抗EGFR?L858R蛋白單克隆抗體及其用途的制作方法

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可特異結(jié)合egfr-l858r蛋白的單克隆抗體umab233、產(chǎn)生所述單克隆抗體的細(xì)胞株及應(yīng)用該抗體用于診斷的方法和用途。

背景技術(shù)：

肺癌，是中國最常見的癌癥，往往診斷時已是晚期。非小細(xì)胞肺癌(nsclc)占了肺癌的80％～85％。晚期nsclc患者一定程度上受益于細(xì)胞毒化療；最新的靶向療法的應(yīng)用為我們提供了這種疾病治療的新的選擇。

nsclc經(jīng)常有表皮生長因子(egfr)突變。egfr酪氨酸激酶中，發(fā)現(xiàn)有突變的四個外顯子18～2l，其中19號外顯子缺失(745-750del)和21號外顯子點突變(l858r)突變是兩大經(jīng)典的突變，分別占egfr突變的53％和26％，剩下的21％非典型突變包括20號外顯子的t790m，18號外顯子的g719a，21號外顯子的l861q等。egfr-l858r是指egfr的第858位亮氨酸(l)點突變?yōu)榫彼?r)。

小分子egfr酪氨酸激酶抑制劑(tkis)，包括厄洛替尼及吉非替尼，是最早在中國用于晚期nsclc患者的藥物。最近的數(shù)據(jù)表明，egfr突變與nsclc標(biāo)準(zhǔn)一線化療相比，改善了無進展生存(pfs)并提高了療效。因此，egfr突變狀態(tài)的檢測對患者治療方案的選擇具有十分重要的意義。

目前在臨床上通常用rt-pcr、免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,ihc)病理實驗等方法檢測腫瘤組織中egfr-l858r的表達狀況，其中ihc由于更加簡便和經(jīng)濟而廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷之中，該實驗方法的核心為特異性結(jié)合egfr-l858r的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性較高的針對egfr-l858r蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合特異性較高的egfr-l858r蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測egfr-l858r蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為cgmcc)，保藏日期為2017年4月6日，保藏編號為cgmccno.13825。

本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合egfr-l858r蛋白的單克隆抗體umab233，由上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。

本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下：

(1)單克隆抗體的篩選與制備：采用合成的egfr-l858r突變多肽(購買杭州中肽生化有限公司)免疫balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗egfr-l858r特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為umab233，亞型鑒定為igg1；通過無血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得egfr-l858r單克隆抗體。分別通過westernblot、免疫組化實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

進一步采用origene高密度蛋白芯片對上述單克隆抗體的特異性進行驗證：

origene高密度蛋白芯片上包含10,000個hek293t細(xì)胞蛋白過表達裂解物(不包含egfr-l858r蛋白裂解液)，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽性信號的方向。

本發(fā)明將所述單克隆抗體umab233與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結(jié)果顯示：本發(fā)明所述單克隆抗體umab233與芯片上所有蛋白無交叉反應(yīng)。

本發(fā)明還提供了單克隆抗體umab233在制備用于檢測egfr-l858r蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體umab233，可檢測腫瘤細(xì)胞中egfr-l858r的表達狀況。

本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于檢測腫瘤細(xì)胞中egfr-l858r蛋白水平的試劑盒中的應(yīng)用。

其中所述腫瘤具體包括但不限于肺癌等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株(保藏編號為cgmccno.13825)，以及由此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體umab233。本發(fā)明還提供了單克隆抗體umab233在制備用于檢測egfr-l858r蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用，含單克隆抗體umab233的免疫組化檢測試劑盒，以及單克隆抗體umab233在制備用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞中egfr-l858r蛋白水平的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所述單克隆抗體可與egfr-l858r蛋白特異性結(jié)合，而與芯片上10000種蛋白無交叉反應(yīng)，顯著提高了egfr-l858r蛋白免疫檢測的特異性和可靠性，廣泛適用于用于各種腫瘤細(xì)胞中egfr-l858r的檢測。

保藏信息

用于保藏的雜交瘤細(xì)胞株umab233的分類命名為：鼠抗人表皮生長因子受體l858r點突變(egfr-l858r)單克隆雜交瘤細(xì)胞株；

保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；

保藏單位簡稱：cgmcc；

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所；

保藏日期：2017年4月6日；

保藏編號：cgmccno.13825。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例2egfr-l858r單克隆抗體umab233的westernblot檢測結(jié)果圖，以umab233檢測瞬時轉(zhuǎn)染egfr-l858r質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞中egfr-l858r蛋白的表達，其中泳道l為轉(zhuǎn)染空載體的hek293t細(xì)胞裂解液為抗原的檢測結(jié)果、泳道r為轉(zhuǎn)染pcmv6-egfr-l858r質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液抗原的檢測結(jié)果；泳道m(xù)為轉(zhuǎn)染pcmv6-egfr質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液抗原的檢測結(jié)果；

圖2示實施例3肺癌組織免疫組化檢測結(jié)果圖(一抗為egfr-l858r單克隆抗體umab233，1:300)；

圖3示實施例4origene蛋白芯片鑒定結(jié)果圖(一抗為egfr-l858r單抗umab233,1:100；二抗為alexa647-標(biāo)記的驢抗鼠igg，1:500)。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1、egfr-l858r單克隆抗體的制備與篩選

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用購買的合成egfr-l858r多肽(以下簡稱egfr-l858r抗原)對b6/c57小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)進行免疫。具體方法如下：

1、動物免疫：egfr-l858r抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以elisa法梯度稀釋測定血清效價；根據(jù)結(jié)果確定是否加強免疫，選取抗體效價最高的小鼠進行細(xì)胞融合。

2、細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞采用balb/c來源的sp2/0，融合時處于對數(shù)生長期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入hat培養(yǎng)基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

3、篩選和克?。喝诤?-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆，使用egfr-l858r重組蛋白進行elisa測試。標(biāo)記細(xì)胞株號。對陽性孔細(xì)胞進行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定elisa值，挑取od280陽性值較高的單克隆孔進行有限稀釋，直至elisa測定96孔板全板結(jié)果為陽性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對應(yīng)融合板細(xì)胞株為umab233。

4、細(xì)胞上清單抗的制備與純化：將細(xì)胞株umab233用含15％血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)于10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，擴培至約4×10⁷個時，800rpm離心5min，棄上清并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2l轉(zhuǎn)瓶中，加入無血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度約為3×10⁵個/ml。繼續(xù)培養(yǎng)1～2周后，當(dāng)細(xì)胞死亡率達到60％-70％時(此時細(xì)胞密度大概為1-2×10⁶個/ml)，收取細(xì)胞懸液6000rpm高速離心20min，取上清，親和層析法進行上清純化，根據(jù)抗體壓型選擇相應(yīng)柱料，單抗umab233亞型為igg1，采用proteing進行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y定、分裝(100ul/管，濃度為1mg/ml)、保存在4-8℃。

實施例2、egfr-l858r單克隆抗體umab233為一抗的蛋白印記(western-blot)檢測

(1)、實驗方法：

1、準(zhǔn)備細(xì)胞：準(zhǔn)備hek293t細(xì)胞(293t，atcccatlogno.crl-3216)，培養(yǎng)于含5％co2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

2、轉(zhuǎn)染：將人源全長egfr-l858r質(zhì)粒pcmv6-egfr-l858r(rc400290，origene公司)、野生型egfr質(zhì)粒(rc217384，origene公司)和空載體pcmv6(ps100001，origene公司)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，36小時收獲活細(xì)胞。

3、制備細(xì)胞裂解液：將上述細(xì)胞消化，水平離心機800-1000rpm/5min離心,pbs洗2次，細(xì)胞沉淀用pbs定容到400ul-ep管，加入細(xì)胞裂解液，冰浴裂解20分鐘后，12000rpm離心10分鐘，收集上清加入5xloadingbuffer稀釋成1x作為細(xì)胞裂解液，-80℃存儲備用。

4、sds-page電泳：恒壓180v50min溴酚蘭至凝膠底部。

5、轉(zhuǎn)膜：提前用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡nc膜與濾紙，三明治形式置于濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀，順序為：電極(-)-海綿-濾紙-凝膠-nc膜-濾紙-電極(+)，一定要保證膠在下膜在上，即凝膠靠近負(fù)極。恒流600ma,45分鐘。

6、染色：用立春紅s染色2min，用蒸餾水清洗，至marker條帶顯出，用圓珠筆做好標(biāo)記。蒸餾水沖洗膜。

7、封閉：用封閉液(含5％脫脂奶的tbst)浸沒nc膜并置于37℃孵育1小時。

8、一抗孵育：將nc膜置于egfr-l858r鼠單抗umab233(以封閉液將抗體稀釋2000倍)中，37℃溫箱孵育1小時后，再用15mltbst洗膜15min*3次。(根據(jù)容器大小可調(diào)整tbst用量)

9、二抗孵育：將nc膜置于hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg二抗(jackson，catlogno.115-035-146；1：5000)中，室溫?fù)u床孵育1小時后，tbst洗膜5次，15min/次。

10、底物曝光：魯米諾和雙氧水1：1混勻后加在nc膜上(1ml/膜),壓上x射線膠片曝光，然后將膠片進行顯影和定影(暗室中可根據(jù)膠片上的熒光估算艷片時間)。

11、根據(jù)陰性，陽性，空白對照來進行結(jié)果分析和判定，見圖1。

(2)、實驗結(jié)果：

由圖1結(jié)果可見，egfr-l858r鼠單抗umab233(1:2000)能檢測到轉(zhuǎn)染pcmv6-egfr-l858r重組質(zhì)粒的hek293t細(xì)胞裂解液中egfr-l858r蛋白(r)，分子量大小與預(yù)期相符，而轉(zhuǎn)染空載體(l)或者野生型egfr(m)質(zhì)粒的239t細(xì)胞中則沒有相應(yīng)大小的條帶，表明umab233能特異性檢測到egfr-l858r蛋白的表達。

實施例3、egfr-l858r單克隆抗體umab233為一抗的免疫組化檢測

(1)、實驗方法：

1、取石蠟包埋的肺癌組織蠟塊，使用sakura組織切片機進行切片，組織厚度為4μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復(fù)液(1mmedta,ph8.5的10mmtris-hcl緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)2.5min，待高壓鍋溫度降至約90℃時，打開高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入egfr-l858r單抗(umab233)，稀釋比：1:500，使用封閉液進行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加聚合物hrp染色試劑盒中試劑pv6000(catlogno.pv-6000)，37℃孵育15分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應(yīng)用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖2。

(2)、實驗結(jié)果：

由圖2結(jié)果可見，egfr-l858r蛋白在肺癌組織中的腫瘤細(xì)胞呈特異性細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達。

結(jié)果表明本發(fā)明所述的單克隆抗體umab233能夠特異性識別肺癌組織中的egfr-l858r蛋白。

實施例4、單克隆抗體umab233的特異性蛋白芯片檢測

origene高密度蛋白芯片上包含10,000個hek293t細(xì)胞蛋白過表達裂解物(不包括egfr-l858r蛋白裂解液)，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過excel文件進行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽性信號的方向。以下為使用origene蛋白(origenecatpa100001)芯片進行umab233抗體鑒定實驗的實驗方法：

1、將一張蛋白芯片放在50ml離心管中，使用40ml去離子水浸潤芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mlpbst平衡芯片。室溫處理10分鐘。

2、向50ml離心管中加入40ml5％脫脂牛奶(用pbst進行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗umab233，稀釋比列為1：100。

4、將潔凈的封口膜粘貼到實驗臺上，滴加250-300μl一抗在封口膜上。

5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片nc膜的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤芯片nc膜，直至整張nc膜浸潤在一抗溶液中。整個操作過程避免產(chǎn)生氣泡。將芯片移到4℃環(huán)境下，靜置，一抗孵育過夜。在芯片上加蓋培養(yǎng)皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長時間孵育導(dǎo)致抗體蒸發(fā)。

6、第二天將芯片移至50ml離心管中，使用pbst漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40mlpbst(0.1％tween-20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。

7、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋二抗alexa647-標(biāo)記的驢抗鼠igg，稀釋比例為1：500。

8、按照上述步驟4，步驟5進行二抗孵育操作。室溫孵育1小時。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發(fā)生信號漂白。

9、按照上述步驟6，使用pbst洗滌芯片。

10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。

11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。

12、使用芯片掃描儀讀取熒光信號。

13、根據(jù)bsa-cy3以及bsa-cy5確定芯片方向以及陽性信號的位點。

14、根據(jù)陽性信號位點找出對應(yīng)蛋白裂解液id，根據(jù)裂解液數(shù)據(jù)庫信息，查找到對應(yīng)蛋白名稱，ncbi錄入號(accessionnumber)，蛋白id，蛋白大小等信息。結(jié)果見圖3。

圖3結(jié)果顯示，在蛋白芯片上所有蛋白與抗體umab233均不結(jié)合，表明本發(fā)明所述抗體umab233具有一定的特異性。

<110>無錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗egfr-l858r蛋白單克隆抗體及其用途

<210>1

<211>1671

<212>dna

<213>合成egfr-l858r多肽序列

<400>lysilethrasppheglyargalalysleuleugly