用于檢測RhDmRNA剪接體的PCR引物組合、試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法與流程

本發(fā)明涉及一種用于檢測rhdmrna剪接體的pcr引物組合，同時(shí)還涉及包含該引物組合的試劑盒及rhdmrna剪接體實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法，屬于生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：rh基因的復(fù)雜性直接體現(xiàn)在rhd抗原表達(dá)的多態(tài)性，這被認(rèn)為是不僅與rhdmrna水平上的異質(zhì)性有關(guān)還與相關(guān)基因外顯子的缺失、數(shù)量表達(dá)等相關(guān)。同時(shí)levankim等還發(fā)現(xiàn)：rhce基因存在選擇性剪接而形成不同形式的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[1]，同樣的有研究者發(fā)現(xiàn)在正常的d抗原陽性的個(gè)體中存在第7外顯子至第9外顯子的多種復(fù)雜的選擇性剪接[2]，該剪接體的多態(tài)性決定rhd基因表達(dá)d抗原的特性。血型基因的遺傳背景有明顯的種族間差異，是因?yàn)椴煌朔N的rhdmrna基因出現(xiàn)選擇性多樣剪接出現(xiàn)rhd亞型所造成[3]。mrna即messengerrna信使rna是由dna經(jīng)由轉(zhuǎn)錄而來，帶著相應(yīng)的遺傳訊息，為下一步轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)提供所需的訊息。基于rhd基因的多態(tài)性，本文建立實(shí)時(shí)熒光定量的方法對不同個(gè)體的rhdmrna剪接體檢測，通過監(jiān)測rhdmrna表達(dá)的多態(tài)性了解不同個(gè)體rhd基因的差異。實(shí)時(shí)熒光定量pcr(real-timequantitativepcr)/qrt-pcr，是指在pcr反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物，利用熒光信號的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)pcr過程，通過擴(kuò)增曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。[1]levankc,mouroi,cherif-zaharb,etal.molecularcloningandprimarystructureofthehumanbloodgrouprhdpolypeptideproenatl.acadseiusa,1992,89(22):10925-10929.[2]邵超鵬，熊文,等.替代剪切形成多種形式的rhdmrna.中國輸血雜志，2004，17(5)：310-314.[3]levankc，cherif-zaharb，raynalv，etal.multiplerhmessengerrnaisoformsareproducedbyalternativesplicing.blood,1992,80(4):1074-1078.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測rhdmrna剪接體的pcr引物組合、試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種用于檢測rhdmrna剪接體的pcr引物組合，包括以下三對引物的至少一對：(1)用于擴(kuò)增全長rhdmrna剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：上游引物：5'-cccacagctccatcatggg-3'(seqidno:1)，下游引物：5'-gccaatcatgccattgccggc-3'(seqidno:2)；(2)用于擴(kuò)增缺失exon-7的rhdmrna剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:3)下游引物：5'-tggaagccaatccggcaggt-3'(seqidno:4)；(3)用于擴(kuò)增缺失exon-7,8,9的rhdmrna剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:5)下游引物：5'-caaatgaggaaacggcaggt-3'(seqidno:6)。優(yōu)選地，優(yōu)選地，所述引物組合物中各引物的濃度為5pmol/l。一種檢測rhdmrna剪接體的試劑盒，包括所述的pcr引物組合物。優(yōu)選地，所述的用于檢測rhdmrna剪接體的試劑盒還包括pcr級h2o，mastermix。一種用于檢測rhdmrna剪接體的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測方法，包括如下步驟：(3)配制若干個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品；(4)配制pcr反應(yīng)液，包括上述pcr引物組合物；(3)pcr擴(kuò)增：將上述pcr反應(yīng)液與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品分別混合進(jìn)行pcr擴(kuò)增；(4)利用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品得到的數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的濃度。優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述標(biāo)準(zhǔn)品為選自以下至少一種所示的核苷酸序列：全長標(biāo)準(zhǔn)品：5'-cccacagctccatcatgggctacaacttcagcttgctgggtctgcttggagagatcatctacattgtgctgctggtgcttgataccgtcggagccggcaatggcatgattggc-3'(seqidno:7)缺失exon-7標(biāo)準(zhǔn)品：5'-tggctgggctgatctccgtcgggggagccaagtacctgccggattggcttcca-3'(seqidno:8)缺失exon-7,8,9標(biāo)準(zhǔn)品：5'-tggctgggctgatctccgtcgggggagccaagtacctgccgtttcctcatttg-3'(seqidno:9)。優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述若干為選自6、8、10、12、16中的一種。優(yōu)選地，所述步驟(1)，所述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品相鄰濃度之間的梯度為1個(gè)數(shù)量級，即濃度相差10倍。優(yōu)選的，所述步驟(2)中，所述pcr反應(yīng)液中還包括pcr級h2o，mastermix。優(yōu)選的，所述步驟(3)中，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min；96℃變性10s，60℃復(fù)性3s，72℃延伸3秒，循環(huán)35次，72℃再延伸10s。優(yōu)選地，所述步驟(5)中，所述計(jì)算是利用2ndderivativemax計(jì)算法進(jìn)行的。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：本發(fā)明針對rhdmrna剪接體序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物組合，該引物的特異性強(qiáng)，不受其他非目的基因干擾，能快速、高效、準(zhǔn)確地對rhdmrna剪接體進(jìn)行定量。本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法對rhdmrna剪接體進(jìn)行定量檢測，方法簡單、精確，無管道內(nèi)污染，無需凝膠電泳，此方法可以準(zhǔn)確定量不同個(gè)體rhdmrna剪接體的拷貝數(shù)。結(jié)果重現(xiàn)性好，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，可用于高通量的樣品檢測。附圖說明圖1顯示了全血提取高質(zhì)量、高純度的mrna電泳圖。圖2rhdmrna剪接體實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)監(jiān)控。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例及試驗(yàn)例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1檢測rhdmrna剪接體的pcr引物組合物的制備方法，引物組合物包含下面3對引物中的至少一對：用于擴(kuò)增全長rhdmrna剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：上游引物：5'-cccacagctccatcatggg-3'(seqidno:1)，下游引物：5'-gccaatcatgccattgccggc-3'(seqidno:2)；用于擴(kuò)增缺失exon-7的rhdmrna剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:3)下游引物：5'-tggaagccaatccggcaggt-3'(seqidno:4)；以及用于擴(kuò)增缺失exon-7,8,9的rhdmrna剪接體的1對共2條引物，2條引物的序列分別為：上游引物：5'-tggctgggctgatctccg-3'(seqidno:5)下游引物：5'-caaatgaggaaacggcaggt-3'(seqidno:6)。將上、下游引物等體積混合后，即得到引物組合物。優(yōu)選地，所述引物組合物中各引物的濃度為5pmol/l。實(shí)施例21材料與方法1.1劑與儀器mrna提取試劑盒：levsimplyrnabloodkit(由promega公司生產(chǎn))；cdna反轉(zhuǎn)錄試劑盒：transcriptorhighfidelitycdnasynthesiskit(由roche公司生產(chǎn))；實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增儀：software由德國羅氏診斷有限公司提供。rhdmrna剪接體pcr擴(kuò)增引物由takara公司合成。1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1.2.1人工合成ssdna作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、rhdmrna各剪接體標(biāo)準(zhǔn)品及引物序列見表1。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：以雙蒸水溶解標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度為50ng/ul。稀釋至10個(gè)拷貝數(shù)的濃度，每次遞減1個(gè)數(shù)量級，共12個(gè)梯度：取12支0.5ml的pcr管，從第2管開始(第一管為原液管)每管加入雙蒸水90ul，做好標(biāo)記1，2，3…..，12，在第2支稀釋管中加入10ul的50ng/ul的ssdna文庫，懸渦混勻后吸出10ul加到第3管，依次操作，直至稀釋到最后一管。最后一管的梯度稀釋液去掉。1.3pcr擴(kuò)增操作：1.3.1提取mrna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，并以cdna為檢測樣品。1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品：使用各自的標(biāo)準(zhǔn)品(表1)，并設(shè)置3復(fù)孔。1.3.3引物：所用引物為實(shí)施例1中所述三對引物中的上游下游引物分別混合得到的三種引物組合物。1.3.4qpcr加樣體系操作：見表2。1.3.5體系擴(kuò)增條件見表3。表1rhdmrna各剪接體cdna實(shí)時(shí)熒光定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)品及序列表2rhdmrna各剪接體cdna的pcr加樣體系試劑成分體積(μl)pcr級h2o8.5引物組合物(5pmol/l)0.5mastermix10標(biāo)準(zhǔn)品(或cdna)1反應(yīng)總體積20表3rhdmrna剪接體cdna共用pcr擴(kuò)增條件第一步第二步(35循環(huán))第三步95℃10min96℃10s72℃10s65℃3s4℃∝68℃3s每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或樣品cdna均檢測3個(gè)復(fù)孔，最終取各孔讀數(shù)的和取平均數(shù)作為檢測的結(jié)果。1.3.6rhdmrna各剪接體擴(kuò)增效率全長序列的擴(kuò)增效率：1.978，線性范圍：104～109缺失exon7序列的擴(kuò)增效率：1.951，線性范圍：103～108缺失exon7/8/9序列的擴(kuò)增效率：1.878，線性范圍：104～1091.3.7rhdmrna的cdna定量計(jì)算方法：2ndderivativemax計(jì)算法。2結(jié)果2.1rhdmrna提取需達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)：a260/a280的比值范圍：1.8～2.1之間。mrna濃度>0.8μg/μl，從全血中提取mrna電泳如圖1所示。2.2實(shí)時(shí)監(jiān)測每一個(gè)pcr擴(kuò)增循環(huán)中的實(shí)時(shí)熒光信號，實(shí)時(shí)熒光信號代表擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，拷貝數(shù)的積累與rhdmrna剪接體含量成正比，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的定量結(jié)果如表4所示。表4利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行定量標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求達(dá)到：error<0.02；efficiency：1.9～2.1之間；線性范圍：103～109之間。標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在以上可控范圍內(nèi)，實(shí)測樣品的數(shù)據(jù)為有效數(shù)據(jù)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。sequencelisting<110>深圳市血液中心<120>用于檢測rhdmrna剪接體的pcr引物組合、試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法<130>kh17-1-436<160>9<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>whole-f<400>1cccacagctccatcatggg19<210>2<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>whole-r<400>2gccaatcatgccattgccggc21<210>3<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7-f<400>3tggctgggctgatctccg18<210>4<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7-r<400>4tggaagccaatccggcaggt20<210>5<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7,8,9-f<400>5tggctgggctgatctccg18<210>6<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7,8,9-r<400>6caaatgaggaaacggcaggt20<210>7<211>113<212>dna<213>artificialsequence<220><223>whole<400>7cccacagctccatcatgggctacaacttcagcttgctgggtctgcttggagagatcatct60acattgtgctgctggtgcttgataccgtcggagccggcaatggcatgattggc113<210>8<211>53<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7<400>8tggctgggctgatctccgtcgggggagccaagtacctgccggattggcttcca53<210>9<211>53<212>dna<213>artificialsequence<220><223>exon-7,8,9<400>9tggctgggctgatctccgtcgggggagccaagtacctgccgtttcctcatttg53當(dāng)前第1頁12