一種測(cè)定黑果枸杞花粉活力的方法與流程

技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物花粉活力的測(cè)定方法，特別涉及一種茄科枸杞屬植物黑果枸杞花粉活力的方法。
背景技術(shù)：
：：黑果枸杞(lyciumruthenicum)為茄科枸杞屬多棘刺灌木，在我國(guó)西北荒漠區(qū)廣泛分布，在干旱荒漠區(qū)風(fēng)沙治理、鹽漬化治理中發(fā)揮著極為重要的作用。黑果枸杞果實(shí)富含蛋白質(zhì)、枸杞多糖等多種營(yíng)養(yǎng)成分，藥用價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通紅枸杞，被譽(yù)為植物“軟黃金”。在長(zhǎng)期自然選擇和不同生態(tài)環(huán)境作用下,該植物天然群體內(nèi)存在著極為豐富的表型變異,其中有些變異具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為了更好的利用黑果枸杞,發(fā)掘其優(yōu)良類(lèi)型潛力,選育黑果枸杞優(yōu)良品種,對(duì)提高種植效益和荒漠化治理有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。在植物常規(guī)育種中，花粉活力測(cè)定是必不可少的基礎(chǔ)性工作。測(cè)定花粉活力主要有三類(lèi)方法：花粉染色法、田間授粉法和花粉離體培養(yǎng)法?；ǚ廴旧焖佟⒎椒ê?jiǎn)單，但被染色的花粉未必萌發(fā)，不一定會(huì)升出花粉管，因此，染色法測(cè)定的花粉活力往往偏高，結(jié)果不可靠；田間授粉法是在田間進(jìn)行的雜交育種實(shí)驗(yàn)，該方法可靠、直接，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且受環(huán)境影響較大，難以滿(mǎn)足生產(chǎn)需要；花粉離體培養(yǎng)法快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度也高。當(dāng)前有關(guān)黑果枸杞花粉活力測(cè)定的研究主要集中在花粉染色法，而離體培養(yǎng)法未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。申請(qǐng)人通過(guò)離體培養(yǎng)法，篩選測(cè)定黑果枸杞花粉活力的最佳培養(yǎng)基，為黑果枸杞育種工作提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明提供一種測(cè)定黑果枸杞花粉活力的方法，所述方法包括以下步驟：步驟1，收集黑果枸杞花粉；步驟2，將黑果枸杞花粉置于盛有培養(yǎng)液的凹面載玻片上進(jìn)行離體培養(yǎng)；步驟3，離體培養(yǎng)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)數(shù)；其中，步驟1所述收集黑果枸杞花粉，方法如下：剪取已全面開(kāi)放的新鮮花枝，帶回實(shí)驗(yàn)室自然陰干。其中，步驟2所述離體培養(yǎng)，方法如下：取凹面載玻片，用滴管吸取配制好的培養(yǎng)基2～3滴，滴于凹面載玻片上，用毛筆蘸取少量陰干的花粉播于凹面載玻片上。取已滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿，底部墊上濕潤(rùn)的濾紙，將凹面載玻片放到盛有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)。其中，步驟3所述統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)數(shù)，方法如下：培養(yǎng)后，將凹面載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。步驟2所述培養(yǎng)基的組成為：蔗糖120～210g/l，硼酸10～40mg/l，氯化鈣5-20mg/l；培養(yǎng)基的配制方法如下：取蔗糖、硼酸、氯化鈣混合均勻，配制成上述不同濃度的液體培養(yǎng)基。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的組成為：蔗糖170-190g/l，硼酸15～25mg/l，氯化鈣5-15mg/l；最優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的組成為：蔗糖180g/l，硼酸20mg/l，氯化鈣10mg/l；步驟2中，所述離體培養(yǎng)的時(shí)間為：5h～15h；所述離體培養(yǎng)的溫度為：20℃～40℃。優(yōu)選的，所述離體培養(yǎng)的時(shí)間為：8-12h；所述離體培養(yǎng)的溫度為：30℃～40℃。最優(yōu)選的，所述離體培養(yǎng)的時(shí)間為：10h；所述離體培養(yǎng)的溫度為：35℃。本發(fā)明的花粉的離體培養(yǎng)法是測(cè)定花粉活力的有效方法，結(jié)果可重復(fù)性高?；ǚ鄣拿劝l(fā)是反映花粉活力的指標(biāo)之一，花粉的萌發(fā)能力通常以花粉萌發(fā)率來(lái)表示，通過(guò)統(tǒng)計(jì)花粉的萌發(fā)率可以測(cè)定花粉的活力。離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間是影響準(zhǔn)確率的主要因素，本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，能快速、準(zhǔn)確的測(cè)定黑果枸杞的花粉活力。以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)條件的考察：培養(yǎng)基的篩選：培養(yǎng)效果由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的蔗糖的濃度優(yōu)選為180g/l，硼酸的優(yōu)選濃度為20mg/l氯化鈣的優(yōu)選濃度為10mg/l。在確定了培養(yǎng)基配方后，進(jìn)行了以下培養(yǎng)條件的篩選：培養(yǎng)溫度的篩選：溫度20℃25℃30℃35℃萌發(fā)率11.40％15.80％20.50％26.40％由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的最佳培養(yǎng)溫度是35℃。培養(yǎng)時(shí)間的篩選：時(shí)間4h6h8h10h12h萌發(fā)率8.76％9.38％11.19％26.40％16.16％由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明的最佳培養(yǎng)時(shí)間是10個(gè)小時(shí)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)并對(duì)對(duì)培養(yǎng)條件的考察，得出了本發(fā)明最優(yōu)選的以下培養(yǎng)條件：蔗糖是花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，本發(fā)明蔗糖的濃度優(yōu)選為180g/l。硼酸能夠增加花粉對(duì)蔗糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，促進(jìn)花粉的萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)，本發(fā)明硼酸的優(yōu)選濃度為20mg/l。氯化鈣是促進(jìn)花粉管的正常生長(zhǎng)，本發(fā)明氯化鈣的優(yōu)選濃度為10mg/l。以上所述的最佳培養(yǎng)時(shí)間是10個(gè)小時(shí)；以上所述的最佳培養(yǎng)溫度是35℃；本發(fā)明黑果枸杞花粉活力測(cè)定方法的有益效果為：提供了一種用花粉離體培養(yǎng)對(duì)黑果枸杞花粉活力進(jìn)行測(cè)定的方法，這種方法操作簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)、數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，并可完全定量，對(duì)提高黑果枸杞育種工作效率具有重要意義。附圖說(shuō)明：圖1為實(shí)例1培養(yǎng)基培養(yǎng)4h的圖像；圖2為實(shí)例1培養(yǎng)基培養(yǎng)6h的圖像；圖3為實(shí)例1培養(yǎng)基培養(yǎng)10h的圖像。具體實(shí)施方式：實(shí)施例1:(1)將已開(kāi)花未開(kāi)裂散粉的黑果枸杞花藥放入裝有硫酸紙的干燥培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于室內(nèi)24h，花粉散出。(2)用毛筆蘸取適量花粉抖入凹面載玻片，輕輕滴加含有蔗糖180g/l,硼酸20mg/l,氯化鈣10mg/l的培養(yǎng)液2～3滴，輕輕混勻。(3)將凹面載玻片放入盛有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于35℃的環(huán)境中培養(yǎng)10h。(4)輕輕取出載玻片，置于40倍顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，視野內(nèi)觀察具有活力的花粉萌發(fā)出花粉管。(5)挑選5個(gè)視野，計(jì)算5個(gè)視野的萌發(fā)率的平均值即為花粉的萌發(fā)率，萌發(fā)率為26.40％。實(shí)施例2：(1)將已開(kāi)花未開(kāi)裂散粉的黑果枸杞花藥放入裝有硫酸紙的干燥培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于室內(nèi)24h，花粉散出。(2)用毛筆蘸取適量花粉抖入凹面載玻片，輕輕滴加含有蔗糖120g/l,硼酸10mg/l,氯化鈣5mg/l的培養(yǎng)液2～3滴，輕輕混勻。(3)將凹面載玻片放入盛有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于35℃的環(huán)境中培養(yǎng)10h。(4)輕輕取出載玻片，置于40倍顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，視野內(nèi)觀察具有活力的花粉萌發(fā)出花粉管。(5)挑選5個(gè)視野，計(jì)算5個(gè)視野的萌發(fā)率的平均值即為花粉的萌發(fā)率，萌發(fā)率為15.07％。實(shí)施例3：(1)將已開(kāi)花未開(kāi)裂散粉的黑果枸杞花藥放入裝有硫酸紙的干燥培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于室內(nèi)24h，花粉散出。(2)用毛筆蘸取適量花粉抖入凹面載玻片，輕輕滴加含有蔗糖150g/l,硼酸20mg/l,氯化鈣10mg/l的培養(yǎng)液2～3滴，輕輕混勻。(3)將凹面載玻片放入盛有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于35℃的環(huán)境中培養(yǎng)10h。(4)輕輕取出載玻片，置于40倍顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，視野內(nèi)觀察具有活力的花粉萌發(fā)出花粉管。(5)挑選5個(gè)視野，計(jì)算5個(gè)視野的萌發(fā)率的平均值即為花粉的萌發(fā)率，萌發(fā)率為18.24％。當(dāng)前第1頁(yè)12