb培養(yǎng)基；發(fā)酵罐優(yōu)選lb培養(yǎng)基及其改良配方。

25、進(jìn)一步的，步驟a中的誘導(dǎo)劑可以為iptg、乳糖、阿拉伯糖等；優(yōu)選為iptg、乳糖。

26、進(jìn)一步的，步驟a中，獲得的發(fā)酵菌液，離心，棄去上清液；沉淀懸浮于緩沖液中，破碎菌體，再離心，棄去上清液；沉淀用清洗劑清洗后，再用尿素溶液溶解得到cf4粗蛋白溶液。

27、其中，緩沖液優(yōu)選為buffer?a，其用量為：發(fā)酵液體積：buffer?a體積＝1～100：1，優(yōu)選為10∶1；

28、清洗劑可以為尿素溶液、鹽酸胍溶液、triton、buffer?a等，優(yōu)選為尿素溶液，最優(yōu)選為2m尿素溶液(可含有1％triton)和4m尿素溶液，其用量為：發(fā)酵液體積：尿素溶液體積＝0.2～100：1，優(yōu)選為1～15：1；

29、尿素溶液優(yōu)選為4m～8m尿素溶液，最優(yōu)選為8m尿素溶液，其用量為：發(fā)酵液體積：8m尿素體積＝0.2～100：1，優(yōu)選為2～15：1。

30、進(jìn)一步的，在步驟b中，所述的分離純化的方法包括超濾微濾膜技術(shù)純化方法、柱色譜純化方法、鹽析方法、透析方法。

31、進(jìn)一步的，步驟b中，分離純化方法如下：

32、(1)所述透析方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液用透析的方法純化，得到目標(biāo)蛋白cf4溶液。

33、透析袋截留分子量可以為0.5-10kd，優(yōu)選的透析袋截留分子量為3.5-10kd，最優(yōu)選的透析袋截留分子量為10kd。

34、(2)所述超濾微濾方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液用超濾膜或微濾膜等膜技術(shù)純化，得到目標(biāo)蛋白cf4濃縮溶液。

35、(3)所述柱色譜方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液通過(guò)柱色譜，例如各種交換柱或排阻柱色譜，分離純化得到目標(biāo)蛋白cf4。

36、優(yōu)選的排阻柱是葡聚糖凝膠柱，superdex?30increase，superdex?75increase，superdex?200increase，superose?6increase等；優(yōu)選的交換柱是離子交換樹(shù)脂柱：陰離子交換樹(shù)脂柱，hitrap?q?ff，hitrap?capto?q?impres，capto?q?impres，hitrap?capto?q，hitrap?deae，toyopearl?q-650m，toyopearl?superq-650m等；陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，hitrapsp?ff，hitrap?capto?sp?impres，capto?sp?impres，hitrap?capto?sp，toyopearl?sp-650m，toyopearl?super?sp-650m。

37、洗脫劑可以使用本領(lǐng)域常用的洗脫劑，例如水、鹽溶液，所述鹽溶液包括氯化鈉溶液、磷酸二氫鈉溶液、磷酸氫二鈉溶液、醋酸鈉、醋酸等。

38、(4)所述鹽析方法，即將步驟a中獲得的粗蛋白溶液中用鹽析的方法純化，得到目標(biāo)蛋白cf4混懸液。

39、鹽析劑可以為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鋁，硝酸銨、氯化銨、硫酸鎂等。優(yōu)選的鹽析劑為硫酸銨及其水溶液。加入飽和硫酸銨水溶液使硫酸銨終濃度達(dá)到10～50％，優(yōu)選為20～30％，更優(yōu)選為25％。

40、鹽析次數(shù)為1～3次，優(yōu)選為2次。

41、鹽析后沉淀加入純水清洗，清洗次數(shù)為2～5次，優(yōu)選為3次。

42、進(jìn)一步的，步驟b純化得到的目標(biāo)蛋白cf4溶液可經(jīng)冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可將濃縮液直接噴霧干燥成干粉。

43、本發(fā)明技術(shù)方案的第六方面是提供了一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有第一方面所述的角蛋白cf4或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表達(dá)載體或第四方面所述的宿主細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

44、本發(fā)明上述步驟中得到的角蛋白可經(jīng)冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可把濃縮液體直接噴霧干燥成干粉，然后制成各種劑型。

45、本發(fā)明涉及一種藥物組合物，包括上述步驟中得到的任意一種角蛋白及藥學(xué)上可接受的載體。

46、本發(fā)明還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明角蛋白以及常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明角蛋白占藥物組合物總重量的0.1～100.0％。

47、本發(fā)明還提供一種藥物組合物，它包括藥物有效劑量的作為活性成分的蛋白質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體。

48、本發(fā)明所述的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明蛋白質(zhì)與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?/p>

49、本發(fā)明角蛋白或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺、皮膚、陰道、腹膜、直腸等，優(yōu)選口服給藥。

50、本發(fā)明角蛋白或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、腹腔注射和穴位注射等。

51、給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括水包油型、油包水型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等。固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。

52、本發(fā)明角蛋白可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。

53、為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤(rùn)劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹(shù)脂、卡波姆、聚乙烯毗咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯毗咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與構(gòu)椽酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉；潤(rùn)滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。

54、還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。

55、為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃菩膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。

56、為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。

57、為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明角蛋白與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明角蛋白制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。

58、例如，將本發(fā)明角蛋白制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、l,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。

59、此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。

60、為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，本發(fā)明的角蛋白或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。

61、本發(fā)明角蛋白藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明角蛋白組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明角蛋白的每天的合適劑量范圍：本發(fā)明的角蛋白的用量為0.01～500mg/kg體重，優(yōu)選為0.5～100mg/kg體重，更優(yōu)選為1～50mg/kg體重，最優(yōu)選為2～30mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥，這取決于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及包括運(yùn)用其它治療手段的給藥方案。每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或藥物組合物可單獨(dú)服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。

62、本發(fā)明技術(shù)方案的第七方面是提供了第一方面所述的角蛋白cf4或第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的表達(dá)載體或第四方面所述的宿主細(xì)胞或第六方面所述的藥物組合物在制備解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗驚厥、抗癲癇、降血壓、抗炎、抗病毒藥物中的應(yīng)用。

63、為了完成本發(fā)明之目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案，具體地講，制備本發(fā)明角蛋白cf4，包括如下步驟：

64、(1)合成核苷酸序列，并測(cè)定序列的準(zhǔn)確性；

65、優(yōu)選的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

66、(2)將核苷酸序列轉(zhuǎn)入表達(dá)載體中；

67、表達(dá)載體可以為pet系列、puc系列、pqe系列、pbv系列、pmal系列，ppic9、ppic9k、phil-s1、ppiczα/a、pyam75p，phil-d2、pa0815、ppic3k、ppicz、phwo10、pgapz、pgapza、ppic3.5k等；優(yōu)選的表達(dá)載體為pet系列載體；最優(yōu)選的表達(dá)載體為pet-28a(+)。

68、(3)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中；

69、宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌或酵母；優(yōu)選的宿主細(xì)胞為大腸桿菌；

70、感受態(tài)細(xì)胞可以為bl21系列，transetta系列，rosetta系列，dh5α系列，jm系列，top系列，orgami系列，trans1-t1，tg1，tb1；y11430，mg1003，gs115(aox1)，km71，smd1168等；優(yōu)選的表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞為bl21(de3)，transetta(de3)。

71、(4)將在適當(dāng)?shù)臈l件下，發(fā)酵培養(yǎng)宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白cf4；

72、發(fā)酵設(shè)備可以采用搖瓶或發(fā)酵罐；

73、培養(yǎng)基可以為lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基、sb培養(yǎng)基、sob培養(yǎng)基、soc培養(yǎng)基，pda培養(yǎng)基、ypd培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、doba培養(yǎng)基、米曲培養(yǎng)基及其改良配方等；搖瓶發(fā)酵優(yōu)選lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基，最優(yōu)選為tb培養(yǎng)基；發(fā)酵罐優(yōu)選lb培養(yǎng)基及其改良配方。

74、誘導(dǎo)劑可以為iptg、乳糖、阿拉伯糖等；優(yōu)選為iptg、乳糖。

75、(5)目標(biāo)蛋白cf4產(chǎn)物富集；

76、步驟(4)獲得的發(fā)酵菌液，離心，棄去上清液；沉淀懸浮于緩沖液中，破碎菌體，再離心，棄去上清液；沉淀用清洗劑清洗后，再用尿素溶液溶解，得到cf4粗蛋白溶液。

77、其中，緩沖液優(yōu)選為buffer?a，其用量為：發(fā)酵液體積：buffer?a體積＝1～100：1，優(yōu)選為5～10：1；

78、清洗劑可以為尿素溶液、鹽酸胍溶液、triton、buffer?a等，優(yōu)選為尿素溶液，最優(yōu)選為2m尿素溶液(可含有1％triton)，其用量為：發(fā)酵液體積：尿素溶液體積＝0.2～100：1，優(yōu)選為1～15：1；清洗次數(shù)為3～10次，優(yōu)選為6次；

79、尿素溶液優(yōu)選為4m～8m尿素溶液，最優(yōu)選為8m尿素溶液，其用量為：發(fā)酵液體積：8m尿素溶液體積＝0.2～100：1，優(yōu)選為2～15：1。

80、(6)分離純化目標(biāo)蛋白cf4：

81、步驟(5)獲得的粗蛋白溶液，需經(jīng)過(guò)純化獲得目標(biāo)蛋白cf4。所述純化可以通過(guò)透析、或超濾微濾、或柱色譜、或鹽析步驟進(jìn)行。

82、a.所述透析步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液用透析的方法純化，得到目標(biāo)蛋白cf4溶液。

83、透析袋截留分子量可以為0.5-10kd，優(yōu)選的透析袋截留分子量為3.5-10kd，最優(yōu)選的透析袋截留分子量為10kd。

84、b.所述超濾微濾步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液用超濾膜或微濾膜等膜技術(shù)純化，得到目標(biāo)蛋白cf4濃縮溶液。

85、c.所述柱色譜步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液通過(guò)柱色譜，例如各種交換柱或排阻柱色譜，分離純化得到目標(biāo)蛋白cf4。

86、優(yōu)選的排阻柱是葡聚糖凝膠柱，superdex?30increase，superdex?75increase，superdex?200increase，superose?6increase等；優(yōu)選的交換柱是離子交換樹(shù)脂柱：陰離子交換樹(shù)脂柱，hitrap?q?ff，hitrap?capto?q?impres，capto?q?impres，hitrap?capto?q，hitrap?deae，toyopearl?q-650m，toyopearl?superq-650m等；陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，hitrapsp?ff，hitrap?capto?sp?impres，capto?sp?impres，hitrap?capto?sp，toyopearl?sp-650m，toyopearl?super?sp-650m。最優(yōu)選的是陰離子交換樹(shù)脂柱。

87、洗脫劑可以使用本領(lǐng)域常用的洗脫劑，例如水、鹽溶液，所述鹽溶液包括氯化鈉溶液、磷酸二氫鈉溶液、磷酸氫二鈉溶液、醋酸鈉、醋酸等。

88、d.所述鹽析步驟，即將步驟(5)獲得的粗蛋白溶液中用鹽析的方法純化，得到目標(biāo)蛋白cf4混懸液。

89、鹽析劑可以為硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鋁，硝酸銨、氯化銨、硫酸鎂等。優(yōu)選的鹽析劑為硫酸銨及其水溶液。加入飽和硫酸銨水溶液使硫酸銨終濃度達(dá)到10～50％，優(yōu)選為20～30％，更優(yōu)選為25％。

90、鹽析次數(shù)為1～3次，優(yōu)選為2次。

91、鹽析后沉淀加入純水清洗，清洗次數(shù)為2～5次，優(yōu)選為3次。

92、步驟a～d純化得到的目標(biāo)蛋白cf4溶液可經(jīng)冷凍干燥或真空干燥成干粉，也可將濃縮液直接噴霧干燥成干粉。

93、本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

94、1、本發(fā)明蛋白為首次獲得的角蛋白，本發(fā)明的制備方法具備收率高、樣品純度高的特點(diǎn)。

95、2、本發(fā)明通過(guò)蛋白cf4對(duì)酵母誘導(dǎo)的sd大鼠發(fā)熱模型的藥效試驗(yàn)研究，證明蛋白cf4在造模后2小時(shí)具有顯著的降低模型動(dòng)物體溫升高的作用；

96、3、本發(fā)明通過(guò)蛋白cf4對(duì)致驚劑匹羅卡品(plo)致小鼠驚厥和癲癇的藥效試驗(yàn)研究，證明蛋白cf4能夠明顯延長(zhǎng)小鼠癲癇ii級(jí)發(fā)作潛伏期；

97、4、本發(fā)明通過(guò)蛋白cf4對(duì)小鼠酚紅排泄法祛痰的藥效試驗(yàn)研究，證明蛋白cf4具有明顯的祛痰作用,祛痰作用與陽(yáng)性對(duì)照沐舒坦相當(dāng)。

98、5、本發(fā)明通過(guò)蛋白cf4對(duì)icr小鼠醋酸扭體的藥效試驗(yàn)研究，證明蛋白cf4能減少小鼠扭體次數(shù)，具有鎮(zhèn)痛作用。