一種構(gòu)建EPO基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的方法及引物、質(zhì)粒與制備方法與流程

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于crispr基因敲除技術(shù)構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的方法、引物、質(zhì)粒及質(zhì)粒制備方法。

背景技術(shù)：

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，epo)是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，在抑制原始紅細(xì)胞凋亡、促進(jìn)紅細(xì)胞生成中起到重要作用。近年研究提示，epo在心臟、腎臟、肝臟疾病及糖尿病、高脂血癥等多種代謝綜合癥的發(fā)生發(fā)展中均起到重要調(diào)控作用，在氧化應(yīng)激、抗凋亡方面作用顯著。

由于既往基于鋅脂蛋白、talen等基因編輯技術(shù)制備epo基因敲除存在基因敲除成功率低、步驟復(fù)雜，并且由于epo的作用重要且復(fù)雜，既往研究針對epo基因敲除的動(dòng)物模型由于嚴(yán)重貧血均不能有效存活，導(dǎo)致目前并無可用于科學(xué)研究的epo基因敲除生物模型存在，限制了對epo的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和研究。因此，有必要研究構(gòu)建epo基因敲除的動(dòng)物模型的方法，為研究epo研究提供epo基因敲除的動(dòng)物模型。

crispr是近年來新興的基因編輯技術(shù)，它通過grna引導(dǎo)，利用cas9蛋白操作，從而對多種目標(biāo)細(xì)胞dna進(jìn)行切除，使基因組有效地產(chǎn)生變化或突變，效率比talen等其他傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)更高。已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究分子機(jī)理和致病機(jī)制的重要手段。

斑馬魚作為一種新興的實(shí)驗(yàn)生物，具有繁殖周期短、胚胎數(shù)量多、幼魚身體通過藥物保持透明等技術(shù)優(yōu)勢，被越來越廣泛的運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)各項(xiàng)研究。斑馬魚幼魚在胚胎發(fā)育10天以內(nèi)可通過外界環(huán)境中氧氣獲得生存，對紅細(xì)胞攜氧的依賴較其他動(dòng)物模型更少，因此有可能通過構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚，從而在胚胎時(shí)期對身體各器官進(jìn)行更加全面準(zhǔn)確的觀察及分析。

因此，研究和探討如何基于crispr基因敲除技術(shù)構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型，有助于解決目前并無可用于科學(xué)研究的epo基因敲除生物模型的問題，為epo研究提供epo基因敲除的動(dòng)物模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于crispr基因敲除技術(shù)構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的方法，以便構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型，方便對epo的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和研究。

本發(fā)明的目的還在于提供一種用于構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的引物和質(zhì)粒，以及質(zhì)粒的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種基于crispr基因敲除技術(shù)構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的方法，包括步驟：

1)建立含有epo基因片段靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒；

2)基于crispr基因敲除技術(shù)建立并培育epo基因敲除斑馬魚模型；

其中，步驟1)具體包括：

1-1)針對epo外顯子2區(qū)域靶序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和引物合成，其中，

epo外顯子2區(qū)域靶序列為：catctgtgacctgcgcgt(seqidno.1)；

1-2)合成含有epo基因片段靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒。

優(yōu)選地，在步驟1-1)中，所設(shè)計(jì)和合成的引物為：

前向引物：taggacgcgcaggtcacagatg(seqidno.2)；

逆向引物：aaaccatctgtgacctgcgcgt(seqidno.3)。

優(yōu)選地，步驟2)具體包括：

2-1)提取目標(biāo)dna；

2-2)將目標(biāo)dna逆轉(zhuǎn)錄為epogrna；

2-3)合成cas9rna；

2-4)向斑馬魚受精卵單細(xì)胞中注射epogrna和cas9rna的混合物；

2-5)步驟2-4)所得受精卵培養(yǎng)成為嵌合體斑馬魚，成年嵌合體斑馬魚與野生斑馬魚雜交獲得雜合子斑馬魚，成年雜合子斑馬魚雜交獲得純合子斑馬魚胚胎。

優(yōu)選地，在步驟2-4)與2-5)之間，還包括：在受精48～72小時(shí)后，提取胚胎基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，進(jìn)行基因測序和序列比對，確認(rèn)基因敲除的有效性。

優(yōu)選地，在步驟2-2)中，使用t7transcriptionkit(invitrogen^tm)將目標(biāo)dna逆轉(zhuǎn)錄為epogrna。

優(yōu)選地，在步驟2-3)中，cas9質(zhì)粒來自addgene^tm(plasmid#63154)，使用t7/t3transcriptionkit(invitrogen^tm)合成cas9rna。

優(yōu)選地，在步驟2-4)中，將epogrna與cas9rna混合于0.1mol/lkcl溶質(zhì)中，在斑馬魚受精卵單細(xì)胞進(jìn)行注射；混合后epogrna的濃度為180～220pg/μl，混合后cas9rna的濃度為180～220pg/μl。

一種用于構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的引物，包括：

前向引物：taggacgcgcaggtcacagatg；

逆向引物：aaaccatctgtgacctgcgcgt。

一種用于構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的含有epo靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒，其包括序列：

catctgtgacctgcgcgt。

所述的含有epo靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒的制備方法，包括步驟：

1)合成引物，其中，引物的序列為：

前向引物：taggacgcgcaggtcacagatg；

逆向引物：aaaccatctgtgacctgcgcgt；

2)引物退火：將前向引物和逆向引物的混合物退火，得退火寡聚物；

3)退火寡聚物的限制內(nèi)切，得限制內(nèi)切產(chǎn)物；

4)將限制內(nèi)切產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌中，大腸桿菌隔夜培養(yǎng)；

5)隔夜培養(yǎng)菌群挑選單一菌落隔夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行基因測序，篩選出含有epo基因片段靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明針對epo外顯子2區(qū)域靶序列設(shè)計(jì)和合成出了引物，并借助該引物合成出含有epo基因片段靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒，并最終基于crispr基因敲除技術(shù)建立epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型。本發(fā)明已成功培育出epo基因敲除雜合子斑馬魚成魚，以及基因敲除純合子斑馬魚幼魚。通過基因測序及血紅蛋白染色初步證實(shí)該方法具有較高的基因敲除成功率。本發(fā)明利用crispr技術(shù)敲除epo基因，得到相應(yīng)靶基因修飾的斑馬魚模型，不僅可以加深對epo在基因調(diào)控中的作用認(rèn)識(shí)，同時(shí)可為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和新藥研發(fā)提供高水平的基因模型。

本發(fā)明所提供的質(zhì)粒和引物，可以用于構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型。

附圖說明

圖1為epo基因敲除嵌合體及純合子斑馬魚胚胎基因測序結(jié)果圖示。

圖2為epo基因敲除嵌合體斑馬魚胚胎受精后48h血紅蛋白染色結(jié)果圖。

圖3為斑馬魚存活率圖，其中，epo^+/+為野生型，epo^+/-為雜合子，epo^-/-為純合子；embryopercentage為胚胎比例；2/6/8dpf為受精后2/6/8天；3month為3月成年魚。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

1、epo基因敲除斑馬魚模型的建立

1)建立含有epo基因片段靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒：

1-0)ensemble數(shù)據(jù)庫(http://www.ensembl.org)獲取斑馬魚epo基因序列(ensdart00000020288.9)；

1-1)針對epo基因外顯子2區(qū)域使用zifittargetversion4.2進(jìn)行靶序列選擇和引物設(shè)計(jì)，然后合成所設(shè)計(jì)的引物；

其中，所選擇的epo外顯子2區(qū)域的靶序列如seqidno.1所示，為：

catctgtgacctgcgcgt；

其中，所設(shè)計(jì)和合成的引物為：

前向引物(seqidno.2)taggacgcgcaggtcacagatg

逆向引物(seqidno.3)aaaccatctgtgacctgcgcgt

1-2)合成含有epo基因片段靶序列的大腸桿菌質(zhì)粒；

1-2a)引物退火：2μl前向引物、2μl逆向引物、2μlneb緩沖液、14μl蒸餾水混合，混合物95℃下孵育5min，然后以0.1℃/sec的速度降溫至50℃，50℃下孵育10min，然后以1℃/sec降溫至4℃，得退火寡聚物；

1-2b)限制內(nèi)切：1μl1-2a)所得的退火寡聚物、400ngpt7-grna質(zhì)粒、1μlneb緩沖液、1μlt4dna連接酶、0.5μlbsmbi酶、0.3μlbglii酶、0.3μlsali酶、0.5μlt4連接酶和無dna水混合，混合后總?cè)萘繛?0μl；混合物先在37℃下孵育60min，再在16℃下孵育45min，如此循環(huán)三次；然后混合物升溫至37℃并孵育30min，然后升溫至55℃并孵育30min，再升溫至80℃并孵育15min，降溫至4℃，得限制內(nèi)切產(chǎn)物；

1-2c)將限制內(nèi)切產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌中：大腸桿菌在-80℃冰箱中保存，取出后在冰上放置20～30min，將步驟1-2b)中所合成的限制內(nèi)切產(chǎn)物與50μl大腸桿菌混合，混合物在冰上放置20min，再在42℃水浴中放置90sec，再在冰上放置至少90sec；將以上混合物中加入1mllb培養(yǎng)液在37℃、220rpm恒溫箱培養(yǎng)板進(jìn)行培育45min，然后將以上混合物在4℃離心機(jī)6000rpm離心5min，取離心后上清液900μl，平鋪在lb培養(yǎng)基中，37℃恒溫溫箱隔夜培養(yǎng)。

1-2d)將隔夜培養(yǎng)菌群挑選單一菌落在3ml培養(yǎng)液中，37℃、220rpm隔夜培養(yǎng)；使用getmhealthcareillustrakit提取質(zhì)粒進(jìn)行基因測序；獲得含有目的基因序列(epo外顯子2區(qū)域靶序列：catctgtgacctgcgcgt)的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒；

2)基于crispr基因敲除技術(shù)建立并培育epo基因敲除斑馬魚模型：

2-1)將含有目的序列的陽性質(zhì)粒1～3ug、neb3:1緩沖液5μl、10％bsa5μl、bamhi-hf1μl混合，無dna水將體積調(diào)整為50μl，37℃隔夜水??；加入100ug/ml蛋白酶k0.5μl及0.5％sds2.5μl，在50℃加熱20min，使用qiagentmpcrpurificationkit提取dna，瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證，得目標(biāo)dna；

2-2)使用t7transcriptionkit(invitrogen^tm)將目標(biāo)dna逆轉(zhuǎn)錄為epogrna；使用不含目的epo靶序列的空白質(zhì)粒(即不含有epo外顯子2區(qū)域靶序列的質(zhì)粒)提取對照rna(即無法造成基因敲除的對照序列)；

2-3)cas9質(zhì)粒來自addgene^tm(plasmid#63154)，使用t7/t3transcriptionkit(invitrogen^tm)合成cas9rna；

2-4)將epogrna與cas9rna混合于0.1mol/lkcl溶質(zhì)中，在斑馬魚受精卵單細(xì)胞進(jìn)行注射；混合后epogrna的濃度為200pg/μl，混合后cas9rna的濃度為200pg/μl。使用對照rna與cas9混合注射作為對照觀察組；

在受精72小時(shí)后，提取胚胎基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增。進(jìn)行基因測序，使用clustalw2(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行序列比對，進(jìn)一步明確基因敲除有效性；

2-5)將epogrna注射后獲得嵌合體魚(即含有多種混合基因突變細(xì)胞的嵌合體斑馬魚)培養(yǎng)至3月左右成年魚大小，取魚鰭組織基因測序，將基因測序陽性成年魚與野生背景斑馬魚雜交獲得epo^+/-雜合子斑馬魚，將成年雜合子背景斑馬魚雜交獲得epo^-/-純合子斑馬魚胚胎。通過基因測序結(jié)果判斷純合子基因變異序列。

2、epo基因敲除斑馬魚的血紅蛋白染色及存活率評價(jià)

1)通過基因測序篩選檢測epo^+/-雜合子斑馬魚雜交后純合子胚胎比率(epo^-/-純合子斑馬魚可存活至胚胎第8日)。

如圖1所示，通過對crispr注射后嵌合子和純合子斑馬魚進(jìn)行靶位點(diǎn)pcr引物擴(kuò)增，并且進(jìn)行基因測序，與野生型斑馬魚序列比較，我們發(fā)現(xiàn)：①嵌合子斑馬魚胚胎目的序列受到干擾，可以檢測到多個(gè)堿基信號(hào)；②純合子目的序列中存在taa(逆向序列：tta)終止子基因突變。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)本基因敲除方法的可靠性和有效性。

2)血紅蛋白染色評價(jià)epo基因敲除效率。

如圖2所示，對crispr注射后48hpf(hourspostfertilization)嵌合子斑馬魚進(jìn)行血紅蛋白染色，可發(fā)現(xiàn)，epo基因敲除雜合子斑馬魚與對照組相比，血紅蛋白明顯減少。這提示epo基因敲除可影響斑馬魚造血系統(tǒng)正常發(fā)展，進(jìn)一步證實(shí)本基因敲除方法的有效性。

3)通過對epo^+/-雜合子斑馬魚成魚進(jìn)行交配，獲得含有野生型、雜合子、純合子的胚胎，選取16-24枚胚胎，提取基因組dna，通過pcr提取目的基因片段進(jìn)行基因測序，判斷斑馬魚的基因型為野生型、純合子或雜合子，進(jìn)一步在受精后2天、6天、8天、3月計(jì)算不同基因型斑馬魚的存活率，可以發(fā)現(xiàn)，如圖3所示，其中，epo^+/+為野生型，epo^+/-為雜合子，epo^-/-為純合子；embryopercentage為胚胎比例；2/6/8dpf為受精后2/6/8天；3month為3月成年魚。epo^-/-基因敲除純合子斑馬魚可存活至受精后8日，但無法存活至成年。這一結(jié)果進(jìn)一步評價(jià)了本基因敲除的效率，并且證實(shí)通過本基因敲除方法獲得基因敲除純合子斑馬魚，可進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)觀察至胚胎發(fā)育第8日。

本發(fā)明通過構(gòu)建epogrna，并對斑馬魚胚胎單細(xì)胞器進(jìn)行基因注射，已成功培育出epo基因敲除雜合子斑馬魚成魚，以及基因敲除純合子斑馬魚幼魚。通過基因測序及血紅蛋白染色初步證實(shí)該方法具有較高的基因敲除成功率。

本發(fā)明利用crispr技術(shù)敲除epo基因，得到相應(yīng)靶基因修飾的斑馬魚模型，不僅可以加深對epo在基因調(diào)控中的作用認(rèn)識(shí)，同時(shí)可為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和新藥研發(fā)提供高水平的基因模型。在具體的操作中，利用互聯(lián)網(wǎng)軟件可篩選出合適的epogrna，并同時(shí)預(yù)測脫靶概率及中靶概率，可有效提高基因敲除效率。

核苷酸序列表

<110>西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

<120>一種構(gòu)建epo基因敲除斑馬魚動(dòng)物模型的方法及及引物、質(zhì)粒與制備方法

<160>3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>斑馬魚（barchydanioreriovar）

<400>1

catctgtgacctgcgcgt20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

taggacgcgcaggtcacagatg22

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

aaaccatctgtgacctgcgcgt22