本發(fā)明涉及一種腸溶益生菌制劑，屬于微生物發(fā)酵領域。
背景技術：
：益生菌制劑又稱微生態(tài)制劑，是指能夠促進腸道內菌群平衡的活菌制劑及其代謝產物。益生菌制劑中包含活的微生物，當攝入足夠的數(shù)量時，能夠對宿主起有益的健康作用。因此，益生菌在醫(yī)藥、農業(yè)、工業(yè)、食品和飼料等與人類生活密切相關的領域中發(fā)揮越來越重要的作用。西歐和日本對益生菌制劑研究最早，產品種類較多，市場較為完善。至2004年，歐洲益生菌制劑產品的價值已達30億美元，消費量占總食品消費總量的5％；而日本在1998年5月批準保健食品(foshu)108個，其中約50％為益生菌制劑。截止到2010年，全球微生態(tài)制劑的產值已達到47億美元。國際權威機構對益生菌制劑產品的規(guī)格進行了新的規(guī)定：建議把每克產品含有1×105個有效菌作為理療用標準，保健用益生菌產品每克或每毫升有效菌數(shù)不低于1×107個。目前，國外多圍繞乳酸桿菌、雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌及一些鏈球菌類益生菌制劑進行研究，如表1所示。表1商品名主要成分生產廠家probios多種乳酸桿菌nuabs.division.pioneerfeed-mate68.糞鏈球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌anchorlabsst.josephmostrain40.嗜酸乳桿菌milwaukee.wilactiferm糞鏈球菌ab.mediphara.swedentoyocorin芽孢桿菌toyo.joso.co.ltd.tokyoσmi-5乳酸菌、酵母菌、放線菌等japan米雅酪酸梭菌活菌片酪酸梭菌日本米雅利桑制藥株式會社1984年，我國大連醫(yī)學院康白等人首次用蠟樣芽孢桿菌研制成“促菌生”活菌制劑，截止目前，我國生產益生菌制劑企業(yè)已逾百家，每年市場消費量近百億元，并呈逐年上升趨勢，市場上應用較多益生菌制劑有大連醫(yī)學院研制的回春生(主要成分：雙歧桿菌)、沈陽第一制藥廠研制整腸生(主要成分：地衣芽孢桿菌)和重慶泰平藥業(yè)有限公司研制的酪酸梭菌活菌膠囊(主要成分：酪酸梭菌)等。益生菌制劑主要是根據(jù)微生態(tài)學原理，利用正常微生物菌種研究的制劑，可補充或充實微生物菌群，維持或調整微生態(tài)平衡，達到防病治病的目的。酪酸梭菌、雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌等都是常見的調節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡的菌種，能夠抑制腸道有害菌，消除腸道毒素，預防術后感染，提高機體免疫力，消除炎癥，恢復腸道菌群平衡，建立腸道生物屏障。國內外的益生菌制劑的工業(yè)發(fā)酵中，通常采用單一菌株純化發(fā)酵制成菌劑或由單一菌劑再復合而成，如專利cn102517238b公開了一種產酸蠟樣芽孢桿菌及其應用，該發(fā)明通過一級種子、二級種子、三級種子和發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得芽孢菌菌粉，并將芽孢桿菌菌粉單獨作為有效成分與玉米淀粉混合制成微生態(tài)制劑，或者產酸蠟樣芽孢桿菌菌粉與其它至少一種有效成分以及玉米淀粉混合制成復合微生態(tài)制劑，該方案工藝復雜，成本高，并且將多個單一菌種研制成復合益生菌制劑，其在腸道微環(huán)境中也存在協(xié)同作用不好，相容性差等問題。因此，由單一菌劑發(fā)酵轉向混菌發(fā)酵是國內外益生菌制劑的重要發(fā)展趨勢，但目前混菌發(fā)酵的細菌大多由專性厭氧菌組成，通常是由兩種或兩種以上的腸道菌種通過混合厭氧發(fā)酵而成。如cn102240303b公開了一種防治腸癌的復合益生菌的生產方法，通過將酪酸梭菌和嗜酸乳桿菌接入培養(yǎng)基，在35～40℃的條件下，厭氧混合培養(yǎng)24～48小時，制成防治腸癌的復合益生菌的菌液。這種混合厭氧發(fā)酵方式設備復雜，工藝繁瑣，必須嚴格控制厭氧環(huán)境，制備成本高。綜上，目前對益生菌制劑的研究過程中，缺乏將需氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵相結合的混合發(fā)酵方法制備的益生菌制劑，即使將多個單一菌種研制成復合益生菌制劑，其在腸道微環(huán)境中也存在協(xié)同作用不好，相容性差、成本高等問題，除此之外，益生菌制劑在口服時，容易受到胃酸和膽汁的作用，在達到起效部位腸道之前活菌數(shù)會大幅度下降，從而影響益生菌產品的療效或保健作用。技術實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種腸溶益生菌制劑，由互利共生關系的好氧菌和厭氧菌，通過先需氧發(fā)酵后厭氧發(fā)酵相結合的混合發(fā)酵方式制備而成，并優(yōu)化了發(fā)酵條件使得好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩種迥然不同的菌株在同一體發(fā)酵體系中完成。經過該方式制備的腸溶益生菌制劑發(fā)酵過程中共生融合，兼容性變優(yōu)。并且該益生菌制劑表面包被腸溶材料，使該制劑在胃酸和膽汁環(huán)境條件下不溶到腸液環(huán)境下才開始溶解，能夠達到對腸道靶向調節(jié)作用的目的。本發(fā)明提供一種腸溶益生菌制劑，具體的解決方案如下：一種腸溶益生菌制劑，其特征在于：該制劑是由互利共生關系的好氧菌和厭氧菌通過混合發(fā)酵制備而成；所述好氧菌和厭氧菌都是芽孢桿菌屬；所述好氧菌首先接種到發(fā)酵容器中，好氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期，關閉氧氣，所述好氧菌應激性地轉變成芽孢體，繼續(xù)微氧發(fā)酵，并在所述微氧發(fā)酵過程中，接種厭氧菌，使得所述好氧菌與所述厭氧菌融合共生，在厭氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)至所述厭氧菌對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期后期，得到發(fā)酵產物，將所述發(fā)酵產物經過離心分離、噴霧干燥、包被腸溶材料得到所述腸溶益生菌制劑；所述發(fā)酵產物中好氧菌數(shù)大于或者等于1.5×108cfu/ml，厭氧菌數(shù)大于或者等于1.2×108cfu/ml；所述腸溶益生菌制劑中有效菌數(shù)大于或者等于109cfu/g。進一步地，所述好氧菌是蠟樣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌或枯草芽孢桿，所述厭氧菌是酪酸梭菌。優(yōu)選地，所述好氧菌是蠟樣芽孢桿菌，所述厭氧菌是酪酸梭菌。蠟樣芽胞桿菌是常見的調節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡的菌種，可產生抗菌物質，抑制有害微生物的繁殖，改善人體和動物腸道微生態(tài)環(huán)境。酪酸梭菌是人體的正常腸道菌之一，是一種安全、有效、沒有毒副作用的益生菌，通過研究發(fā)現(xiàn)酪酸梭菌預防和治療腸道疾病的作用機制主要為以下幾個方面：①分泌酪酸，營養(yǎng)腸道，修復粘膜；②分泌酪酸，調控基因表達；③抑制腸道有害菌，消除腸道毒素，預防術后感染；④產生激肽酶，溶解癌組織；⑤提高機體免疫力；⑥消除炎癥；⑦恢復腸道菌群平衡，建立腸道生物屏障。優(yōu)選地，該腸溶益生菌制劑是包被腸溶材料的片劑、藥囊劑、顆粒劑、丸劑、栓劑、膠囊劑、散劑中的一種或多種。優(yōu)選的，所述腸溶材料是丙烯酸樹脂、鄰苯二甲酸醋酸纖維素、雙氯芬酸、蟲膠、聚乙烯醇乙酸苯二甲酸酯、1，2，4-苯三甲酸乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、1，2，4-苯三甲酸羥丙基甲基纖維素、琥珀酸乙酸纖維素、琥珀酸乙酸羥丙基甲基纖維素中的一種或多種。使該制劑在胃酸和膽汁環(huán)境條件下不溶到腸液環(huán)境下才開始溶解，能夠達到對腸道靶向調節(jié)作用的目的。本發(fā)明還提供了一種腸溶益生菌制劑的制備方法，包括如下步驟：(1)將所述好氧菌依次經過斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)后，接種到裝有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵容器中，在37±1℃溫度下通入無菌空氣，攪拌培養(yǎng)24-32h，得到處于對數(shù)生長期的好氧菌；(2)將所述厭氧菌依次經過斜面培養(yǎng)、厭氧瓶培養(yǎng)和種子罐厭氧培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中保持厭氧環(huán)境，厭氧培養(yǎng)得到種子罐厭氧種子；(3)在所述步驟(1)得到處于對數(shù)生長期的好氧菌后，關閉無菌空氣，所述好氧菌應激性地轉變成芽孢體，繼續(xù)微氧發(fā)酵4-8h，并在所述微氧發(fā)酵過程中，將步驟(2)得到的產物接種到所述發(fā)酵容器中，使得所述好氧菌與所述厭氧菌融合共生18-32h,培養(yǎng)至所述厭氧菌對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期后期，得到發(fā)酵產物；(4)將步驟(3)獲得混合發(fā)酵產物經過離心分離、噴霧干燥、包被腸溶材料，制得所述的腸溶益生菌制劑。優(yōu)選地，所述步驟(1)攪拌培養(yǎng)是指以100-130r/min攪拌培養(yǎng)，通入無菌空氣體積與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比1:0.5-0.6。優(yōu)選地，所述好氧菌的接種量為所述發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的6～15％，所述厭氧菌的接種量為所述發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的10～20％。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分為：每100g水中含豆餅粉3％、玉米粉3％、麩皮1％、葡萄糖1％、胰蛋白胨1％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、氯化鈉0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、磷酸二氫鉀0.015％、硫酸亞鐵0.1％、硫酸錳0.02％、碳酸鈣0.1％、tween.800.02％，所述百分數(shù)都是質量百分數(shù)。本發(fā)明還提供了一種腸溶益生菌制劑的制備方法所得腸溶益生菌制劑在人或畜腸道疾病的治療藥物、保健食品或者飼料添加劑中的應用。本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明提供的腸溶益生菌制劑，由互利共生關系的好氧菌和厭氧菌，通過先好氧發(fā)酵后厭氧發(fā)酵相結合的混合發(fā)酵方式制備而成，工藝簡單，便于實現(xiàn)大規(guī)模生產。(2)本發(fā)明巧妙的利用了好氧和厭氧菌株對氧氣生理需求的不同，而將其相互銜接地整合在同一發(fā)酵中，并優(yōu)化了發(fā)酵條件使得好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩種迥然不同的菌株在同一體發(fā)酵體系中完成，不僅節(jié)約了發(fā)酵資源如發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵容器等，而且提高了設備利用率，縮短了整個生產工藝時間，使制備成本至少減低一半。(3)本發(fā)明提供的好氧菌和厭氧菌在混合發(fā)酵過程中已經進行了前期融合共生，互補不拮抗，兼容性變優(yōu)，有利于益生菌制劑在同一環(huán)境中相互協(xié)調的發(fā)揮作用，從而起到調節(jié)人體或動物腸道微生態(tài)平衡、抑制腸道有害菌、消除腸道毒素、提高機體免疫力、恢復腸道菌群平衡和建立腸道生物屏障的作用。(4)本發(fā)明提供的腸溶益生菌制劑能夠以片劑、藥囊劑、顆粒劑、丸劑、栓劑、膠囊劑等多種狀態(tài)存在，形態(tài)多樣，便于攜帶，食用方便。(5)本發(fā)明提供的腸溶益生菌制劑表面包被腸溶材料，使該制劑在胃酸和膽汁環(huán)境條件下不溶到腸液環(huán)境下才開始溶解，能夠達到對腸道的靶向調節(jié)作用。下面通過附圖對本發(fā)明做進一步說明。附圖說明圖1是本發(fā)明提供的一種腸溶益生菌制劑的制備工藝流程示意圖。具體實施方式以下通過特定的具體實施說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。實施例1本實施例提供一種腸溶益生菌制劑，該制劑是由互利共生關系的好氧菌蠟樣芽孢桿菌和厭氧菌酪酸梭菌通過混合發(fā)酵制備而成。為使蠟樣芽孢桿菌和酪酸梭菌在同一體系中相互協(xié)調的發(fā)揮作用，兩種菌混合前、混合中、混合后的生長狀態(tài)以及混合時的接種量非常重要。本實施例提供的腸溶益生菌制劑的制備方法，其工藝流程示意圖如圖1所示，具體步驟如下：1、得到處于對數(shù)生長期的蠟樣芽孢桿菌。①斜面培養(yǎng)：將保存的蠟樣芽孢桿菌菌種(cgmccno.8614)轉接到斜面培養(yǎng)基，在保證無菌條件下，用接種環(huán)接種平皿中，37℃培養(yǎng)24h。重復轉接三代斜面，每代斜面菌種培養(yǎng)完成后，染色，用顯微鏡觀察蠟樣芽孢桿菌生長情況，選擇無雜菌且生長優(yōu)良的菌種備用。所述斜面培養(yǎng)基是pda培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0g，20.0g，瓊脂20.0g，水1.0l，自然ph值。②搖瓶培養(yǎng)：斜面接種，500ml三角瓶裝量100ml，37℃，200r/min搖床培養(yǎng)16～24h，接入種子罐擴大培養(yǎng)。③種子罐培養(yǎng)：5l三角瓶裝量1l，接種量6％(v/v)，37℃，200r/min搖床培養(yǎng)18～24h。所述搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母浸出物3.0g，nacl5.0g，水1.0l，自然ph值。蠟樣芽孢桿菌依次經過上述斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)后，接種到裝有150l滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250l攪拌式發(fā)酵罐中，蠟樣芽孢桿菌的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的6～15％，在37±1℃溫度下通入無菌空氣，以100-130r/min攪拌培養(yǎng)24-32h，通入無菌空氣體積與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比1：0.5-0.6，得到處于對數(shù)生長期的蠟樣芽孢桿菌。所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：每100g水中含豆餅粉3％、玉米粉3％、麩皮1％、葡萄糖1％、胰蛋白胨1％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、氯化鈉0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、磷酸二氫鉀0.015％、硫酸亞鐵0.1％、硫酸錳0.02％、碳酸鈣0.1％、tween.800.02％，所述百分數(shù)都是質量百分數(shù)。(2)得到酪酸梭菌種子罐厭氧培養(yǎng)種子①斜面培養(yǎng)：將保存的酪酸梭菌菌種(ciccno.10390)轉接到斜面培養(yǎng)基，在保證厭氧條件下，采用無菌操作的方式，用接種環(huán)接種斜面，于37℃在厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，用顯微鏡觀察蠟樣芽孢桿菌生長情況，選擇無雜菌且生長優(yōu)良的菌種備用。所述斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，瓊脂20.0g，水1.0l，ph＝7.2±0.2。②搖瓶培養(yǎng)：用無菌吸管吸取1ml菌懸浮液接種到裝有50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于37℃在厭氧培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)24h，并每隔5h搖晃混勻，轉接裝到450ml培養(yǎng)基2500ml三角瓶中，37℃恒溫靜止培養(yǎng)24h，并每隔5h搖晃混勻。③種子罐厭氧培養(yǎng)：厭氧瓶種子鏡檢無雜菌后再轉接于裝有4.5l培養(yǎng)基的種子罐中，無菌氮氣和培養(yǎng)基的體積比是1:1，厭氧培養(yǎng)24h。上述搖瓶培養(yǎng)和種子罐厭氧培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基：肉汁10.0g，蛋白胨3.0g，酵母抽提物3.0g，nacl5.0g，葡萄糖5.0g，淀粉3.0g，naac3.0g，l-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，水1.0l，ph＝6.8±0.2。將酪酸梭菌依次經過上述斜面培養(yǎng)、厭氧瓶培養(yǎng)和種子罐厭氧培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中通入無菌氮氣來保持厭氧環(huán)境，厭氧培養(yǎng)得到種子罐厭氧培養(yǎng)種子。(3)在所述步驟(1)得到處于對數(shù)生長期的蠟樣芽孢桿菌后，關閉無菌空氣，所述蠟樣芽孢桿菌應激性地轉變成芽孢體，繼續(xù)微氧發(fā)酵4-8h，并在所述微氧發(fā)酵過程中，將步驟(2)得到的產物接種到所述發(fā)酵容器中，所述厭氧菌的接種量為所述發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的10～20％。使得所述蠟樣芽孢桿菌與所述酪酸梭菌融合共生18-32h,培養(yǎng)至所述酪酸梭菌對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期后期，得到發(fā)酵產物。(4)將步驟(3)獲得混合發(fā)酵產物經過離心分離、噴霧干燥、包被腸溶材料，制得所述的腸溶益生菌制劑。本實施例采用平板計數(shù)法測定的發(fā)酵產物中蠟樣芽孢桿菌數(shù)大于或者等于1.5×108cfu/ml，酪酸梭菌數(shù)大于或者等于1.2×108cfu/ml；所得腸溶益生菌制劑中有效菌數(shù)大于或者等于109cfu/g。本實施例1中的腸溶益生菌制劑是包被丙烯酸樹脂的膠囊劑，同時，該腸溶材料還可以是鄰苯二甲酸醋酸纖維素、雙氯芬酸、蟲膠、聚乙烯醇乙酸苯二甲酸酯、1，2，4-苯三甲酸乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、1，2，4-苯三甲酸羥丙基甲基纖維素、琥珀酸乙酸纖維素、琥珀酸乙酸羥丙基甲基纖維素中的一種或多種；該制劑的形態(tài)也可以是片劑、藥囊劑、顆粒劑、丸劑、栓劑、散劑的一種或多種。同時，除實施例1提到的培養(yǎng)基外，其他任何適用于蠟樣芽胞桿菌和酪酸梭菌生長的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基均可適用于本實施例1腸溶益生菌制劑的制備。實施例1提供的腸溶益生菌制劑，由互利共生關系的好氧菌和厭氧菌，通過先需氧發(fā)酵后厭氧發(fā)酵相結合的混合發(fā)酵方式制備而成，工藝簡單，便于實現(xiàn)大規(guī)模生產；本實施例巧妙的利用了好氧菌和厭氧菌對氧氣生理需求的不同，而將其相互銜接地整合在同一發(fā)酵中，并優(yōu)化了發(fā)酵條件使得好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩種迥然不同的菌株在同一體發(fā)酵體系中完成，不僅節(jié)約了發(fā)酵資源如發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵容器等，而且提高了設備利用率，縮短了整個生產工藝時間，使制備成本至少減低一半；本實施例提供的好氧菌和厭氧菌在混合發(fā)酵過程中已經進行了前期融合共生，互補不拮抗，兼容性變優(yōu)，有利于益生菌制劑在同一環(huán)境中相互協(xié)調的發(fā)揮作用，從而起到調節(jié)人體或動物腸道微生態(tài)平衡、抑制腸道有害菌、消除腸道毒素、提高機體免疫力、恢復腸道菌群平衡和建立腸道生物屏障的作用；本實施例提供的腸溶益生菌制劑能夠以片劑、藥囊劑、顆粒劑、丸劑、栓劑、膠囊劑等多種狀態(tài)存在，形態(tài)多樣，便于攜帶，食用方便；本實施例提供的腸溶益生菌制劑表面包被腸溶材料，使該制劑在胃酸和膽汁環(huán)境條件下不溶到腸液環(huán)境下才開始溶解，能夠達到對腸道的靶向調節(jié)作用。實施例2本實施例提供一種腸溶益生菌制劑，該制劑是由互利共生關系的好氧菌凝結芽孢桿菌和厭氧菌酪酸梭菌通過混合發(fā)酵制備而成。為使凝結芽孢桿菌和酪酸梭菌在同一體系中相互協(xié)調的發(fā)揮作用，兩種菌混合前、混合中、混合后的生長狀態(tài)以及混合時的接種量非常重要。本實施例提供的腸溶益生菌制劑的制備方法，其工藝流程示意圖如圖1所示，具體步驟如下：1、得到處于對數(shù)生長期的凝結芽孢桿菌。①斜面培養(yǎng)：將保存的凝結芽孢桿菌菌種(ciccno.21736)轉接到斜面培養(yǎng)基，在保證無菌條件下，在營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，于37℃下培養(yǎng)20h。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，nacl5.0g，瓊脂15.0g，水1.0l，ph7.0。②搖瓶培養(yǎng)：取一環(huán)斜面接入裝有25mlmrs培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，40℃，140r/min培養(yǎng)20h，成為一級種子液，以5％接種量將一級種子液接入裝有120mlmrs培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，40℃，180r/min培養(yǎng)18h。所述mrs培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，吐溫-801ml，檸檬酸三銨2.0g，k2hpo42.0g，葡萄糖20.0g，乙酸鈉5.0g，mgso4·7h2o0.1g，mnso40.05g，水1.0l，ph7.0。③種子罐培養(yǎng)：以5％接種量接入裝有3.5l培養(yǎng)基的5l自動發(fā)酵罐中，設定裝液量為70％，起始攪拌轉速為100r/min，通氣量為1：1，此時定溶氧為100％；當溶氧降至30％以下時，提高轉速以控制溶氧在30％以上，溫度40℃培養(yǎng)48h。種子罐培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基：豆餅粉10.0g，玉米漿粉10.0g，葡萄糖6.0g，mgso4·7h2o1.0g，k2hpo41.0g，mnso450ppm，水1.0l，ph7.0。凝結芽孢桿菌依次經過上述斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)后，接種到裝有150l滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250l攪拌式發(fā)酵罐中，凝結芽孢桿菌的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的6～15％，在37±1℃溫度下通入無菌空氣，以100-130r/min攪拌培養(yǎng)24-32h，通入無菌空氣體積與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比1：0.5-0.6，得到處于對數(shù)生長期的凝結芽孢桿菌。所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：每100g水中含豆餅粉3％、玉米粉3％、麩皮1％、葡萄糖1％、胰蛋白胨1％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、氯化鈉0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、磷酸二氫鉀0.015％、硫酸亞鐵0.1％、硫酸錳0.02％、碳酸鈣0.1％、tween.800.02％，所述百分數(shù)都是質量百分數(shù)。(2)得到酪酸梭菌種子罐厭氧培養(yǎng)種子；步驟與實施例1提供的腸溶益生菌制劑的制備方法步驟(2)相同。(3)在所述步驟(1)得到處于對數(shù)生長期的凝結芽孢桿菌后，關閉無菌空氣，所述凝結芽孢桿菌應激性地轉變成芽孢體，繼續(xù)微氧發(fā)酵4-8h，并在所述微氧發(fā)酵過程中，將步驟(2)得到的產物接種到所述發(fā)酵容器中，所述厭氧菌的接種量為所述發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的10～20％，使得所述凝結芽孢桿菌與所述酪酸梭菌融合共生18-32h,培養(yǎng)至所述酪酸梭菌對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期后期，得到發(fā)酵產物。(4)將步驟(3)獲得混合發(fā)酵產物經過離心分離、噴霧干燥、包被腸溶材料，制得所述的腸溶益生菌制劑。本實施例采用平板計數(shù)法測定的發(fā)酵產物中凝結芽孢桿菌數(shù)大于或者等于1.5×108cfu/ml，酪酸梭菌數(shù)大于或者等于1.2×108cfu/ml；所得腸溶益生菌制劑中有效菌數(shù)大于或者等于109cfu/g。本實施例2中的腸溶益生菌制劑是包被蟲膠的丸劑，同時，該腸溶材料還可以是鄰苯二甲酸醋酸纖維素、雙氯芬酸、丙烯酸樹脂、聚乙烯醇乙酸苯二甲酸酯、1，2，4-苯三甲酸乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、1，2，4-苯三甲酸羥丙基甲基纖維素、琥珀酸乙酸纖維素、琥珀酸乙酸羥丙基甲基纖維素中的一種或多種；該制劑的形態(tài)也可以是片劑、藥囊劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、散劑的一種或多種。同時，除實施例2提到的培養(yǎng)基外，其他任何適用于蠟樣芽胞桿菌和酪酸梭菌生長的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基均可適用于本實施例2腸溶益生菌制劑的制備。實施例2提供的腸溶益生菌制劑，由互利共生關系的好氧菌和厭氧菌，通過先需氧發(fā)酵后厭氧發(fā)酵相結合的混合發(fā)酵方式制備而成，工藝簡單，便于實現(xiàn)大規(guī)模生產；本實施例巧妙的利用了好氧菌和厭氧菌對氧氣生理需求的不同，而將其相互銜接地整合在同一發(fā)酵中，并優(yōu)化了發(fā)酵條件使得好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩種迥然不同的菌株在同一體發(fā)酵體系中完成，不僅節(jié)約了發(fā)酵資源如發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵容器等，而且提高了設備利用率，縮短了整個生產工藝時間，使制備成本至少減低一半；本實施例提供的好氧菌和厭氧菌在混合發(fā)酵過程中已經進行了前期融合共生，互補不拮抗，兼容性變優(yōu)，有利于益生菌制劑在同一環(huán)境中相互協(xié)調的發(fā)揮作用，從而起到調節(jié)人體或動物腸道微生態(tài)平衡、抑制腸道有害菌、消除腸道毒素、提高機體免疫力、恢復腸道菌群平衡和建立腸道生物屏障的作用；本實施例提供的腸溶益生菌制劑能夠以片劑、藥囊劑、顆粒劑、丸劑、栓劑、膠囊劑等多種狀態(tài)存在，形態(tài)多樣，便于攜帶，食用方便；本實施例提供的腸溶益生菌制劑表面包被腸溶材料，使該制劑在胃酸和膽汁環(huán)境條件下不溶到腸液環(huán)境下才開始溶解，能夠達到對腸道的靶向調節(jié)作用。實施例3本實施例提供一種腸溶益生菌制劑，該制劑是由互利共生關系的好氧菌枯草芽孢桿菌和厭氧菌酪酸梭菌通過混合發(fā)酵制備而成。為使枯草芽孢桿菌和酪酸梭菌在同一體系中相互協(xié)調的發(fā)揮作用，兩種菌混合前、混合中、混合后的生長狀態(tài)以及混合時的接種量非常重要。本實施例提供的腸溶益生菌制劑的制備方法，其工藝流程示意圖如圖1所示，具體步驟如下：1、得到處于對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌。①斜面培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌接種(ciccno.10732)在斜面培養(yǎng)基上進行斜面培養(yǎng)，控制斜面培養(yǎng)基ph6.8-7.2，控制溫度為36～38℃，培養(yǎng)24～48h。斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖5.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂20.0g，水1.0l，自然ph值。②搖瓶培養(yǎng)：斜面培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌接種于培養(yǎng)基上，控制ph6.8-7.2，控制溫度為36～38℃，180r/min搖床培養(yǎng)10～16h。搖瓶培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g，，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖5.0g，氯化鈉10.0g，水1.0l，自然ph值。③種子罐培養(yǎng)：將經搖瓶種子培養(yǎng)的種子液接種于培養(yǎng)基上，在35～38℃、轉速為200r/min、ph值控制在6.0-6.5之間培養(yǎng)6-8h，其后控制在7.0-7.4培養(yǎng)18h。種子罐培養(yǎng)所用培養(yǎng)基：豆粕30.0g，玉米粉10.0g，酵母粉0.2g，磷酸二氫鉀1.5g，磷酸氫二鉀3.0g，硫酸鎂0.5gl，硫酸亞鐵0.1g，碳酸鈣0.1g，硫酸錳0.2g，氯化鈉5.0g，水1.0l，ph為7.0。枯草芽孢桿菌依次經過上述斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)后，接種到裝有150l滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的250l攪拌式發(fā)酵罐中，枯草芽孢桿菌的接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的6～15％，在37±1℃溫度下通入無菌空氣，以100-130r/min攪拌培養(yǎng)24-32h，通入無菌空氣體積與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比1：0.5-0.6。得到處于對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌。所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：每100g水中含豆餅粉3％、玉米粉3％、麩皮1％、葡萄糖1％、胰蛋白胨1％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％、氯化鈉0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、磷酸二氫鉀0.015％、硫酸亞鐵0.1％、硫酸錳0.02％、碳酸鈣0.1％、tween.800.02％，所述百分數(shù)都是質量百分數(shù)。(2)得到酪酸梭菌種子罐厭氧培養(yǎng)種子；該步驟與實施例1提供的腸溶益生菌制劑的制備方法步驟(2)相同。(3)在所述步驟(1)得到處于對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌后，關閉無菌空氣，所述枯草芽孢桿菌應激性地轉變成芽孢體，繼續(xù)微氧發(fā)酵4-8h，并在所述微氧發(fā)酵過程中，將步驟(2)得到的產物接種到所述發(fā)酵容器中，所述厭氧菌的接種量為所述發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的10～20％，使得所述枯草芽孢桿菌與所述酪酸梭菌融合共生18-32h，培養(yǎng)至所述酪酸梭菌對數(shù)生長期后期或穩(wěn)定期后期，得到發(fā)酵產物。(4)將步驟(3)獲得混合發(fā)酵產物經過離心分離、噴霧干燥、包被腸溶材料，制得所述的腸溶益生菌制劑。本實施例采用平板計數(shù)法測定的發(fā)酵產物中枯草芽孢桿菌數(shù)大于或者等于1.5×108cfu/ml，酪酸梭菌數(shù)大于或者等于1.2×108cfu/ml；所得腸溶益生菌制劑中有效菌數(shù)大于或者等于109cfu/g。本實施例3的腸溶益生菌制劑是包被鄰苯二甲酸醋酸纖維素的片劑，同時，該腸溶材料還可以是丙烯酸樹脂、雙氯芬酸、蟲膠、聚乙烯醇乙酸苯二甲酸酯、1，2，4-苯三甲酸乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、1，2，4-苯三甲酸羥丙基甲基纖維素、琥珀酸乙酸纖維素、琥珀酸乙酸羥丙基甲基纖維素中的一種或多種；該制劑的形態(tài)也可以是膠囊劑、藥囊劑、顆粒劑、丸劑、栓劑、散劑的一種或多種。同時，除實施例3到的培養(yǎng)基外，其他任何適用于蠟樣芽胞桿菌和酪酸梭菌生長的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基均可適用于本實施例3腸溶益生菌制劑的制備。實施例3供的腸溶益生菌制劑，由互利共生關系的好氧菌和厭氧菌，通過先需氧發(fā)酵后厭氧發(fā)酵相結合的混合發(fā)酵方式制備而成，工藝簡單，便于實現(xiàn)大規(guī)模生產；本實施例巧妙的利用了好氧菌和厭氧菌對氧氣生理需求的不同，而將其相互銜接地整合在同一發(fā)酵中，并優(yōu)化了發(fā)酵條件使得好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩種迥然不同的菌株在同一體發(fā)酵體系中完成，不僅節(jié)約了發(fā)酵資源如發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵容器等，而且提高了設備利用率，縮短了整個生產工藝時間，使制備成本至少減低一半；本實施例提供的好氧菌和厭氧菌在混合發(fā)酵過程中已經進行了前期融合共生，互補不拮抗，兼容性變優(yōu)，有利于益生菌制劑在同一環(huán)境中相互協(xié)調的發(fā)揮作用，從而起到調節(jié)人體或動物腸道微生態(tài)平衡、抑制腸道有害菌、消除腸道毒素、提高機體免疫力、恢復腸道菌群平衡和建立腸道生物屏障的作用；本實施例提供的腸溶益生菌制劑能夠以片劑、藥囊劑、顆粒劑、丸劑、栓劑、膠囊劑等多種狀態(tài)存在，形態(tài)多樣，便于攜帶，食用方便；本實施例提供的腸溶益生菌制劑表面包被腸溶材料，使該制劑在胃酸和膽汁環(huán)境條件下不溶到腸液環(huán)境下才開始溶解，能夠達到對腸道的靶向調節(jié)作用。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，上述實施例僅示例性說明本發(fā)明的原理及其功效，而并非對本發(fā)明任何形式上和實質上的限制。應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當可利用以上所揭示的技術內容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明得到實質技術對上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術方案的范圍內。當前第1頁12