本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)是生物與健康相關(guān)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)。隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，目前細(xì)胞培養(yǎng)已成為細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科研究的重要基礎(chǔ)。為了深入探討細(xì)胞的生長活動規(guī)律、有關(guān)疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機(jī)制，開發(fā)具有不同針對性的細(xì)胞培養(yǎng)方法具有重要意義。
細(xì)胞培養(yǎng)作為生命及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。尤其隨著細(xì)胞治療個性化技術(shù)的興起，體外擴(kuò)增特殊功效的細(xì)胞成了臨床前研究以及臨床治療的重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目。具有體外擴(kuò)增特殊功效的細(xì)胞包括由多功能的造血干細(xì)胞、t細(xì)胞、nk細(xì)胞、dc細(xì)胞以及cik細(xì)胞等，將這類細(xì)胞體外擴(kuò)增之后再回輸?shù)讲溉樯矬w內(nèi)，有利于提高機(jī)體的造血裝置功能：如提升紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞等的數(shù)量及功能維護(hù)、抗腫瘤能力以及免疫防御能力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：本發(fā)明提供了一種高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，用于多種人源以及非人源細(xì)胞的培養(yǎng)。
技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入3-5mlpbs洗滌細(xì)胞2-3次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1-2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3-5min，加入2-3ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底40-50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1000-1500g/min條件下離心3-10min，用移液槍去除上清液，加入2-3ml新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞40-50次；平均加入到3-8個細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。本發(fā)明所述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，方法合理，易于實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，邊界清晰，鏡下觀察透亮、分裂相更多、形態(tài)及分散度佳，可以有利于生物與健康相關(guān)研究。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。可以與胰蛋白酶相配合，迅速使貼壁細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿，減少胰蛋白酶對細(xì)胞的損傷。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述培養(yǎng)基包括70-90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10-30%的胎牛血清。胎牛血清可以進(jìn)一步為培養(yǎng)的細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時還能終止胰蛋白酶的消化作用。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖80-90份、碳酸氫鈉10-20份、丙酮酸鈉8-18份、絲膠蛋白3-12份、氯化鉀30-50份、無水硫酸鎂5-12份、氯化鈉60-80份、無水磷酸二氫鈉8-16份、葉酸0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、煙酰胺0.2-0.8份、無水氯化鈣20-40份、硝酸鐵0.1-0.5份、丁二酸5-10份、丁二酸鈉9-18份、d-泛酸鈣0.2-0.8份、酒石酸膽堿0.5-1份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.1-0.5份、鹽酸吡哆辛0.1-0.6份、n-異丙基丙烯酰胺0.1-0.5份、亞麻酸0.3-3份、乙醇胺0.5-0.8份、芳香酸酯0.2-0.9份、酚紅鈉0.8-1.5份和去離子水100份。基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分合理，營養(yǎng)豐富，可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供更多的營養(yǎng)物。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2-10份、白介素23-8份、白介素43-6份、白介素141-5份、ifn-γ3-6份和神經(jīng)白細(xì)胞素1-4份。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素?？梢杂行Х乐古囵B(yǎng)細(xì)胞被污染。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。青霉素和鏈霉素活性好，效果佳。
進(jìn)一步的，上述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)皿為10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。
有益效果：本發(fā)明所述的高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，方法合理，易于實(shí)現(xiàn)，培養(yǎng)基可以為細(xì)胞培養(yǎng)提供更多的營養(yǎng)物（包括生長因子等），細(xì)胞生長速度快，細(xì)胞狀態(tài)好，邊界清晰，鏡下觀察透亮、分裂相更多、形態(tài)及分散度更佳，可以有利于生物與健康相關(guān)研究。
具體實(shí)施方式
下面將通過幾個具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實(shí)施例只是為了說明問題，并不是一種限制。
實(shí)施例1
一種高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入3mlpbs洗滌細(xì)胞3次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3min，加入2ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底40次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1000g/min條件下離心10min，用移液槍去除上清液，加入2ml新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞40次；平均加入到3個細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
其中，所述培養(yǎng)基包括70%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。并且，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖80份、碳酸氫鈉10份、丙酮酸鈉8份、絲膠蛋白3份、氯化鉀30份、無水硫酸鎂5份、氯化鈉60份、無水磷酸二氫鈉8份、葉酸0.2份、肌醇0.5份、煙酰胺0.2份、無水氯化鈣20份、硝酸鐵0.1份、丁二酸5份、丁二酸鈉9份、d-泛酸鈣0.2份、酒石酸膽堿0.5份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.1份、鹽酸吡哆辛0.1份、n-異丙基丙烯酰胺0.1份、亞麻酸0.3份、乙醇胺0.5份、芳香酸酯0.2份、酚紅鈉0.8份和去離子水100份。
另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。
再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2份、白介素23份、白介素43份、白介素141份、ifn-γ3份和神經(jīng)白細(xì)胞素1份。
此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。進(jìn)一步的，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。
實(shí)施例2
一種高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌細(xì)胞2次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化5min，加入3ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1500g/min條件下離心3min，用移液槍去除上清液，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞50次；平均加入到8個細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
其中，所述培養(yǎng)基包括90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10%的胎牛血清。并且，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖90份、碳酸氫鈉20份、丙酮酸鈉18份、絲膠蛋白12份、氯化鉀50份、無水硫酸鎂12份、氯化鈉80份、無水磷酸二氫鈉16份、葉酸0.6份、肌醇1.5份、煙酰胺0.8份、無水氯化鈣40份、硝酸鐵0.5份、丁二酸10份、丁二酸鈉18份、d-泛酸鈣0.8份、酒石酸膽堿1份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.5份、鹽酸吡哆辛0.6份、n-異丙基丙烯酰胺0.5份、亞麻酸3份、乙醇胺0.8份、芳香酸酯0.9份、酚紅鈉1.5份和去離子水100份。
另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。
再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子10份、白介素28份、白介素46份、白介素145份、ifn-γ6份和神經(jīng)白細(xì)胞素4份。
此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。進(jìn)一步的，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。
實(shí)施例3
一種高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入4mlpbs洗滌細(xì)胞2-3次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化4min，加入2ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底45次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1200g/min條件下離心5min，用移液槍去除上清液，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞45次；平均加入到5個細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
其中，所述培養(yǎng)基包括80%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及20%的胎牛血清。并且，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、絲膠蛋白5份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、酒石酸膽堿0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、n-異丙基丙烯酰胺0.2份、亞麻酸1份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1份和去離子水100份。
另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。
再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括4份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成：重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子6份、白介素25份、白介素44份、白介素145份、ifn-γ5份和神經(jīng)白細(xì)胞素3份。
此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。進(jìn)一步的，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。
實(shí)施例4
一種高營養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌細(xì)胞3次，向10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3min，加入2ml的新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1500g/min條件下離心3min，用移液槍去除上清液，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細(xì)胞50次；平均加入到6個細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
其中，所述培養(yǎng)基包括70%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。并且，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉12份、絲膠蛋白6份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉72份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.3份、肌醇1份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.3份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、n-異丙基丙烯酰胺0.4份、亞麻酸2份、乙醇胺0.6份、芳香酸酯0.3份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。
另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計(jì)，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸5份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸10份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。
再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計(jì)，由以下組分組成重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子2份、白介素28份、白介素43份、白介素144份、ifn-γ5份和神經(jīng)白細(xì)胞素2份。
此外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。進(jìn)一步的，所述胰蛋白酶中還包含0.01%的edta。
以上所述僅是發(fā)明的幾個實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。