一種草莓鹽脅迫相關(guān)基因FvDIV及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種草莓鹽脅迫相關(guān)基因fvdiv及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

草莓多年生草本植物，屬于薔薇科草莓屬，漿果類果樹(林鳳起，1986)。草莓果實(shí)為假果，由花托發(fā)育而成(雷家軍，2006)。草莓果實(shí)色澤紅嫩誘人，口感柔軟多汁，獨(dú)具風(fēng)味，具備很高的營養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值，素有“水果皇后”之稱，廣受大眾歡迎(萬清林，1994)。

植物對非生物逆境(干旱、冷害、高鹽堿等)的適應(yīng)性對于作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有著非常重要的影響，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。由于北方地區(qū)草莓的種植是在日光溫室中進(jìn)行的，因而低溫和鹽堿脅迫一直是困擾設(shè)施草莓發(fā)展的瓶頸問題，但目前在草莓中還沒有真正可用于抗逆遺傳改良的基因。

在植物體內(nèi)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，過表達(dá)或干擾某個(gè)基因可以提高植物對環(huán)境脅迫的抗性。在煙草中，過表達(dá)精氨酸脫羧酶基因，進(jìn)而提高植物體內(nèi)多胺水平，增強(qiáng)了煙草對干旱脅迫的抗性(lietal.2017)。有研究報(bào)道，在擬南芥過表達(dá)gmwrky20基因，提高了擬南芥中aba含量，從而提高了擬南芥的抗旱性(luoetal.2013)。另有研究表明，在對模式植物金魚草的研究中發(fā)現(xiàn)divaricata(div)radialis(rad)、dichotoma(dich)共同參與兩側(cè)對稱花型發(fā)育的分子調(diào)控(魏海超等，2012)，但有關(guān)divaricata基因在植物耐鹽過程中的作用鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種草莓鹽脅迫相關(guān)基因fvdiv及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是從二倍體森林草莓‘ruegen’中分離得到fvdiv基因，構(gòu)建該基因的植物過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將該基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，以實(shí)現(xiàn)fvdiv基因的功能分析。

本發(fā)明提供了一種草莓鹽脅迫相關(guān)基因fvdiv，該基因的cdna序列如seqno.1所示；草莓鹽脅迫相關(guān)基因fvdiv編碼的蛋白質(zhì)，所述基因編碼的氨基酸序列如seqidno：2所示；本發(fā)明還提供了一種含有草莓鹽脅迫基因fvdiv的植物表達(dá)載體pri101-gfp-camv35s-fvdiv，將其通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入擬南芥中。

實(shí)際上，任何一種將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)的表達(dá)載體都可以用，本發(fā)明優(yōu)先選用的是的pri101-gfp-camv35s。

本發(fā)明的有益效果是：利用現(xiàn)有植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明克隆了草莓耐鹽相關(guān)基因fvdiv，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽脅迫明顯提高。

附圖說明

圖1：fvdiv基因全長cdna序列的擴(kuò)增結(jié)果。其中m為dl2000

圖2：pri101-gfp-camv35s-fvdiv重組載體驗(yàn)證結(jié)果。其中m為dl2000

a：為kpn1和ecor1對pri101-gfp-camv35s-fvdiv重組載體雙酶切驗(yàn)證結(jié)果。

b：為轉(zhuǎn)化了的pri101-gfp-camv35s-fvdiv農(nóng)桿菌的菌落pcr結(jié)果。

圖3：pri101-gfp-camv35s-fvdiv測序比對結(jié)果。

圖4：轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性篩選。

圖5：為鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生長狀況。其中，wt為轉(zhuǎn)化的擬南芥，line8/line19為兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系。

圖6：fvdiv與其他物種氨基酸序列比對結(jié)果

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1、草莓鹽脅迫基因fvdiv的克隆

(1)以二倍體森林草莓‘ruegen’為試材。

(2)rna提?。翰捎酶牧糲tab法，提取材料中的總rna之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒以rna為模板反轉(zhuǎn)錄得到cdna第一鏈。

(3)基因的克?。阂苑崔D(zhuǎn)錄的果實(shí)cdna第一鏈為模板，利用引物fvdiv-f和fvdiv-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，回收pcr產(chǎn)物，獲得939bp的目的片段。

fvdiv-f：5＇－aaaggtaccatgtataggggaattgaagttc－3＇

fvdiv-r：5＇－aaagaattcctgatattgcatctcgaaacgc－3＇

其中，引物5＇端的前3個(gè)堿基為保護(hù)堿基，緊接著的6個(gè)堿基是酶切位點(diǎn)，5＇端前9個(gè)堿基是構(gòu)建過表達(dá)載體所需，不屬于fvdiv的基因序列。

實(shí)例2、植物表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)利用植物表達(dá)載體pri101-gfp-camv35s，選用kpn1和ecor1(購自takara公司)分別對pri101-gfp-camv35s和含有目的基因的pmd18-t(購自takara公司)進(jìn)行雙酶切；回收載體大片段和目的基因小片段，用t4dna連接酶連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)dh5a(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，鑒定重組子后即可進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

(2)選取雙酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒，送金唯智生物科技有限公司測序。之后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)細(xì)胞，得到的含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化擬南芥。

實(shí)例3、轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證—擬南芥轉(zhuǎn)化篩選及耐鹽表型分析

3.1擬南芥轉(zhuǎn)化

當(dāng)擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)花序形成時(shí)，將花序頂端減掉以誘導(dǎo)側(cè)花序的生成，轉(zhuǎn)化前將材料澆透水。挑選含有目的基因fvdiv的農(nóng)桿菌gv3101陽性克隆。接種于含有kan(卡那霉素)50mg/l和rif(利福平)25mg/l的yep液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24h，取1ml培養(yǎng)好的菌液，加入50ml液體yep液體培養(yǎng)基，放置于28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，使od600＝0.8左右。

將菌液轉(zhuǎn)入無菌的50ml離心管中，5000rpm，5min離心收集菌種，再用同等體積的ms重懸液(1/2ms+5％sucrose，ph5.7)重懸農(nóng)桿菌，并加入表面活性劑silwet，使其終濃度達(dá)到0.03％(300μl/l)。一個(gè)月后收獲了t0代種子在含有30mg/l的卡納霉素的培養(yǎng)基上篩選出陽性植株(見圖4)，以便收獲t2代種子，用于鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。

3.2擬南芥陽性株系耐鹽表型分析

在1/2ms培養(yǎng)基上播種的wt和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子生長5d后(約2片子葉)，挑選生長狀況一直的植株轉(zhuǎn)移到含有75mm的nacl的1/2ms的培養(yǎng)基上，生長12天之后測定主根長度(見圖5)。測定結(jié)果如表1所示。

表1野生型和轉(zhuǎn)基因植株在0mm和75mmnacl1/2ms培養(yǎng)基上主根長

由表1可知，在相同的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基上，12天之后，在不含nacl的1/2ms培養(yǎng)基上，野生型擬南芥(wt)的根長與轉(zhuǎn)基因株系(line8和line19)擬南芥根長沒有明顯差別。在含有75mmnacl的1/2ms培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系的主根明顯長于野生型，且轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)也優(yōu)于野生型，葉片顏色較野生型綠。這說明，草莓fvdiv能夠提高植物的抗鹽脅迫能力。以上植株的培養(yǎng)條件均在溫度23-25℃，光照1800～2200lx，光照時(shí)間為16h/d。

seqidno:1

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seqidno:2

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sequencelisting

<110>沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種草莓鹽脅迫相關(guān)基因fvdiv及其應(yīng)用

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