一種異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及一種異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠及其制備方法，屬于材料科學(xué)和工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水凝膠材料是一類重要的生物醫(yī)用材料，在組織工程、藥物輸運(yùn)等領(lǐng)域都具有廣泛應(yīng)用。分層或梯度形式的異質(zhì)水凝膠結(jié)構(gòu)在仿生組織構(gòu)建、藥物可控緩釋等方面起到了重要作用：體內(nèi)廣泛存在著異質(zhì)分層結(jié)構(gòu)，比如球狀的肺泡，管狀的血管、膽管、氣管，片狀的皮膚等組織均具有分層結(jié)構(gòu)；分層水凝膠結(jié)構(gòu)的逐層降解特點(diǎn)在藥物及分子釋放方面則表現(xiàn)著巨大潛力。

2008年，研究者首次報(bào)道了多層凝膠膜的成型(nature.2008；452:76-79.)，它利用聚電解質(zhì)材料反復(fù)在堿性溶液中浸涂，達(dá)到在界面由外向內(nèi)逐層生成凝膠膜的效果。隨后，研究者陸續(xù)報(bào)道了基于酸堿度交聯(lián)(acsapplmaterinterfaces.2014,6(3):1872-1878.acsapplmaterinterfaces.2016,8(11):6880-6889.)、離子交聯(lián)(softmatter.2009,5(10):1987-1989.)等形式的分層凝膠結(jié)構(gòu)。這些方法能做到多達(dá)十幾層的分層凝膠結(jié)構(gòu)，主要集中在洋蔥式的球形、簡單的圓柱形；它們基本局限于一種材料，只是通過分步涂覆或反應(yīng)，產(chǎn)生分層凝膠的效果；由于反應(yīng)條件為強(qiáng)酸強(qiáng)堿以及材料生物相容性的限制，它們在細(xì)胞直接包裹式的生物工程應(yīng)用場景中應(yīng)用較少。

異質(zhì)材料的分層結(jié)構(gòu)，特別是用以仿生血管網(wǎng)絡(luò)的分叉中空管結(jié)構(gòu)，在制備上依然存在較大挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠及其制備方法，本發(fā)明利用交聯(lián)劑或交聯(lián)引發(fā)劑在相界面(固-液或固-固界面)可以進(jìn)行擴(kuò)散，從而激發(fā)交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生并形成凝膠層；具體地，將離子交聯(lián)所依賴的離子裝載在可光交聯(lián)的固相(凝膠相)中，將光交聯(lián)所依賴的光引發(fā)劑裝載在可離子交聯(lián)的液相(溶膠相)中，二者接觸時(shí)，由于離子的擴(kuò)散，使得固-液界面在液相一側(cè)形成明顯的離子交聯(lián)凝膠；在光照的作用下，光引發(fā)劑產(chǎn)生自由基，由于自由基的擴(kuò)散，使得在原始的固相一側(cè)發(fā)生化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，形成一層穩(wěn)定的光交聯(lián)凝膠；原始固相中未發(fā)生化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)的部分可以通過變溫處理溶解，產(chǎn)生空腔結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明所提供的異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備含有水溶性二價(jià)陽離子鹽的溫敏凝膠芯；

所述溫敏凝膠芯具有光交聯(lián)特性；

(2)將所述溫敏凝膠芯浸泡于海藻酸鈉水溶液中，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)即在所述溫敏凝膠芯的表面形成一層海藻酸鹽凝膠；

所述海藻酸鈉水溶液中含有光引發(fā)劑；

(3)將經(jīng)步驟(2)處理后的所述溫敏凝膠芯重復(fù)步驟(2)，即在所述溫敏凝膠芯的表面形成多層所述海藻酸鹽凝膠；

(4)將經(jīng)步驟(3)處理后的所述凝膠芯進(jìn)行光照射，經(jīng)光交聯(lián)反應(yīng)即在所述溫敏凝膠芯與所述海藻酸鹽凝膠的界面處形成光交聯(lián)凝膠層；去除未進(jìn)行所述光交聯(lián)反應(yīng)的所述溫敏凝膠芯材料，即得到所述異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠。

所述的制備方法中，步驟(1)中，所述水溶性二價(jià)陽離子鹽可為氯化鈣、硫酸鈣、氯化鋇、氯化鎂和硫酸鎂中至少一種；

所述溫敏凝膠芯中所述水溶性二價(jià)陽離子鹽的質(zhì)量-體積濃度可為0.001～0.1g/ml，具體可為0.02g/ml。

所述的制備方法中，步驟(1)中，可采用下述方法制備所述溫敏凝膠芯：

①將溫敏溶液澆注到采用金屬、高分子塑料、高分子彈性體等材料制成的模具中(比如可以采用3d打印技術(shù)打印定制化模具)，等待凝膠完成即取出待用。

②用注射器吸取溫敏溶液，等待凝膠完成，截?cái)嘧⑸淦髑岸耍瑢⒛z柱推擠出即得到與注射器內(nèi)部尺寸一致的凝膠芯。

③采用3d打印方法，將溫敏溶液打印成想要的形狀并進(jìn)行凝膠。

所述溫敏凝膠芯可為下述1)或2)

1)由具有光交聯(lián)特性的溫敏凝膠成型得到；

所述具有光交聯(lián)特性的溫敏凝膠指的是既具有可逆溫敏凝膠特性(以便前期形成溫敏凝膠，以及后續(xù)溶出未反應(yīng)的芯)，又具有光交聯(lián)特性，如gelma(甲基丙烯酸酯明膠)，其接枝度可以在10～100％之間，可采用濃度為0.025～0.30g/ml的gelma水溶液成型制備所述溫敏凝膠芯；

2)由溫敏凝膠組分和光交聯(lián)組分的混合物成型得到；

所述溫敏凝膠組分可為明膠、普朗尼克f127、基質(zhì)膠、纖維素衍生物、殼聚糖、木葡聚糖和聚(n-異丙基丙烯酰胺)基材料、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等中任一種；

所述光交聯(lián)組分可為甲基丙烯化透明質(zhì)酸(meha)、聚乙二醇甲基丙烯、gelma及其他甲基丙烯化高分子材料；

上述制備過程中，將所述水溶性二價(jià)陽離子鹽溶于溫敏溶液中即可得到含有水溶性二價(jià)陽離子鹽的溫敏凝膠芯。

所述溫敏凝膠芯中含有如下1)-4)種組分中任一種：

1)膠原、纖維蛋白原、基質(zhì)膠、纖連蛋白、透明質(zhì)酸、明膠、殼聚糖和聚乙二醇中任一種，即天然或合成的蛋白、多糖等成分；

2)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞癌細(xì)胞、各種成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中任一種，即各種哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞或成熟細(xì)胞系；

3)細(xì)菌或病毒；

4)藥物和/或核酸分子，比如抗癌藥物、sirna等；

不同種類的溫敏凝膠，其成型溫度也不同，對于高溫凝膠低溫溶膠的材料，凝膠成型溫度處于較高溫度，如普朗尼克f127的成型溫度可以在20～50℃；如對于不同濃度的gelma溶液或明膠基溶液，采用4℃的成型溫度，均可適用。

所述的制備方法中，步驟(1)中，所述溫敏凝膠芯的形狀如下述1)-3)中任一種：

1)球體、橢球、四面體、六面體和八面體中任一種；

2)呈線狀，具有如下a)-c)中至少一種特點(diǎn)：

a)橫截面為圓形、正方形、梯形、五角星形、多邊形或其他異形封閉圖形；

b)具有單根或多分叉結(jié)構(gòu)；所述多分叉結(jié)構(gòu)的各軸線在二維平面或三維空間內(nèi)；

c)沿軸線方向，橫截面的形狀和/或尺寸發(fā)生變化；

3)呈面狀，表面為平整結(jié)構(gòu)或具有厘米、毫米或微米級別的凸起和/或凹陷的表面幾何形態(tài)。

所述的制備方法中，步驟(2)中，所述海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量-體積濃度可為0.002～0.1g/ml，具體可為0.02g/ml，可采用低粘度、中等粘度或高粘度種類的海藻酸鈉；

所述海藻酸鈉水溶液中所述光引發(fā)劑的質(zhì)量-體積濃度可為0.00005～0.005g/ml，具體可為0.0005g/ml；

可采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的光引發(fā)劑，如選用cibaspecialtychemicals公司系列產(chǎn)品，包括irgacure2959(簡稱i2959)以及irgacure149、184、369、500、651、784、819、907、1700、1800、1850、1173和4265等產(chǎn)品，還包括lap(全稱lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate)等引發(fā)劑。

所述海藻酸鈉水溶液和/或所述溫敏凝膠芯中含有如下1)-4)種組分中任一種：

1)膠原、纖維蛋白原、基質(zhì)膠、纖連蛋白、透明質(zhì)酸、明膠、殼聚糖和聚乙二醇中任一種，即天然或合成的蛋白、多糖等成分；

2)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞癌細(xì)胞、各種成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中任一種，即各種哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞或成熟細(xì)胞系；

3)細(xì)菌或病毒；

4)藥物和/或核酸分子，比如抗癌藥物、sirna等；

如制備多分叉、多層仿生的血管網(wǎng)時(shí)，可在不同層的海藻酸水凝膠中裝載不同的細(xì)胞，如在第一層海藻酸水凝膠中裝載內(nèi)皮細(xì)胞、第二層海藻酸水凝膠中裝載平滑肌細(xì)胞、第三層海藻酸水凝膠中裝載成纖維細(xì)胞；其中所述海藻酸鈉水溶液中混合的細(xì)胞濃度可以在0.0001～20×10⁶個(gè)/ml的范圍內(nèi)。

所述海藻酸鈉水溶液中可含有所述光交聯(lián)組分，當(dāng)形成所述海藻酸鹽凝膠層時(shí)，其中包裹有所述光交聯(lián)組分；當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步的光照時(shí)，所述光交聯(lián)組分能發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)，并在材料相界面上與另一側(cè)的所述溫敏凝膠芯產(chǎn)生連接(光交聯(lián)反應(yīng)鏈生長機(jī)理中，可將不同高分子鏈上的光交聯(lián)基團(tuán)連接成凝膠網(wǎng)絡(luò))，由此使得異質(zhì)層之間形成粘合，這樣形成的海藻酸鹽凝膠層(外層)和光交聯(lián)凝膠層(內(nèi)層)的結(jié)合良好，貼合緊密；當(dāng)所述海藻酸鈉水溶液中不含有所述光交聯(lián)組分時(shí)，則無法在相界面上形成連接，因此異質(zhì)層之間不能形成粘合。異質(zhì)層之間粘合與否根據(jù)具體應(yīng)用而定，例如對于多層血管結(jié)構(gòu)的模擬，粘合有利，對于藥物緩釋，粘合與否可能均可。

所述的制備方法中，步驟(2)中，所述交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間(即所述溫敏凝膠芯浸泡于所述海藻酸鈉水溶液中的時(shí)間)可為1s～10min，時(shí)間越長，水溶性二價(jià)陽離子往外滲透的深度越深，形成的凝膠層或管壁越厚。

重復(fù)所述步驟(2)之前，包括將所述溫敏凝膠芯進(jìn)行如下1)-3)中任一處理的步驟：

1)置于空氣中；

2)浸泡于水中，以清洗掉表面交聯(lián)程度不強(qiáng)的海藻酸，得到更規(guī)則和明顯分層結(jié)構(gòu)；

3)浸泡于所述水溶性二價(jià)陽離子鹽的水溶液中，以補(bǔ)充交聯(lián)劑；

即將所述溫敏凝膠芯(固相)從所述海藻酸鈉水溶液(液相)中取出后進(jìn)行上述處理即中斷反應(yīng)。

重復(fù)步驟(2)時(shí)，可采用同濃度的海藻酸鈉水溶液或裝載了其他組分的同濃度或不同濃度的海藻酸鈉水溶液；再次交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間可以與前一次相同或不同，中斷反應(yīng)的操作可以與前一次相同或不同。

經(jīng)成型的多層海藻酸鹽水凝膠層數(shù)可以1～15層。

所述的制備方法中，步驟(4)中，所述光交聯(lián)反應(yīng)的條件如下：

光照波長為300～780nm；

光照強(qiáng)度為1～1000mw/cm²；

光照時(shí)間越長，得到的所述光交聯(lián)凝膠層越厚。

去除未反應(yīng)的所述溫敏凝膠芯材料的步驟如下：

切除表面形成多層所述海藻酸鹽凝膠及光交聯(lián)凝膠的所述溫敏凝膠芯的首尾端，使所述溫敏凝膠芯未反應(yīng)的內(nèi)部材料溶出；

不同種類的溫敏凝膠，其溶解溫度也不同，如，對于用gelma或明膠基作為溫敏凝膠材料，溶芯溫度可設(shè)置在30～70℃之間；對于用普朗尼克f127作為溫敏凝膠材料，溶芯溫度可設(shè)置在0～15℃；

可以單獨(dú)切除首端或尾端或同時(shí)切除首尾端；對于多分叉結(jié)構(gòu)，切除部位可以是任何一個(gè)或幾個(gè)或所有分叉的尾端；切除操作可以在所述溫敏凝膠芯溶解之前或之后。

本發(fā)明還提供了一種基于預(yù)制血管網(wǎng)的三維組織結(jié)構(gòu)，包括所述異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠和澆注于所述異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠周圍的組織細(xì)胞；

具體可按照如下步驟進(jìn)行制備：

將所述異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠(血管網(wǎng))置于匹配的組織成型腔中，露出灌流培養(yǎng)的進(jìn)出口管口；在血管網(wǎng)周圍，向組織成型腔中成型含特定組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)；

所述組織成型腔可以是一個(gè)具有特定形狀的頂部開口的空腔，用以固定預(yù)制血管網(wǎng)，并成型特定組織；其材質(zhì)可以是abs、pla等塑料或者pdms等彈性體，該成型腔的制造方法可以是鑄造或直接3d打印。

關(guān)于所述成型步驟，可以向所述組織成型腔中直接澆注含細(xì)胞水凝膠或純細(xì)胞溶液；添加的含細(xì)胞成分可以進(jìn)行交聯(lián)處理或不進(jìn)行交聯(lián)處理；還可以向組織成型腔中直接打印特定的組織細(xì)胞，在預(yù)制血管網(wǎng)周圍將不同種類的水凝膠或細(xì)胞打印成不同的結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)組織的生成；組織結(jié)構(gòu)的打印及成型腔的打印可以同時(shí)進(jìn)行；在組織成型過程中，澆注法和3d打印法可以同時(shí)或單獨(dú)進(jìn)行。

所述三維組織結(jié)構(gòu)具有如下優(yōu)點(diǎn)：1)利用預(yù)制仿生血管網(wǎng)，提高了組織的營養(yǎng)輸運(yùn)效率；2)組織拓展性好，根據(jù)目標(biāo)組織的特點(diǎn)，可以進(jìn)行不同仿生血管網(wǎng)絡(luò)的制造；3)結(jié)合預(yù)制仿生血管網(wǎng)及細(xì)胞直接打印技術(shù)，可以在血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上成型異質(zhì)細(xì)胞組分的組織，具有更強(qiáng)的仿生效果。

所述異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠和所述三維組織結(jié)構(gòu)在生物工程中具有潛在的應(yīng)用，如用于：

1)組織及器官的修復(fù)與重建，可以針對心肌、肝臟、腎臟、骨、軟骨等組織工程，進(jìn)行相應(yīng)的組織構(gòu)建；

2)病理模型的研究，基于預(yù)制血管網(wǎng)，可以研究相應(yīng)生理場景下癌癥遷移等病變的規(guī)律；

3)藥物測試，基于預(yù)制血管網(wǎng)，可以模擬藥物的釋放和作用，并基于構(gòu)建的組織模型，檢測特定藥物的作用。

本發(fā)明可用于制備具有復(fù)雜分叉或異形的、壁面具有異質(zhì)分層效果的、可以裝載活細(xì)胞及分子的囊泡狀、中空管狀及片狀結(jié)構(gòu)，即，本發(fā)明以離子交聯(lián)的海藻酸鈉和光交聯(lián)的明膠甲基丙烯酰氯(gelma)為例，通過二價(jià)陽離子和自由基在相界面的擴(kuò)散，引發(fā)相應(yīng)位置發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而形成凝膠層。

本發(fā)明方法操作簡單，制造快速，數(shù)分鐘即可成型多達(dá)10層的水凝膠結(jié)構(gòu)；支持異質(zhì)材料分層結(jié)構(gòu)的快速成型；異質(zhì)分層結(jié)構(gòu)幾何形態(tài)靈活，主要取決于溫敏凝膠芯的幾何形態(tài)，可球狀、管狀、片狀，且可分叉，可變直徑，可變形狀；操作過程所在理化環(huán)境柔和，對細(xì)胞無損傷，多層凝膠結(jié)構(gòu)可支持細(xì)胞、大分子、小分子的裝載，具有廣闊應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備分叉、異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠的流程圖。

圖2為本實(shí)施例制備的具有兩級分叉的、異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠的截面示意圖。

圖3為本發(fā)明制備的囊殼結(jié)構(gòu)的異質(zhì)分層水凝膠的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為本發(fā)明制備的片狀結(jié)構(gòu)的異質(zhì)分層水凝膠的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5為本發(fā)明制備方法所依據(jù)的異質(zhì)材料界面滲透交聯(lián)原理示意圖。

圖6為本發(fā)明制備的異質(zhì)分層中空管的橫截面顯微光鏡照片。

圖7為本發(fā)明制備的無層間粘合的、異質(zhì)分層中空管的橫截面顯微光鏡(左圖)和顯微掃描電鏡照片(右圖)。

圖8為本發(fā)明制備的具有層間粘合的、異質(zhì)分層中空管的橫截面顯微光鏡(左圖)和顯微掃描電鏡照片(右圖)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、兩級分叉的、異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠的制備

按照圖1所示的流程圖進(jìn)行制備。

(1)制備兩級分叉的凝膠芯

用fdm打印機(jī)制造pla材質(zhì)的兩級分叉模具，澆注含有氯化鈣(0.02g/ml)的gelma水溶液，其中g(shù)elma的質(zhì)量-體積濃度為005g/ml，在4℃下進(jìn)行凝膠成型(gelma溶液具有高溫溶解低溫凝膠的特性，該過程可逆)，得到兩級分叉的凝膠芯，直徑為2～3mm。

(2)第一層海藻酸鈣凝膠的制備

在室溫下，將制備的兩級分叉的凝膠芯浸泡在含有i2959光引發(fā)劑的海藻酸鈉水溶液(濃度為0.02g/ml)中，其中光引發(fā)劑的質(zhì)量-體積濃度為0.0005g/ml，等待30s，由于鈣離子(交聯(lián)劑)向海藻酸鈉溶液中的擴(kuò)散并引起交聯(lián)反應(yīng)，取出后的凝膠芯表面即包裹一層海藻酸鈣凝膠，并浸泡在純水中10s，以清洗掉表面交聯(lián)程度不強(qiáng)的海藻酸，得到更規(guī)則和明顯分層結(jié)構(gòu)。

(3)第二層海藻酸鈣凝膠的制備

將包裹一層海藻酸鈣凝膠再次放入含有i2959光引發(fā)劑的海藻酸鈉水溶液(0.02g/ml)中進(jìn)行第二層涂覆，其中光引發(fā)劑的質(zhì)量-體積濃度為0.0005g/ml，交聯(lián)反應(yīng)30s后即在凝膠芯表面包裹上第二層海藻酸鈣凝膠，取出并浸泡在純水中10s。

(4)光交聯(lián)凝膠層的制備

采用波長為320～390nm、光強(qiáng)為7～20mw/cm²的紫外光照步驟(3)處理后的結(jié)構(gòu)，由于自由基的擴(kuò)散，使得凝膠芯由界面向內(nèi)部產(chǎn)生光交聯(lián)反應(yīng)，形成穩(wěn)定凝膠層；將該結(jié)構(gòu)的首尾端切除，露出內(nèi)部的溫敏凝膠芯；將該結(jié)構(gòu)置于37℃下，使得內(nèi)部的未發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)的溫敏凝膠溶解并流出，由此即形成了多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)。

本實(shí)施例制備的具有兩級分叉的、異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠的截面示意圖如圖2所示，其中，1表示外部多層的離子交聯(lián)凝膠層，2表示內(nèi)部的光交聯(lián)凝膠層，3表示芯部空腔。

當(dāng)采用球形和片狀的溫敏凝膠芯結(jié)構(gòu)時(shí)，按照上述方法可分別得到囊殼水凝膠結(jié)構(gòu)和片狀結(jié)構(gòu)的異質(zhì)分層水凝膠結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3和圖4所示。

本發(fā)明制備方法所依據(jù)的異質(zhì)材料界面滲透交聯(lián)原理如圖5所示，左一圖為交聯(lián)反應(yīng)前的狀態(tài)(界面右側(cè)的離子往左側(cè)滲透)，左二圖所示為離子交聯(lián)發(fā)生后在界面左側(cè)形成離子交聯(lián)層，右二圖為光照后界面左側(cè)中的光引發(fā)劑產(chǎn)生自由基，且自由基往界面右側(cè)滲透，右一圖所示為光交聯(lián)發(fā)生后在界面右側(cè)形成光交聯(lián)層。圖標(biāo)：1表示離子交聯(lián)凝膠層，2表示光交聯(lián)凝膠層，4表示含有光引發(fā)劑的、未發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)的高分子溶液(實(shí)例中為添加了i2959的海藻酸鈉溶液)，5表示相界面，6表示含有二價(jià)陽離子的、未發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)的溫敏可逆凝膠(實(shí)例中為添加了鈣離子的gelma凝膠)，7表示二價(jià)陽離子，8表示可發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)的高分子鏈(實(shí)例中為海藻酸鈉)，9表示光引發(fā)劑，10表示光引發(fā)劑受光激發(fā)產(chǎn)生的自由基，11表示可發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)的高分子鏈(實(shí)例中為gelma)。

將溫敏凝膠芯中裝載gelma，按照上述方法得到異質(zhì)分層水凝膠，其橫截面的顯微鏡照片和顯微掃描電鏡照片分別如圖8中的左圖和右圖所示，溫敏凝膠芯中未裝載gelma所制備的異質(zhì)分層水凝膠的橫截面的顯微光鏡照片和顯微掃描電鏡照片分別如圖7中的左圖和右圖所示，圖7中12表示層間空隙，可以看出，圖7中內(nèi)外的光交聯(lián)和離子交聯(lián)凝膠層在形成后發(fā)生明顯的脫離，說明異質(zhì)層之間不存在粘合或粘合性不好；而圖8中內(nèi)外兩層凝膠結(jié)合良好，貼合緊密，未觀察到脫離。原因在于：圖8中原始海藻酸鈉溶液中含有可光交聯(lián)的高分子材料gelma，當(dāng)海藻酸鈉的離子交聯(lián)層形成后，其中包裹有可光交聯(lián)的高分子材料gelma；當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步的光照時(shí)，gelma能發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)，并在材料相界面上與另一側(cè)的凝膠芯材料產(chǎn)生連接(光交聯(lián)反應(yīng)鏈生長機(jī)理中，可將不同高分子鏈上的光交聯(lián)基團(tuán)連接成凝膠網(wǎng)絡(luò))，由此使得異質(zhì)層之間形成粘合；而圖7中原始海藻酸鈉溶液中不含可光交聯(lián)的高分子材料gelma，無法在相界面上形成連接，因此異質(zhì)層之間不能形成粘合。

本發(fā)明考察了光交聯(lián)時(shí)間的影響，如圖6所示的異質(zhì)分層中空管的橫截面顯微光鏡照片，圖中，外部深色層為離子交聯(lián)凝膠層，內(nèi)部白色透明層為光交聯(lián)凝膠層，可以看出，光照時(shí)間越長，內(nèi)部光交聯(lián)層越厚。

實(shí)施例2、兩級分叉的、含細(xì)胞異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠的制備

制備方法與實(shí)施例1中基本相同，不同之處在于：

1)將內(nèi)皮細(xì)胞裝載于溫敏凝膠芯中；

2)第一層海藻酸鈣凝膠的制備步驟中，將凝膠芯浸泡在含平滑肌細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液中(細(xì)胞濃度為10×10⁶個(gè)/ml)，得到第一層平滑肌細(xì)胞凝膠層；

3)第二層海藻酸鈣凝膠的制備步驟中，將凝膠芯浸泡在含成纖維細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液中(細(xì)胞濃度為10×10⁶個(gè)/ml)，得到第二層成纖維細(xì)胞凝膠層。

本實(shí)施例形成的血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、力刺激培養(yǎng)、電刺激培養(yǎng)及用其他生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，或多種培養(yǎng)方式的組合。

實(shí)施例3、含血管網(wǎng)的三維厚組織的構(gòu)建

將實(shí)施例2制備的預(yù)制血管網(wǎng)置于匹配的組織成型腔中，露出灌流培養(yǎng)的進(jìn)出口管口；在血管網(wǎng)周圍，向組織成型腔中成型含特定組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，即通過步驟10制造圍繞該血管網(wǎng)的三維厚組織結(jié)構(gòu)，預(yù)先制造的血管網(wǎng)能為厚組織提供細(xì)胞所必須的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。

本實(shí)施例中，組織成型腔可以是一個(gè)具有特定形狀的頂部開口的空腔，用以固定預(yù)制血管網(wǎng)，并成型特定組織；其材質(zhì)可以是abs、pla等塑料或者pdms等彈性體，該成型腔的制造方法可以是鑄造或直接3d打印。

本實(shí)施例中，組織成型的方式可為：①向組織成型腔中直接澆注含細(xì)胞水凝膠或純細(xì)胞溶液；②添加的含細(xì)胞成分可以進(jìn)行交聯(lián)處理或不進(jìn)行交聯(lián)處理；③向組織成型腔中直接打印特定的組織細(xì)胞，在預(yù)制血管網(wǎng)周圍將不同種類的水凝膠或細(xì)胞打印成不同的結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)組織的生成；④組織結(jié)構(gòu)的打印及成型腔的打印可以同時(shí)進(jìn)行；⑤在組織成型過程中，澆注法和3d打印法可以同時(shí)或單獨(dú)進(jìn)行。

通過含血管網(wǎng)的三維厚組織的構(gòu)建，可以利用預(yù)制仿生血管網(wǎng)，提高組織的營養(yǎng)輸運(yùn)效率；組織拓展性好，根據(jù)目標(biāo)組織的特點(diǎn)，可以進(jìn)行不同仿生血管網(wǎng)絡(luò)的制造；結(jié)合預(yù)制仿生血管網(wǎng)及細(xì)胞直接打印技術(shù)，可以在血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上成型異質(zhì)細(xì)胞組分的組織，具有更強(qiáng)的仿生效果。

綜上，本發(fā)明制備的預(yù)制血管網(wǎng)(如兩級分叉的、(細(xì)胞)異質(zhì)多層結(jié)構(gòu)的水凝膠)以及基于預(yù)制血管網(wǎng)的三維厚組織可應(yīng)用于如下方面：

1)組織及器官的修復(fù)與重建，如可針對心肌、肝臟、腎臟、骨、軟骨等組織工程，進(jìn)行相應(yīng)的組織構(gòu)建；

2)病理模型的研究，如基于預(yù)制血管網(wǎng)，可研究相應(yīng)生理場景下癌癥遷移等病變的規(guī)律；

3)藥物測試，如基于預(yù)制血管網(wǎng)，可模擬藥物的釋放和作用，并基于構(gòu)建的組織模型，檢測特定藥物的作用。