本發(fā)明涉及生物蛋白
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一種功能性蛋白肽產(chǎn)品的加工方法。
背景技術(shù)：
：隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的健康意識(shí)越來(lái)越強(qiáng)烈，對(duì)食品的品質(zhì)營(yíng)養(yǎng)也越來(lái)越關(guān)注和重視。生物活性肽是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物，在生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖等作用，食用安全性極高，是當(dāng)前國(guó)際食品界最熱門(mén)的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。目前，功能性多肽研究已列入國(guó)家重點(diǎn)支持的高新
技術(shù)領(lǐng)域：
。鯽魚(yú)（學(xué)名：carassiusauratus，簡(jiǎn)稱(chēng)鯽，俗名鯽瓜子、月鯽仔、土鯽、細(xì)頭、鮒魚(yú)、寒鮒）在歐亞地區(qū)為常見(jiàn)淡水魚(yú)，為輻鰭魚(yú)綱鯉形目鯉科鯽屬的其中一種魚(yú)類(lèi)。鯽魚(yú)主要是以植物為食的雜食性魚(yú)，喜群居而行，擇食而居。肉質(zhì)細(xì)嫩，肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，每百克肉含蛋白質(zhì)13克、脂肪11克，并含有大量的鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)。鯽魚(yú)藥用價(jià)值極高，其性平味甘，入胃、腎，具有和中補(bǔ)虛、除羸、溫胃進(jìn)食、補(bǔ)中生氣之功效。鯽魚(yú)主要用于食用，在烹飪過(guò)程中鯽魚(yú)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失較多。且因產(chǎn)量過(guò)多或體積過(guò)小，鯽魚(yú)出現(xiàn)滯銷(xiāo)現(xiàn)象，造成資源的浪費(fèi)。從天然蛋白中提取具有營(yíng)養(yǎng)性和生理活性的功能肽，并將這些功能肽應(yīng)用到保健食品和強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)食品中，不但能夠全面利用食品及食品加工中的優(yōu)質(zhì)蛋白，而且能夠有效的提高來(lái)源廣泛的蛋白質(zhì)原料的附加值，同時(shí)大大提升傳統(tǒng)食品的科技含量。現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn104250285b的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，公開(kāi)了一種大黃魚(yú)魚(yú)肉抗氧化肽及用途，其特征在于：該抗氧化肽為五肽化合物，氨基酸序列為tyr-leu-met-ser-arg，esi-ms檢測(cè)給出分子量651.77da（[m+h]+652.45da）。該抗氧化肽制備方法包括勻漿、酶解、超濾和層析等步驟。制備得到的高活性抗氧化肽tyr-leu-met-ser-arg對(duì)dpph自由基、羥基自由基、abts自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用。上述抗氧化肽產(chǎn)品制備時(shí)間較長(zhǎng)，有腥味并呈淡黃色，產(chǎn)品品質(zhì)有待提高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)腥味、呈白色，能促進(jìn)胰臟分泌胰島素的功能性蛋白肽產(chǎn)品的加工方法。本發(fā)明針對(duì)
背景技術(shù)：
中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：一種功能性蛋白肽產(chǎn)品的加工方法，包括以下步驟：胰凝乳蛋白酶酶解：在鯽魚(yú)魚(yú)肉糜中加入胰凝乳蛋白酶，胰凝乳蛋白酶加入量為0.1~0.3%，酶解溫度為45~55℃，ph為7.5~8.5，酶解時(shí)間為15~25min。微波輔助酶解，微波功率為100~120w，頻率為20~30khz。酶解結(jié)束后沸水浴2~5min滅酶。微波輔助酶解能大幅縮短蛋白酶酶解時(shí)間，減少時(shí)間成本和人工成本，降低生產(chǎn)成本。胰凝乳蛋白酶將粘稠的魚(yú)肉肉糜酶解成粘度和分子量較小的固液混合物，將更多的酶切位點(diǎn)暴露出來(lái)，為下一步酶解作準(zhǔn)備；木瓜蛋白酶酶解：在酶解液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為0.2~0.5%，酶解溫度為50~60℃，ph為5.0~6.5，酶解時(shí)間為15~25min。微波輔助酶解，微波功率為100~120w，頻率為20~30khz。酶解結(jié)束后滅酶。采用分步酶解方式對(duì)魚(yú)肉肉糜進(jìn)行酶解，蛋白酶的酶解效率高，降低成本。木瓜蛋白酶對(duì)胰凝乳蛋白酶酶解得到的固液混合物進(jìn)行進(jìn)一步酶解，鯽魚(yú)魚(yú)肉蛋白分子量進(jìn)一步減小，得到大量小分子蛋白質(zhì)和多肽；等電點(diǎn)沉淀：過(guò)濾酶解液，取濾液，調(diào)節(jié)ph值為2.3~2.6，離心取沉淀。當(dāng)溶液ph值為2.3~2.6時(shí)，功能性蛋白肽在水中的溶解度快速下降，蛋白肽以沉淀的形式從溶液中析出，蛋白肽的活性不被破壞；脫色脫腥：在所得沉淀中加水，混合均勻后加脫色脫腥劑，攪拌，離心取上清液；純化：將上清液依次進(jìn)行超濾和層析，得到功能性蛋白肽，氨基酸序列為：scasrcksrcrarrcrarcgyfgkrcickcfrc。得到的功能性蛋白肽對(duì)胰島β細(xì)胞有修復(fù)作用，促進(jìn)胰島素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄形成前胰島素原的信使核糖核酸（mrna），在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核蛋白體中合成胰島素。因此，上述功能性蛋白肽產(chǎn)品對(duì)糖尿病有較好的防治效果。作為優(yōu)選，脫色脫腥劑成分及其重量份為：皂土10~15份、活性白土4~9份、堿性鈣基膨潤(rùn)土20~25份和活性炭10~15份。在物理吸附和化學(xué)吸附雙重作用下，功能性蛋白肽的腥味基本去除，脫色率達(dá)92%以上，氮保留率為85%以上，活性保持度高。作為優(yōu)選，超濾步驟為：將上清液ph調(diào)至6.0~6.5，用截留分子量1~1.5kda的超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于1~1.5kda部分。通過(guò)超濾，去除分子量大于1~1.5kda的雜質(zhì)，對(duì)功能性蛋白肽作初步的純化。作為優(yōu)選，層析步驟為：將超濾液用雙蒸水配成20~30mg/ml的溶液，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂分離，用雙蒸水、0.45~0.55mol/l和0.90~1.10mol/lnacl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，并利用反相液相色譜進(jìn)行純化，得到功能性蛋白肽。層析操作對(duì)功能性蛋白肽進(jìn)一步純化，得到高純度功能性蛋白肽。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1）本發(fā)明采用微波輔助酶解，微波輔助酶解能大幅縮短蛋白酶酶解時(shí)間，減少時(shí)間成本和人工成本，降低生產(chǎn)成本；2）本發(fā)明采用分步酶解法酶解，蛋白酶的酶解效率高，降低成本，依次采用胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解，得到大量小分子蛋白質(zhì)和多肽；3）得到的功能性蛋白肽對(duì)胰島β細(xì)胞有修復(fù)作用，促進(jìn)胰島素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄形成前胰島素原的信使核糖核酸（mrna），在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核蛋白體中合成胰島素。因此，上述功能性蛋白肽產(chǎn)品對(duì)糖尿病有較好的防治效果。具體實(shí)施例下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說(shuō)明：實(shí)施例1：一種功能性蛋白肽產(chǎn)品的加工方法，包括以下步驟：1）胰凝乳蛋白酶酶解：在鯽魚(yú)魚(yú)肉糜中加入胰凝乳蛋白酶，胰凝乳蛋白酶加入量為0.1~0.3%，酶解溫度為45~55℃，ph為7.5~8.5，酶解時(shí)間為15~25min。微波輔助酶解，微波功率為100~120w，頻率為20~30khz。酶解結(jié)束后沸水浴2~5min滅酶。微波輔助酶解能大幅縮短蛋白酶酶解時(shí)間，減少時(shí)間成本和人工成本，降低生產(chǎn)成本。胰凝乳蛋白酶將粘稠的魚(yú)肉肉糜酶解成粘度和分子量較小的固液混合物，將更多的酶切位點(diǎn)暴露出來(lái)，為下一步酶解作準(zhǔn)備；2）木瓜蛋白酶酶解：在酶解液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為0.2~0.5%，酶解溫度為50~60℃，ph為5.0~6.5，酶解時(shí)間為15~25min。微波輔助酶解，微波功率為100~120w，頻率為20~30khz。酶解結(jié)束后滅酶。采用分步酶解方式對(duì)魚(yú)肉肉糜進(jìn)行酶解，蛋白酶的酶解效率高，降低成本。木瓜蛋白酶對(duì)胰凝乳蛋白酶酶解得到的固液混合物進(jìn)行進(jìn)一步酶解，鯽魚(yú)魚(yú)肉蛋白分子量進(jìn)一步減小，得到大量小分子蛋白質(zhì)和多肽；3）等電點(diǎn)沉淀：過(guò)濾酶解液，取濾液，調(diào)節(jié)ph值為2.3~2.6，離心取沉淀。當(dāng)溶液ph值為2.3~2.6時(shí)，功能性蛋白肽在水中的溶解度快速下降，蛋白肽以沉淀的形式從溶液中析出，蛋白肽的活性不被破壞；4）脫色脫腥：在所得沉淀中加水，混合均勻后加脫色脫腥劑，攪拌，離心取上清液；5）純化：將上清液依次進(jìn)行超濾和層析，得到功能性蛋白肽，氨基酸序列為：scasrcksrcrarrcrarcgyfgkrcickcfrc。得到的功能性蛋白肽對(duì)胰島β細(xì)胞有修復(fù)作用，促進(jìn)胰島素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄形成前胰島素原的信使核糖核酸（mrna），在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核蛋白體中合成胰島素。因此，上述功能性蛋白肽產(chǎn)品對(duì)糖尿病有較好的防治效果。脫色脫腥劑成分及其重量份為：皂土10~15份、活性白土4~9份、堿性鈣基膨潤(rùn)土20~25份和活性炭10~15份。在物理吸附和化學(xué)吸附雙重作用下，功能性蛋白肽的腥味基本去除，脫色率達(dá)92%以上，氮保留率為85%以上，活性保持度高。超濾步驟為：將上清液ph調(diào)至6.0~6.5，用截留分子量1~1.5kda的超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于1~1.5kda部分。通過(guò)超濾，去除分子量大于1~1.5kda的雜質(zhì)，對(duì)功能性蛋白肽作初步的純化。層析步驟為：將超濾液用雙蒸水配成20~30mg/ml的溶液，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂分離，用雙蒸水、0.45~0.55mol/l和0.90~1.10mol/lnacl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，并利用反相液相色譜進(jìn)行純化，得到功能性蛋白肽。層析操作對(duì)功能性蛋白肽進(jìn)一步純化，得到高純度功能性蛋白肽。實(shí)施例2：一種功能性蛋白肽產(chǎn)品的加工方法，包括以下步驟：1）胰凝乳蛋白酶酶解：在鯽魚(yú)魚(yú)肉糜中加入胰凝乳蛋白酶，胰凝乳蛋白酶加入量為0.2%，酶解溫度為50℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為20min。微波輔助酶解，微波功率為110w，頻率為25khz。酶解結(jié)束后沸水浴4min滅酶。微波輔助酶解能大幅縮短蛋白酶酶解時(shí)間，減少時(shí)間成本和人工成本，降低生產(chǎn)成本。胰凝乳蛋白酶將粘稠的魚(yú)肉肉糜酶解成粘度和分子量較小的固液混合物，將更多的酶切位點(diǎn)暴露出來(lái)，為下一步酶解作準(zhǔn)備；2）木瓜蛋白酶酶解：在酶解液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為0.4%，酶解溫度為55℃，ph為5.4，酶解時(shí)間為20min。微波輔助酶解，微波功率為110w，頻率為25khz。酶解結(jié)束后滅酶。采用分步酶解方式對(duì)魚(yú)肉肉糜進(jìn)行酶解，蛋白酶的酶解效率高，降低成本。木瓜蛋白酶對(duì)胰凝乳蛋白酶酶解得到的固液混合物進(jìn)行進(jìn)一步酶解，鯽魚(yú)魚(yú)肉蛋白分子量進(jìn)一步減小，得到大量小分子蛋白質(zhì)和多肽；3）等電點(diǎn)沉淀：過(guò)濾酶解液，取濾液，調(diào)節(jié)ph值為2.5，離心取沉淀。當(dāng)溶液ph值為2.5時(shí)，功能性蛋白肽在水中的溶解度快速下降，蛋白肽以沉淀的形式從溶液中析出，蛋白肽的活性不被破壞；4）脫色脫腥：在所得沉淀中加水，混合均勻后加脫色脫腥劑，攪拌，離心取上清液；5）純化：將上清液依次進(jìn)行超濾和層析，得到功能性蛋白肽，氨基酸序列為：scasrcksrcrarrcrarcgyfgkrcickcfrc。得到的功能性蛋白肽對(duì)胰島β細(xì)胞有修復(fù)作用，促進(jìn)胰島素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄形成前胰島素原的信使核糖核酸（mrna），在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核蛋白體中合成胰島素。因此，上述功能性蛋白肽產(chǎn)品對(duì)糖尿病有較好的防治效果。脫色脫腥劑成分及其重量份為：皂土13份、活性白土5份、堿性鈣基膨潤(rùn)土23份和活性炭13份。在物理吸附和化學(xué)吸附雙重作用下，功能性蛋白肽的腥味基本去除，脫色率達(dá)93%，氮保留率為86%，活性保持度高。超濾步驟為：將上清液ph調(diào)至6.3，用截留分子量1.2kda的超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于1.2kda部分。通過(guò)超濾，去除分子量大于1.2kda的雜質(zhì)，對(duì)功能性蛋白肽作初步的純化。層析步驟為：將超濾液用雙蒸水配成24mg/ml的溶液，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂分離，用雙蒸水、0.5mol/l和1mol/lnacl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，并利用反相液相色譜進(jìn)行純化，得到功能性蛋白肽。層析操作對(duì)功能性蛋白肽進(jìn)一步純化，得到高純度功能性蛋白肽。實(shí)施例3：一種功能性蛋白肽產(chǎn)品的加工方法，包括以下步驟：1）胰凝乳蛋白酶酶解：在鯽魚(yú)魚(yú)肉糜中加入胰凝乳蛋白酶，胰凝乳蛋白酶加入量為0.3%，酶解溫度為50℃，ph為8.0，酶解時(shí)間為16min。微波輔助酶解，微波功率為110w，頻率為25khz。酶解結(jié)束后沸水浴4min滅酶。微波輔助酶解能大幅縮短蛋白酶酶解時(shí)間，減少時(shí)間成本和人工成本，降低生產(chǎn)成本。胰凝乳蛋白酶將粘稠的魚(yú)肉肉糜酶解成粘度和分子量較小的固液混合物，將更多的酶切位點(diǎn)暴露出來(lái)，為下一步酶解作準(zhǔn)備；2）木瓜蛋白酶酶解：在酶解液中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量為0.5%，酶解溫度為55℃，ph為5.4，酶解時(shí)間為15min。微波輔助酶解，微波功率為110w，頻率為25khz。酶解結(jié)束后滅酶。采用分步酶解方式對(duì)魚(yú)肉肉糜進(jìn)行酶解，蛋白酶的酶解效率高，降低成本。木瓜蛋白酶對(duì)胰凝乳蛋白酶酶解得到的固液混合物進(jìn)行進(jìn)一步酶解，鯽魚(yú)魚(yú)肉蛋白分子量進(jìn)一步減小，得到大量小分子蛋白質(zhì)和多肽；3）等電點(diǎn)沉淀：過(guò)濾酶解液，取濾液，調(diào)節(jié)ph值為2.5，離心取沉淀。當(dāng)溶液ph值為2.5時(shí)，功能性蛋白肽在水中的溶解度快速下降，蛋白肽以沉淀的形式從溶液中析出，蛋白肽的活性不被破壞；4）脫色脫腥：在所得沉淀中加水，混合均勻后加脫色脫腥劑，攪拌，離心取上清液；5）純化：將上清液依次進(jìn)行超濾和層析，得到功能性蛋白肽，氨基酸序列為：scasrcksrcrarrcrarcgyfgkrcickcfrc。得到的功能性蛋白肽對(duì)胰島β細(xì)胞有修復(fù)作用，促進(jìn)胰島素結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄形成前胰島素原的信使核糖核酸（mrna），在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核蛋白體中合成胰島素。因此，上述功能性蛋白肽產(chǎn)品對(duì)糖尿病有較好的防治效果。脫色脫腥劑成分及其重量份為：皂土14份、活性白土4份、堿性鈣基膨潤(rùn)土25份和活性炭12份。在物理吸附和化學(xué)吸附雙重作用下，功能性蛋白肽的腥味基本去除，脫色率達(dá)93.4%，氮保留率為85.7%，活性保持度高。超濾步驟為：將上清液ph調(diào)至6.3，用截留分子量1.2kda的超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于1.2kda部分。通過(guò)超濾，去除分子量大于1.2kda的雜質(zhì)，對(duì)功能性蛋白肽作初步的純化。層析步驟為：將超濾液用雙蒸水配成24mg/ml的溶液，經(jīng)過(guò)陰離子交換樹(shù)脂分離，用雙蒸水、0.5mol/l和1mol/lnacl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280nm下的吸光度曲線(xiàn)收集洗脫組分，并利用反相液相色譜進(jìn)行純化，得到功能性蛋白肽。層析操作對(duì)功能性蛋白肽進(jìn)一步純化，得到高純度功能性蛋白肽。實(shí)施例4：選擇血糖值為12.0~14.0的50名糖尿病患者，隨機(jī)選擇25名糖尿病患者作為試驗(yàn)組，讓其每次飯后服用0.2g實(shí)施例3得到的功能性蛋白肽產(chǎn)品，另外25名糖尿病患者作為對(duì)照組不服用，并且控制50名糖尿病患者的飲食相同。經(jīng)過(guò)60天的試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)組每位糖尿病患者胰島素的注射頻率，并取其平均值，記錄對(duì)照組每位糖尿病患者胰島素的注射頻率，并取其平均值。表1糖尿病患者胰島素的注射頻率組名對(duì)照組試驗(yàn)組胰島素平均注射頻率次/天1.80.6由表1可看出，本發(fā)明功能性蛋白肽對(duì)糖尿病有防治效果，可有效減輕糖尿病癥狀，具有良好的市場(chǎng)前景。本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類(lèi)似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>浙江豐宇海洋生物制品有限公司<120>一種功能性蛋白肽產(chǎn)品的加工方法<130>1<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>33<212>prt<213>人工合成<400>1sercysalaserargcyslysserargcysargalaargargcysarg151015alaargcysglytyrpheglylysargcysilecyslyscysphearg202530cys當(dāng)前第1頁(yè)12