用于檢測多種病原體的熒光實時檢測方法及應用與流程

本發(fā)明屬于核酸檢測
技術領域：
，更具體地說，涉及用于檢測多種病原體的熒光實時檢測方法及應用。本發(fā)明還涉及采用該方法的定量和/或定性檢測試劑盒。
背景技術：
：病原檢測是在疾病感染初期檢測病原體，及時提供治療，幫助預防疾病。病原體診斷一般分為細菌、病毒和真菌診斷。病毒檢測有多重方法，包括病毒培養(yǎng)、電子顯微鏡觀察、病毒抗原抗體檢測。雖然病毒培養(yǎng)是檢測的金標準，但是過程復雜，耗時數天。電子顯微鏡通過觀察病毒的形態(tài)來進行科屬判定，但是對技術人員要求高，且價格昂貴。病毒抗原抗體檢測是檢測病毒感染后產生的蛋白來鑒定病原體，還需要根據病人臨床癥狀來判定。核酸檢測是一種新型的檢測方法，它通過pcr等手段檢測病毒感染過程中所產生的核酸，不僅檢測時間較早，且耗時較短。目前，實時熒光定量rt-pcr(real-timert-pcr)是較為常用的一種檢測方法，分為染料法和探針法。然而，因病毒和細菌等微生物種類多，變異快，故易發(fā)生檢測錯誤(如假陽性、假陰性)。為了檢測多種類的病毒或同一種類病毒的不同病毒亞型或株，常常需要分別進行測試，因此增加了檢測難度并費時費力。因此，本領域迫切需要開發(fā)簡便、快速、靈敏、準確地檢測高變異的病毒等病原體的方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就是提供簡便、快速、靈敏、準確地檢測高變異的病毒等病原體的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種定量或定性的核酸擴增方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(i)在一擴增體系中，以待測核酸為模板，用m種引物對、高保真dna聚合酶進行核酸擴增，其中，m為≥1的正整數；所述的m種引物對中，至少一種引物對為位點特異性引物對，所述位點特異性引物對包括第一引物和第二引物；其中，(a)所述第一引物結構如下式i所示：z1-z2-z3-f1(i)式中，f1為熒光基團或淬滅基團；z1為無或附加功能區(qū)，長度為l1個核苷酸；z2為互補結合區(qū)，長度為l2個核苷酸；其中，z1和z2中至少一個與f2相連，其中f2為熒光基團或淬滅基團；并且f1和f2兩者中一個為熒光基團，另一個為淬滅基團；z3為3’端的位點識別區(qū)，所述識別區(qū)的長度為l3個核苷酸，并且所述的識別區(qū)與待檢測的模板檢測區(qū)序列是匹配或非匹配的，并且l3為1-5；(b)所述第二引物為正常引物或與第一引物結構相同；(c)所述高保真dna聚合酶為具有外切酶活性的dna聚合酶；(ii)檢測所述擴增體系中的熒光，從而獲得定量或定性的檢測結果。在另一優(yōu)選例中，l1為0，或1-50個核苷酸。在另一優(yōu)選例中，l2為10-50；較佳地12-40；更佳地15-35。在另一優(yōu)選例中，l3為1、2、3，更佳地，1或2。在另一優(yōu)選例中，第一引物和第二引物的長度為15-50個核苷酸；較佳地，20-40個核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述m為≥2的正整數，較佳地，所述m為≥3的正整數，更佳地，所述m為≥4的正整數，更佳地，所述m為≥5的正整數。在另一優(yōu)選例中，m為1-50、2-50、3-50、4-50或5-50。在另一優(yōu)選例中，所述的m種引物對中≥80％，≥90％或100％是位點特異性引物對。在另一優(yōu)選例中，所述正常引物是未經任何基團(包括熒光和淬滅基團)修飾的引物，其與模板序列完全互補配對。在另一優(yōu)選例中，所述高保真dna聚合酶選自下組：q5dna聚合酶、kodplusneodna聚合酶、blendtaqdna聚合酶、promstarhsdna聚合酶、pfudna聚合酶、kodfxdna聚合酶、kodtmdna聚合酶、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述高保真dna聚合酶選自下組：q5dna聚合酶或kodplusneodna聚合酶。在另一優(yōu)選例中，所述熒光基團選自下組：fam、cy5、texasred、hex、vic、tet、joe、tamra、rox、lcred610、lcred640、lccyan500、yakimayellow、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述封閉基團選自下組：bhq1、bhq3、eclipse、tamra、bhq2、dabcyl、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述逆轉錄酶選自下組：m-mlvrtase、amvrtase、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測結果為檢測多種病原體存在與否的檢測結果。在另一優(yōu)選例中，所述的多種病原體為3-100種，較佳地5-50種。在另一優(yōu)選例中，所述的病原體包括同一種類病毒的不同病毒亞型或株。在另一優(yōu)選例中，所述的病原體為高變異性病原體。在另一優(yōu)選例中，其特征在于，所述擴增體系中還包括有少量的非高保真酶，所述非高保真dna聚合酶為不具有外切酶活性的dna聚合酶。在另一優(yōu)選例中，所述非高保真dna聚合酶選自下組：taqdna聚合酶、tthdna聚合酶、或其組合。在另一優(yōu)選例中，非高保真dna聚合酶的用量通常為0-1u/25ul，較佳地0.001-1u/25ul，更佳地0.01-0.2u/25ul，更佳地0.02-0.1u/25ul。在另一優(yōu)選例中，非高保真dna聚合酶的用量與高保真dna聚合酶用量(按iu計)之比：1/20至1:1或更低，較佳地1/10-4/5，更佳地為1/5-3/5。在另一優(yōu)選例中，高保真dna聚合酶的用量為能夠進行有效擴增。在另一優(yōu)選例中，高保真dna聚合酶的用量為0.3-1u/25ul，較佳地0.4-0.8u/25ul，更佳地0.5-0.7u/25ul。在另一優(yōu)選例中，添加更可能低的非高保真dna聚合酶(如0.01-0.1u/25ul)。在另一優(yōu)選例中，所述f1為熒光基團，f2為淬滅基團。在另一優(yōu)選例中，在核酸擴增反應體系中，添加的mg2+離子終濃度為2mm-8mm，較佳地，3-7mm，更佳地，4mm-6mm。在另一優(yōu)選例中，利用不同熒光和淬滅基團標記針對不同目標核酸的熒光引物，針對不同目標核酸進行單重或多重實時熒光核酸擴增。在另一優(yōu)選例中，所述的方法是非診斷性和非治療性的方法。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種非診斷性和非治療性地檢測病原微生物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：(a)利用如本發(fā)明第一方面所述的核酸擴增方法，對待測樣品進行實時熒光核酸擴增；和(b)分析實時熒光核酸擴增反應擴增曲線，從而判定所述待測樣品是否存在病原微生物。在另一優(yōu)選例中，檢測結果可以通過熒光定量pcr檢測反應中出現(xiàn)的熒光信號或擴增曲線，或者通過電泳檢測擴增產物。在另一優(yōu)選例中，通過標準曲線和擴增曲線的ct(閾循環(huán)數)值來確定基因的表達量，或者通過比較目的基因和參照基因的ct值進行相對定量。在本發(fā)明的第三方面，提供了如本發(fā)明的第一方面所述的核酸擴增方法的用途，其特征在于，用于體外檢測病原微生物。在另一優(yōu)選例中，用于對微生物核酸(真菌、細菌和病毒的rna、dna)和基因表達的mrna進行熒光實時定量檢測。在另一優(yōu)選例中，用于高變異性病原體的多重(定量)檢測和人類致病相關基因的表達定量檢測。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測是生物安全或食品安全相關檢測。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了用高保真dna聚合酶和熒光引物對核酸(耐受突變)進行檢測原理圖。圖2顯示了本發(fā)明一個實例中對h7n9病毒核酸進行檢測的標準曲線。其中，a為檢測野生型模板，b為檢測突變型模板。圖3顯示了非高保真dna聚合酶用量對體系的影響。圖4顯示了本發(fā)明的檢測體系可以有效檢測各種突變位點。圖5顯示了本發(fā)明的熒光引物3’端標記熒光基團對擴增反應效率的影響。圖6顯示了不同高保真dna聚合酶對擴增反應效率的影響。圖7顯示了本發(fā)明方法可以進行多個熒光通道檢測。其中，a、b、c分別表示使用5種高保真酶對fluc的探針(hex-bhq2)、actb的探針(texred-eclipse)、actb的探針(hex-bhq1)進行反應；d表示使用q5酶對piv4病毒探針(cy5-bhq3)進行反應；e、f表示使用7種高保真酶對rsva的探針(fam-mgb)和actb的探針(fam-tamra)進行反應。圖8顯示了不同長度目的產物對高保真dna聚合酶介導的熒光引物擴增體系的影響。圖9顯示了不同pcr反應添加劑對本發(fā)明方法的影響。其中，a為添加tamc，b為添加bt，c為添加ssb，d為添加甲酰胺，e為添加dmso。圖10顯示了本發(fā)明一個實例中對基因表達進行定量檢測的結果。其中，a、b表示同時使用基于taqman探針的熒光方法和新方法對體外轉錄的β-actin基因rna標準品(107—102拷貝/μl)進行檢測，并制作標準曲線；圖10c表示以8份正常血液樣本中抽提出的rna核酸為樣本，使用普通熒光方法和新方法定量檢測β-actin基因表達量。圖11顯示了不同mg2+濃度對擴增反應效率的影響。具體實施方式本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了一種可簡便、快速、靈敏、準確地檢測高變異的病毒等病原體的方法。具體地，本發(fā)明人利用熒光引物基于、任選的微量非高保真dna聚合酶、高保真dna聚合酶的3’-5’外切酶校正功能以及特定的優(yōu)化條件，開發(fā)了一種操作簡單快捷、靈敏性強、準確度高的檢測方法。實驗表明，本發(fā)明方法可廣泛用于診斷和非診斷性的檢測，并且可用于檢測各種不同的病原體，如細菌、病毒等，尤其高變異性的病原體微生物。在此基礎上完成了本發(fā)明。術語如本文所用，術語“本發(fā)明方法”和“本發(fā)明檢測方法”可互換使用，指本發(fā)明第一方面中所述的基于高保真dna聚合酶、任選的微量非高保真dna聚合酶和熒光引物的、可簡便、快速、靈敏、準確地檢測高變異的病毒等病原體的方法。如本文所用，堿基的“匹配”或“配對”是指兩條核苷酸序列中相應的堿基按照a與t，g與c配對的原則形成反向互補的雙鏈結構。如本文所用，術語“完全匹配”是指引物與模板之間序列完全互補，不存在任何堿基錯配。探針探針是一種寡核苷酸序列，與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對，探針5’端一般連接熒光基團，3’端連接淬滅基團。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅，但在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。隨著擴增循環(huán)數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累，因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系，呈現(xiàn)一種s型曲線。本發(fā)明在這里將熒光引物命名為hfman探針，以區(qū)分于普通熒光定量中taqman探針。本發(fā)明可以對核酸進行有效定量和檢測，其熒光探針不要求與模板錯配，即熒光引物3’末端無論與模板錯配與否，均可實現(xiàn)幾乎等效的擴增。熒光引物對在本發(fā)明檢測方法中，采用了結合于靶序列并有效進行擴增的引物對。在所述的引物對中，至少一個引物是特殊結構的熒光引物對。在本發(fā)明中，通常在引物3’端進行修飾或封閉。典型地，引物3’羥基被修飾和封閉的類型可以是熒光基團也可以是封閉基團。熒光引物可以與模板完全匹配，也允許熒光引物3’末端存在一個或一個以上與模板錯配的任何堿基。熒光引物的熒光和淬滅基團可以分別標記在探針的5’或3’末端和3’或5’末端，標記在3’末端的淬滅或熒光基團起到封閉3’-oh的作用，使其在常規(guī)pcr擴增反應中無法延伸。代表性的熒光基團的例子包括(但并不限于)：fam、cy5、texasred、hex、vic、tamra、tet、joe、rox、lcred610、lcred640、lccyan500、yakimayellow、或其組合。代表性的封閉基團的例子包括(但并不限于)：bhq1、bhq3、tamra、eclipse、bhq2、dabcyl、或其組合。在本發(fā)明中，被修飾的核苷酸種類沒有特別限制，可以是：a、t、c、g或其組合。在另一優(yōu)選例中，采用在3’端標記熒光基團方式，這樣可獲得最佳的檢測效果，并且可以進一步提高檢測的靈敏度，更容易和更靈敏地反映高保真dna聚合酶對熒光引物的3’末端切割和延伸。在本發(fā)明中，優(yōu)化的反應體系可以使用單熒光引物或多重熒光引物。高保真dna聚合酶在本發(fā)明中，一個重要的特征是采用高保真dna聚合酶。如本文所用，“高保真dna聚合酶”指具有識別發(fā)生錯配的“引物-模板”復合物并從所述復合物中切除發(fā)生錯配的引物的錯配區(qū)(或錯配堿基)的dna聚合酶。該術語優(yōu)選識別和切除位于錯配引物的3’端的錯配堿基的dna聚合酶。在本發(fā)明中，所述的高保真dna聚合酶沒有特別限制，可以包括任何具有3’-5’外切酶活性的dna聚合酶。代表性的例子包括(但并不限于)：kodtmdna聚合酶、q5dna聚合酶、kodplusneodna聚合酶、blendtaqdna聚合酶、promstarhsdna聚合酶、pfudna聚合酶、kodfxdna聚合酶、或其組合，優(yōu)選為，q5dna聚合酶或kodplusneodna聚合酶。非高保真dna聚合酶如本文所用，“非高保真dna聚合酶”具有5’端到3’端的dna聚合酶活性，但不能識別和切除位于錯配引物的3’端的錯配堿基的dna聚合酶。在本發(fā)明中，所述的非高保真dna聚合酶沒有特別限制，可以包括任何不具有或基本上不具有3’-5’外切酶活性的dna聚合酶。代表性的例子包括(但并不限于)：taqdna聚合酶、tthdna聚合酶、或其組合。本發(fā)明檢測方法及其基本原理本發(fā)明提供了一種可用于快速、靈敏而準確地對病原體進行多重檢測和/或基因表達定量檢測的方法。本發(fā)明方法可以是診斷性或非診斷性的。為了便于理解，提供以下基本原理供參考。應理解，本發(fā)明的保護范圍并不受所述基本原理的任何限制。本發(fā)明的一個主要原理如下：如圖1所示。本發(fā)明方法基于高保真dna聚合酶、任選的微量非高保真dna聚合酶和熒光引物，利用高保真dna聚合酶的3’-5’外切酶活性識別和切除熒光引物3’端修飾的熒光或者淬滅基團。在本發(fā)明中，一方面，可將3’末端最后一個堿基(無論錯配與否)進行切割，然后熒光基團和淬滅基團分離，從而使熒光引物釋放出熒光；另一方面，暴露出熒光引物3’-oh，在高保真dna聚合酶和任選的微量非高保真dna聚合酶的作用下擴增延伸。擴增反應中，隨著擴增產物的增加，熒光信號相應增加，從而實現(xiàn)對整個擴增反應的實時檢測。無論模板與熒光引物3’末端是否匹配，都可以進行高效擴增。當模板與熒光引物3’末端不匹配時，高保真dna聚合酶同樣能夠將修飾識別為錯配信號，切除熒光引物3’端最后一個核苷酸，繼續(xù)進行dna合成；當模板與熒光引物3’末端完全匹配或者少數堿基錯配時，由于引物被熒光基團或者淬滅基團所修飾以及體系中高保真酶含量高，導致高保真酶對基團進行識別，并且切除熒光引物的3’末端添加了淬滅基團或熒光基團標記的配對核苷酸，使得pcr可以正常進行。在本發(fā)明中，一種典型的基于高保真酶、任選的微量非高保真dna聚合酶和熒光引物的核酸擴增方法，包括步驟：步驟1，根據野生型基因序列設計正向熒光引物和反向普通引物，對其中正向熒光引物進行5’-，3’-末端的熒光基團和淬滅基團標記；步驟2，用所述正向熒光引物和反向普通引物對待測樣品進行(rt-或實時熒光定量)pcr擴增反應；當引物與模板(突變型)完全互補配對時，高保真dna聚合酶對正向熒光引物進行3’-5’校對，封閉的3’-oh被成功暴露啟動dna合成；當引物與模板(野生型)不完全匹配時，高保真dna聚合酶也將發(fā)揮其3’-5’校對功能，識別正向熒光引物的3’末端封閉基團為錯配信號，利用其3’-5’外切酶活性，切除3’羥基被封閉的核苷，暴露出正常3’羥基，可以在聚合酶催化下形成3-5磷酸二酯鍵，從而進行dna合成(即pcr擴增)。由于體系中高保真酶活性很強，無論熒光引物3’末端與模板完全匹配還是有錯配，高保真酶都將發(fā)揮3’-5’校準功能，將熒光或者淬滅基團進行識別和切割，進而產生高的擴增效率(原理示意圖可參見圖1)。步驟3，通過實時熒光(rt-)pcr擴增曲線的閾循環(huán)數比較或電泳檢測擴增產物。在另一優(yōu)選例中，主要通過熒光定量方法檢測擴增曲線，比較閾循環(huán)數。在本發(fā)明中，除了采用高保真dna聚合酶之外，同時還可以添加或使用少量非高保真dna聚合酶，例如無3’-5’外切酶活性的普通耐熱dna聚合酶，如taqdna聚合酶、tthdna聚合酶等。通常，非高保真dna聚合酶的用量與高保真dna聚合酶用量(按iu計)之比：1/20至1:1或更低，較佳地1/10-4/5，更佳地為1/5-3/5。在本發(fā)明中，非高保真dna聚合酶的用量通常為0-1u/25ul，較佳地0.001-1u/25ul，更佳地0.01-0.2u/25ul，更佳地0.02-0.1u/25ul。此外，在本發(fā)明中，高保真dna聚合酶的用量沒有特別限制，只要能夠進行有效擴增。典型的高保真dna聚合酶的用量為0.3-1u/25ul，較佳地0.4-0.8u/25ul，更佳地0.5-0.7u/25ul。例如，當非高保真dna聚合酶為taq酶，高保真dna聚合酶為q5聚合酶時，可以采用0-0.4u/25ultaq酶并采用0.5u/25ulq5聚合酶。在本發(fā)明中，優(yōu)選添加更可能低的非高保真dna聚合酶(如0.01-0.1u/25ul)，或者不添加非高保真dna聚合酶。在另一優(yōu)選例中，當熒光引物3’末端與模板存在錯配時，存在幾個錯配堿基的情況下，本發(fā)明的擴增效率不受影響。即熒光引物分別與完全互補配對的模板序列(野生型)和與其3’端最后一個或幾個核苷酸存在錯配堿基的模板序列(突變型)反應，檢測熒光引物對野生型和突變型的擴增效率相似。另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)不同的高保真酶對于切割熒光引物封閉3’端的效率有所不同，其中以q5酶的效率最高。dmso及甲酰胺對本方法的靈敏度有一定的提高，而牛凝血酶、四甲基氯化銨等對本方法有抑制作用。當模板是dna時能夠更加靈敏的檢測出模板，而當模板是rna時，檢測的靈敏度將會略低于dna模板。本發(fā)明適用于對高變異病原體的熒光實時定量檢測。高變異性病毒存在多個亞型或基因型以及各種變異株，特異性引物設計困難。利用本發(fā)明進行高變異病原體(如病毒)檢測時，將熒光引物的3’末端設計為與病毒基因組保守序列匹配或者不匹配的任何堿基，可以實現(xiàn)對病毒基因組的有效擴增。該檢測方法可以允許熒光引物3’端與檢測模板存在任何堿基的錯配，容忍病毒基因組的高變異性，減少特異性引物設計難度，提高病毒檢測廣譜性，同時又不損害其檢測的特異性。本發(fā)明的應用本發(fā)明可廣泛用于診斷和非診斷性的檢測，并且可用于檢測各種不同的病原體，如細菌、真菌、病毒等，尤其高變異性的病原體微生物。在另一類優(yōu)選例中，本發(fā)明的檢測是針對食品、病原微生物(細菌、真菌、病毒等)的檢測。此外，本發(fā)明還可以實現(xiàn)對微生物核酸(真菌、細菌和病毒的rna、dna)和基因表達的mrna進行熒光實時定量檢測。此外，本發(fā)明可廣泛用于傳染病病原快速單重和多重檢測及基因表達定量檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點(1)與現(xiàn)有所有應用于病原微生物核酸檢測方法相比，在檢測病原微生物(細菌、病毒等)的核酸檢測過程中引物設計簡單，檢測操作簡便快捷，檢測結果準確可靠。(2)對于高變異病毒的檢測能夠更好的設計引物，解決了病毒高變異區(qū)域難以設計合適引物的問題，對于流行病的檢測(特別是禽流感，hiv等)有非常大的便利性。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。實施例1、基于熒光引物和高保真dna聚合酶體系構建實時熒光rt-pcr檢測h7n9流感病毒選取甲型流感病毒h7n9的ha片段作為rna模板，分別為野生型n9-wt和突變型n9-mu1序列。兩條序列僅存在一個單核苷酸突變位點，突變型相對于野生型僅有一個a→g的點突變。設計正向熒光引物和反向普通引物，其中反向普通引物位于突變位點下游與相應位置野生型和突變型模板完全互補配對；正向熒光引物與野生型模板完全互補配對，且其3’末端位于單核苷酸突變位點處，即與突變型包含錯配(如表1所示)。對正向熒光引物的5’末端可以進行fam修飾，3’末端可以進行bhq1修飾，反向普通正常引物無任何修飾，兩條引物的tm值均為60℃左右。將體外轉錄的n9rna野生型和突變型從107拷貝/μl以10倍梯度依次稀釋至102拷貝/μl，每個rt-pcr反應體系加3μl進行擴增，制作標準曲線，觀察擴增效率。表1引物序列如下：正向熒光引物：5’-fam-atcatcaccgcccacagtgtacaa-bhq1-3’；反向正常引物：5’-acatcctggatttgccatca-3’(seqidno:4)；反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如下：按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應，其中q5酶為neb公司產品(#m0493s)，rtase為生工公司的amvreversetranscriptase(#b500999)。rt-pcr擴增曲線如圖2所示。結果表明，擴增曲線伴隨模板濃度的梯度變化也呈現(xiàn)梯度關系，利用本方法檢測突變體和野生型的擴增效果都很好，動態(tài)線性范圍均在107-102拷貝/μl。實施例2、非高保真dna聚合酶用量對體系的影響選取克隆自甲型流感的ha序列的質粒dna(野生型)，對其進行體外轉錄成rna，以此作為實時熒光定量rt-pcr模板，使用與實施例1中完全相同的一個正向熒光引物和反向普通引物，在體系中加入大量的高保真酶，非高保真dna聚合酶加入不同的量，如0、0.2、0.5、1、1.2、1.5u/25μl的體系，并且加入無核酸酶的水最為陰性對照(ntc)。反應體系如下反應條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應，其中反應體系中的緩沖液，q5高保真酶均為neb公司產品，taqdna聚合酶為天根生物有限公司的產品(fp304)。反應體系中rna模板的量為104拷貝/μl。分析rt-pcr擴增曲線和ct值。結果如圖3所示。根據閾循環(huán)數的比較，當taqdna聚合酶加入量為0-0.5u時，擴增曲線幾乎一樣，當taqdna聚合酶加入量逐漸增加時，會對擴增產生些許抑制。其中，添加少量taq酶或者不加入taq酶，加入0.5u的高保真酶(q5酶最優(yōu)濃度)時，rt-pcr擴增曲線最好，擴增效率最好。實施例3、基于熒光引物與高保真dna聚合酶的檢測體系對不同突變位點的耐受本發(fā)明選取人類基因β-actin(actb)進行pcr擴增和體外轉錄獲得rna標準品(野生型actb-wt)，并設計與其具有僅有單一核苷酸突變(a→g)的突變型模板序列(actb-mu1)，僅有單一核苷酸突變(a→u)的突變型模板序列(actb-mu2)，僅有單一核苷酸突變(a→c)的突變型模板序列(actb-mu3)。分別設計正向熒光引物和反向普通引物，其中反向普通引物位于突變位點下游且與相應位置野生型和突變型模板完全匹配；四種正向熒光引物3’末端則位于點突變處(如表2所示)。分別對正向熒光引物的5’末端進行hex熒光基團修飾，對3’端進行bhq1淬滅基團修飾，反向普通引物5’和3’末端均沒有任何修飾。四種正向熒光引物actb-a-probe、actb-g-probe、actb-t-probe、actb-c-probe分別與四種模板actb-wt、actb-g、actb-u和actb-c完全配對。表2引物序列如下：正向熒光引物：5’-hex-tggacttcgagcaagagatggcca/g/t/c-bhq1-3’；反向正常引物：5’-attgccaatggtgatgacctg-3’(seqidno.19)；反應體系和反應條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應，其中反應體系中的緩沖液，q5高保真酶均為neb公司產品，反應體系中rna模板的量為104拷貝。分析rt-pcr擴增曲線和ct值。結果如圖4所示。根據閾循環(huán)數的比較，說明擴增各種突變模板的效率很相似，可以用于檢測突變位點較多的病毒。另外，還研究了以dna作為初始反應模板進行同樣的研究，結果與之相同。實施例4、正向熒光引物5’末端標記淬滅基團及3’末端標記熒光基團，對于高保真dna聚合酶識別切割及擴增反應效率的影響用克隆自甲型流感的ha序列的質粒dna(野生型和突變型)制備相應rna標準品。將所述rna標準品作為實時熒光定量rt-pcr模板，使用與實施例1中完全相同的一個正向熒光引物和反向普通引物序列，互換正向熒光引物5’-，3’-端修飾基團。此處將正向熒光引物的5’末端進行淬滅基團(bhq1)修飾，3’末端進行熒光基團fam修飾。將rna標準品從106拷貝/μl以10倍梯度依次稀釋至104和103拷貝/μl，每個rt-pcr反應體系加1μl進行擴增，觀察擴增反應效率。按照以下反應體系和程序進行反應。反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應。rt-pcr擴增曲線結果如圖5所示。結果說明，3’端帶有熒光基團修飾更有利于高保真dna聚合酶的識別與切割，也更有利于檢測出不完全配對的突變型樣品，有利于提高檢測的準確性和靈敏度。實施例5、不同高保真dna聚合酶在本發(fā)明中的擴增反應效率差異用克隆自甲型流感的ha序列的質粒dna(野生型和突變型)制備相應rna標準品。將所述rna標準品作為實時熒光定量rt-pcr模板，使用與實施例1中完全相同的一個正向熒光引物和反向普通引物。分別用7種不同的高保真酶體系對n9-mu1模板進行擴增，這7種高保真酶分別為東洋紡(上海)生物科技有限公司的kodfx(kodfx-101)，kodfxneo(kfx-201)，kodplusneo(kod-401)，和blendtaq-plus-(btq-201)，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司的expfudna聚合酶(a161-01，寶生物工程(大連)有限公司的primestarhsdna聚合酶和neb(北京)有限公司的熱啟動超保真2xmastermix(#m0494s)。rna標準品為106拷貝。反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如實施例1。除primestarhsdna聚合酶外，其他的六種dna聚合酶反應時均加入額外的3mmmgcl2。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應，然后將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，所用凝膠為2％瓊脂糖凝膠，分子量標記為購自takara公司的50bpdnaladder(dyeplus)dnamarker(3421a)takaradl2,000dnamarker(d501a)。rt-pcr擴增曲線及產物電泳結果如圖6所示，說明7種高保真dna聚合酶都可以利用熒光引物擴增突變型n9-mu1模板，擴增產物條帶約84bp。通過對rt-pcr反應擴增曲線及閾循環(huán)數的比較發(fā)現(xiàn)，q5擴增時擴增曲線ct值最小，blendtaq，kodfxneo，kodplusneo和primstarhs的擴增曲線ct值幾乎一樣，ct值較高的是expfu和kodfx。實施例6、熒光引物兩端不同熒光基團及淬滅基團修飾組合對于不同高保真dna聚合酶擴增效率的影響用克隆自人類基因β-actin(actb)制備相應rna標準品(野生型actb-wt)，并設計與其具有僅有單一核苷酸突變(a→g)的突變型模板序列(actb-mu1)。分別設計正向熒光引物和反向普通引物，其中反向普通引物位于突變位點下游且與相應位置野生型和突變型模板完全匹配；正向熒光引物3’末端則位于點突變處(如表3所示)。分別對正向熒光引物的5’末端可以進行不同熒光基團修飾，3’末端可以進行相對的不同淬滅基團修飾(如表2所示)，反向普通引物5’和3’末端均沒有任何修飾。選用5種高保真dna聚合酶進行反應：東洋紡(上海)生物科技有限公司的kodplusneo(kod-401)和blendtaq-plus-(btq-201)，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司的expfudna聚合酶(a161-01)，寶生物工程(大連)有限公司的primestarhsdna聚合酶和neb(北京)有限公司的熱啟動超保真2xmastermix(#m0494s)；另外，本實施例還選取了丙型流感病毒(fluc)，副流感病毒4型(piv4)，呼吸道合胞病毒a型(rsva)特定片段作為rt-pcr反應模板，相應的設計了正向熒光引物和反向普通引物。分別對正向熒光引物進行不同熒光基團和淬滅基團的修飾。反應體系和程序如下：表3反向引物序列如下：actb反向正常引物r1：5’-attgccaatggtgatgacctg-3’(seqidno.19)；piv4反向正常引物：5’-attctgatggttggaktctggtg-3’(seqidno.21)；rsva反向正常引物：5’-gccaaggaagcatgcaataaa-3’(seqidno.22)；fluc反向正常引物：5’-ttgccattcgtcccatctctc-3’(seqidno.23)；反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應。rt-pcr擴增曲線如圖7所示，表明5種高保真dna聚合酶都可以切割3’端bhq1，bhq3，eclipse，tamra封閉基團，但不能切割bhq2和mgb修飾基團延伸熒光引物。實施例7、不同長度目的產物對高保真dna聚合酶介導的熒光引物擴增體系的影響選擇如實施例3中所述的rna標準品作為逆轉錄pcr反應模板rna，設計分別帶5’fam修飾和3’tamra修飾的正向熒光引物，設計了兩個反向普通引物，命名為r1和r2。兩個反向普通引物分別與actb-mu1的下游序列完全互補配對。正向熒光引物與r1擴增出95bp產物，與r2擴增出140bp產物。表4seqidno.正向熒光引物序列tggacttcgagcaagagatggcca11反向正常引物序列r1attgccaatggtgatgacctg19反向正常引物序列r2caggaaggaaggctggaaga20反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應。rt-pcr擴增曲線(圖8)表明，待擴增目的產物長度在90-150bp長度范圍內對高保真dna聚合酶擴增效率沒有明顯影響。實施例8、不同pcr反應添加劑的使用對新方法的影響使用與實施例1中完全相同的突變型模板rna序列n9-mu1和反向普通引物。正向熒光引物序列3’末端修飾淬滅基團bhq1，5’末端修飾熒光基團fam。在體系中加入不同濃度不同種類的添加劑(甲酰胺(sigma)、二甲基亞砜(dmso，sigma)、四甲基氯化銨(tamc，sigma)、牛凝血酶(thermfisher)、單鏈結合蛋白(et-ssb，neb))，按照以下反應體系和程序進行反應。反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應。rt-pcr擴增曲線如圖9所示。結果表明：加入以上添加劑，對rt-pcr的擴增促進作用都不強，有些甚至嚴重抑制其擴增。實施例9、對基因表達進行定量檢測使用與實施例3中相同的熒光引物actb-g探針，對從血液中提取出的mrna進行β-actin基因表達定量檢測。分別用本方法和市場上銷售的普通熒光定量試劑盒(如天根一步法qrt-pcr試劑盒貨號：fp304)檢測β-actin基因表達進行比較。按照以下反應體系和程序進行反應：反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應。分析rt-pcr擴增曲線和8個樣本檢測結果如圖10所示。結果表明，本方法可以很好的擴增rna，其檢測效果明顯好于天根試劑盒的檢測效果，兩種方法對8個樣本β-actin基因表達定量檢測無顯著性差異，但是本方法檢測的結果均比普通試劑盒檢測值要高一些，表明本方法檢測樣本準確度更高，可以真實地反應實際情況。實施例10、體系中mgcl2濃度對反應的影響使用與實施例3中相同的熒光引物actb-a探針和actb-r1，分別作為體系的上下游引物，并且以體外轉錄的β-actin的rna為模板。在體系中額外添加終濃度為0、1、2、3和4mm的mgcl2，優(yōu)化體系中mgcl2的濃度。按照以下反應體系和條件進行反應：反應體系如下：反應熱循環(huán)條件如實施例1。按上述反應體系和反應條件在roche96實時熒光定量pcr儀上進行反應。分析rt-pcr擴增曲線(圖11)可知，當體系中額外添加0-4mmmgcl2時，擴增曲線的峰值不斷增高，擴增曲線的ct值均是一致的。由于體系中mgcl2濃度過高可能會導致反應的特異性降低，因此我們最終選取額外添加2-4mmmgcl2來增強反應。即體系中mg2+終濃度為4-6mm(提供的緩沖液中原本mgcl2濃度為2mm)。綜上所述，根據高保真酶存在的3’-5’外切酶活性能夠更豐富的設計特殊引物。因此可以基于熒光引物利用高保真酶和任選的微量非高保真酶對突變位點高或者低的微生物核酸進行定量檢測以及基因表達定量檢測。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學院上海巴斯德研究所<120>用于檢測多種病原體的熒光實時檢測方法及應用<130>p2017-0539<160>23<170>patentinversion3.5<210>1<211>153<212>rna<213>甲型流感病毒<400>1agggaaacacucaaacggaacaauacacgauaggucccaguaucgcgcccugauaagcug60gccacuaucaucaccgcccacaguguacaacagcaggguggaaugcauuggguggucaag120uacuaguugccaugauggcaaauccaggauguc153<210>2<211>153<212>rna<213>突變型n9-mu1<400>2agggaaacacucaaacggaacaauacacgauaggucccaguaucgcgcccugauaagcug60gccacuaucaucaccgcccacaguguacagcagcaggguggaaugcauuggguggucaag120uacuaguugccaugauggcaaauccaggauguc153<210>3<211>24<212>dna<213>引物<400>3atcatcaccgcccacagtgtacaa24<210>4<211>20<212>dna<213>引物<400>4acatcctggatttgccatca20<210>5<211>184<212>rna<213>智人<400>5ggaaaucgugcgugacauuaaggagaagcugugcuacgucgcccuggacuucgagcaaga60gauggccacggcugcuuccagcuccucccuggagaagagcuacgagcugccugacggcca120ggucaucaccauuggcaaugagcgguuccgcugcccugaggcacucuuccagccuuccuu180ccug184<210>6<211>184<212>rna<213>突變型actb-mu1<400>6ggaaaucgugcgugacauuaaggagaagcugugcuacgucgcccuggacuucgagcaaga60gauggccgcggcugcuuccagcuccucccuggagaagagcuacgagcugccugacggcca120ggucaucaccauuggcaaugagcgguuccgcugcccugaggcacucuuccagccuuccuu180ccug184<210>7<211>184<212>rna<213>突變型actb-mu2<400>7ggaaaucgugcgugacauuaaggagaagcugugcuacgucgcccuggacuucgagcaaga60gauggccccggcugcuuccagcuccucccuggagaagagcuacgagcugccugacggcca120ggucaucaccauuggcaaugagcgguuccgcugcccugaggcacucuuccagccuuccuu180ccug184<210>8<211>184<212>rna<213>突變型actb-mu3<400>8ggaaaucgugcgugacauuaaggagaagcugugcuacgucgcccuggacuucgagcaaga60gauggccucggcugcuuccagcuccucccuggagaagagcuacgagcugccugacggcca120ggucaucaccauuggcaaugagcgguuccgcugcccugaggcacucuuccagccuuccuu180ccug184<210>9<211>24<212>dna<213>引物<400>9tggacttcgagcaagagatggcct24<210>10<211>24<212>dna<213>引物<400>10tggacttcgagcaagagatggccg24<210>11<211>24<212>dna<213>引物<400>11tggacttcgagcaagagatggcca24<210>12<211>24<212>dna<213>引物<400>12tggacttcgagcaagagatggccc24<210>13<211>27<212>dna<213>引物<400>13ttctgggatgagtggtgctctggctgt27<210>14<211>18<212>dna<213>引物<400>14tgctattgtgcactaaag18<210>15<211>26<212>dna<213>引物<400>15actggccttggagaagaagcactatc26<210>16<211>94<212>rna<213>副流感病毒4型<400>16agaucacaaugaacuacagaugccagaauuugaaaaugacaucaauccuuucaaucaucc60aagguucacagccagagcaccacucaucccagaa94<210>17<211>67<212>rna<213>呼吸道合胞病毒a型<400>17aauacagccaaaucuaaccaacuuuacacuacuacuucucaucaaauauccuuagugcac60aauagca67<210>18<211>157<212>rna<213>丙型流感病毒<400>18acuggccuuggagaagaagcacuaucucuccaaagacaaacagaaaguuuggccauauua60uguaaucacacuuuuggaaguaauauaaugagaccccacuuggaaaaagcaauaaaagga120guugaaggcagaguuggagagaugggacgaauggcaa157<210>19<211>21<212>dna<213>引物<400>19attgccaatggtgatgacctg21<210>20<211>20<212>dna<213>引物<400>20caggaaggaaggctggaaga20<210>21<211>23<212>dna<213>引物<400>21attctgatggttggaktctggtg23<210>22<211>21<212>dna<213>引物<400>22gccaaggaagcatgcaataaa21<210>23<211>21<212>dna<213>引物<400>23ttgccattcgtcccatctctc21當前第1頁12