本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素是糖胺聚糖的一種，由d-葡糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的重復(fù)二糖單位組成的多糖，并在n-乙酰氨基半乳糖的c-4位或c-6位羥基上發(fā)生硫酸酯化。根據(jù)硫酸基在半乳糖上位置不同、以及化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)差異，可分為a、b、c、d、e、f、h等多種，通常從哺乳動(dòng)物組織中提取得到的硫酸軟骨素以硫酸軟骨素a(cs-a)、和硫酸軟骨素c(cs-c)為主。
硫酸軟骨素是一類重要的生物高分子，具有廣泛的生物活性，其作為安全有效的保健食品和藥品在世界各國得到了廣泛應(yīng)用。硫酸軟骨素的生物活性主要包括：鎮(zhèn)痛抗炎作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增生、誘導(dǎo)新骨形成作用，抗腫瘤作用，抗粘連作用，免疫調(diào)節(jié)作用，調(diào)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，抗氧化、清除自由基和廷緩衰老的作用；除此之外，cs還具有抗炎、抗病毒、抗過敏和加速傷口愈合的作用，如抗hiv活性等。在歐、美、日等發(fā)達(dá)國家，硫酸軟骨素作為保健品長期應(yīng)用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗塞、冠狀動(dòng)脈機(jī)能不全、心肌缺血等疾病，并且無明顯的毒副作用，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率。
目前，傳統(tǒng)的生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法主要是以堿法和酶法提取法從豬、牛、雞、鯊魚等動(dòng)物軟骨中提取獲得，傳統(tǒng)生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法存在原材料匱乏、不容易形成規(guī)模、收集原料的成本高、質(zhì)量不穩(wěn)定、純度不好控制、提取復(fù)雜、生產(chǎn)造成污染等諸多問題。近幾年，國外不斷有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)一些菌株可發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素的類似物，微生物發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素或軟骨素類似物的研究越來越受到人們的關(guān)注。發(fā)酵法生產(chǎn)cs不受原材料限制，具有發(fā)酵成本低、環(huán)境污染小的優(yōu)勢，成為最具經(jīng)濟(jì)效益和開發(fā)潛力的硫酸軟骨素生產(chǎn)方法。但是，發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的研究尚處于初級(jí)階段，硫酸軟骨素的產(chǎn)量依然較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中硫酸軟骨素產(chǎn)量較低的問題。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所述的發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，包括如下步驟：
(1)取巨大芽孢桿菌株接種至種子液培養(yǎng)基中進(jìn)行種子活化培養(yǎng)，得到巨大芽孢桿菌種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，包括：葡糖糖40-60g/l、k2hpo49-10g/l、kh2po41.5-2.5g/l、酵母提取物12-18g/l、檸檬酸三鈉0.3-0.8g/l、(nh4)2so40.8-1.2g/l、mgcl20.05-0.2g/l，初始ph7.4-7.6，滅菌，備用；
(3)將步驟(1)所得巨大芽孢桿菌種子液接種至步驟(2)所得發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35-40℃進(jìn)行發(fā)酵，得到含硫酸軟骨素發(fā)酵液。
所述步驟(3)中，所述發(fā)酵步驟中，控制通氣量為30-35m3/h，維持壓力0.08mpa，并在溶氧低于70時(shí)，調(diào)整壓力為0.1mpa。
所述步驟(1)中，所述種子液培養(yǎng)基包括：葡糖糖8-12g/l、k2hpo49.5-10g/l、kh2po41.5-2.5g/l、酵母提取物1.5-2.5g/l、檸檬酸三鈉0.3-0.8g/l、(nh4)2so40.8-1.2g/l、mgcl20.05-0.2g/l，初始ph7.4-7.6，滅菌，備用。
所述步驟(3)中，還包括將葡萄糖酸桿菌種子液接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟。
所述步驟(3)中，所述葡萄糖酸桿菌種子液的接種是在所述巨大芽孢桿菌種子液接種后2-4h加入。
所述葡萄糖酸桿菌種子液是將所述葡萄糖酸桿菌接種至與步驟(1)中相同的種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)得到。
所述步驟(3)中，所述巨大芽孢桿菌種子液的接種量為4-6v/v％，所述葡萄糖酸桿菌種子液的接種量為2-3v/v％。
所述步驟(3)之后，還包括對(duì)所得含硫酸軟骨素發(fā)酵液進(jìn)行純化提取的步驟，具體包括：
(4)酶解：取所得發(fā)酵液固液分離并收集濾液，調(diào)節(jié)濾液ph9.5-10，并加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解處理；隨后將酶解后的料液過濾，并用50k卷膜進(jìn)行超濾處理，至濾液電導(dǎo)率降至2-3.5ms/cm，備用；
(5)酸解：將超濾處理后的料液轉(zhuǎn)移至酸解罐內(nèi)，升溫至85-90℃，調(diào)節(jié)ph2.3-2.5，至料液出現(xiàn)大量沉淀物，隨后過濾收集料液，調(diào)節(jié)料液ph至中性，并用30k板式超濾膜進(jìn)行超濾處理，至濾液電導(dǎo)率降至0.9ms/cm，備用；
(6)堿解：將所得料液升溫至50-55℃，調(diào)節(jié)ph11-12，并加入雙氧水保溫處理4-5h，以氧化去除所含內(nèi)毒素；
(7)精制：將所得料液加酒精進(jìn)行沉淀，脫水后進(jìn)行抽濾處理，收集軟骨素固體，真空干燥，收集軟骨素粉末，保存。
所述步驟(4)中，還包括在固液分離后將所得濾液冷卻至0℃并保溫30-60min的步驟，隨后自然解凍至室溫。
所述步驟(4)中，還包括在堿性蛋白酶酶解后，加入蛋白酶k繼續(xù)酶解10-20min的步驟。
本發(fā)明所述發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，以巨大芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，通過精心篩選的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液中硫酸軟骨素的含量較高。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，利用葡萄糖酸桿菌與所述巨大芽孢桿菌進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵，并優(yōu)選在所述巨大芽孢桿菌接種后接入所述葡萄糖酸桿菌，進(jìn)一步大幅提高了所述硫酸軟骨素的產(chǎn)量，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，單獨(dú)使用葡萄糖酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的方式，幾乎不產(chǎn)生硫酸軟骨素，可見，本發(fā)明方法利用葡萄糖酸桿菌的輔助發(fā)酵方式，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。
本發(fā)明所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，利用現(xiàn)有酶解-酸解-堿解的方法進(jìn)行硫酸軟骨素目標(biāo)產(chǎn)物的純化提取，所得純化產(chǎn)品的收率較高。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述方法，在所述提取方法中利用蛋白酶k共同進(jìn)行酶解純化提取，進(jìn)一步提高了目標(biāo)產(chǎn)物的收率。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
本實(shí)施例所述的發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，具體包括如下步驟：
(1)配制種子液培養(yǎng)基包括：葡糖糖8g/l、k2hpo410g/l、kh2po41.5g/l、酵母提取物2.5g/l、檸檬酸三鈉0.3g/l、(nh4)2so41.2g/l、mgcl20.05g/l，調(diào)初始ph7.6；
按照上述原料所示，配制搖瓶培養(yǎng)基3l，其中葡萄糖溶液單獨(dú)配制，隨后將培養(yǎng)基溶液轉(zhuǎn)移至5l三角瓶內(nèi)，葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移至500ml三角瓶內(nèi)，瓶口用8層紗布和一層牛皮紙密封，將培養(yǎng)基置于滅菌鍋內(nèi)，設(shè)置滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為30min；
滅菌結(jié)束后，將培養(yǎng)基與葡萄糖溶液置于無菌操作臺(tái)中冷卻至室溫，在無菌操作臺(tái)中，將葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基溶液中，并取巨大芽孢桿菌株接種至所得種子液培養(yǎng)基中，接種結(jié)束后，用8層紗布密封搖瓶，將搖瓶置于搖床內(nèi)，設(shè)置溫度35℃，培養(yǎng)時(shí)間9h，得到巨大芽孢桿菌種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，包括：葡糖糖40g/l、k2hpo410g/l、kh2po41.5g/l、酵母提取物18g/l、檸檬酸三鈉0.3g/l、(nh4)2so41.2g/l、mgcl20.05g/l，控制初始ph7.6；
根據(jù)上述原料，將葡萄糖置于滅菌罐內(nèi)配置成80l溶液，并滅菌，滅菌溫度為118℃，滅菌時(shí)間為30min，將剩余培養(yǎng)基原料置于500l發(fā)酵罐內(nèi)，配置成200l溶液，并滅菌，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為30min，滅菌結(jié)束后，將葡萄糖溶液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐內(nèi)，在罐內(nèi)維持正壓力，冷卻至35℃，備用；
(3)將步驟(1)中所得巨大芽孢桿菌種子液，按照4v/v％的接種量接種至步驟(2)所得發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)整發(fā)酵罐內(nèi)溶液初始ph7.6，以氨水維持發(fā)酵液ph值7.6，控制發(fā)酵罐保溫37℃進(jìn)行發(fā)酵，過程中調(diào)整通氣量為30m3/h，維持壓力0.08mpa，在溶氧低于70時(shí)，調(diào)整壓力為0.1mpa；于接種后開始計(jì)時(shí)，每小時(shí)測發(fā)酵液od600，并在發(fā)酵液ph和溶氧開始上升時(shí)，再次計(jì)時(shí)，并維持該狀態(tài)4.5h，該過程為產(chǎn)物積累時(shí)間，得到含硫酸軟骨素發(fā)酵液。
實(shí)施例2
本發(fā)明所述的發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，包括如下步驟：
(1)配制種子液培養(yǎng)基包括：葡糖糖12g/l、k2hpo49.5g/l、kh2po42.5g/l、酵母提取物1.5g/l、檸檬酸三鈉0.8g/l、(nh4)2so40.8g/l、mgcl20.2g/l，調(diào)初始ph7.4，配制及滅菌方法同實(shí)施例1；
取巨大芽孢桿菌株接種至上述種子液培養(yǎng)基中進(jìn)行種子活化培養(yǎng)，設(shè)置溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間9h，得到巨大芽孢桿菌種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，包括：葡糖糖40g/l、k2hpo49g/l、kh2po42.5g/l、酵母提取物12g/l、檸檬酸三鈉0.8g/l、(nh4)2so40.8g/l、mgcl20.2g/l，初始ph7.4，滅菌，備用，配制及滅菌方法同實(shí)施例1；
(3)將步驟(1)中所得巨大芽孢桿菌種子液，按照6v/v％的接種量接種至步驟(2)所得發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)整發(fā)酵罐內(nèi)溶液初始ph7.4，以氨水維持發(fā)酵液ph值7.4，控制發(fā)酵罐保溫40℃進(jìn)行發(fā)酵，過程中調(diào)整通氣量為35m3/h，維持壓力0.08mpa，在溶氧低于70時(shí)，調(diào)整壓力為0.1mpa；于接種后開始計(jì)時(shí)，每小時(shí)測發(fā)酵液od600，并在發(fā)酵液ph和溶氧開始上升時(shí)，再次計(jì)時(shí)，并維持該狀態(tài)4.5h，該過程為產(chǎn)物積累時(shí)間，得到含硫酸軟骨素發(fā)酵液。
實(shí)施例3
本發(fā)明所述的發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，包括如下步驟：
(1)配制種子液培養(yǎng)基包括：葡糖糖10g/l、k2hpo49.7g/l、kh2po42.0g/l、酵母提取物2.0g/l、檸檬酸三鈉0.5g/l、(nh4)2so41.0g/l、mgcl20.1g/l，調(diào)初始ph7.5，配制及滅菌方法同實(shí)施例1；
取巨大芽孢桿菌株接種至種子液培養(yǎng)基中進(jìn)行種子活化培養(yǎng)，設(shè)置溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間9h，得到巨大芽孢桿菌種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，包括：葡糖糖40g/l、k2hpo49.7g/l、kh2po42g/l、酵母提取物15g/l、檸檬酸三鈉0.5g/l、(nh4)2so41.0g/l、mgcl20.1g/l，初始ph7.5，滅菌，備用，配制及滅菌方法同實(shí)施例1；
(3)將步驟(1)中所得巨大芽孢桿菌種子液，按照5v/v％的接種量接種至步驟(2)所得發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)整發(fā)酵罐內(nèi)溶液初始ph7.5，以氨水維持發(fā)酵液ph值7.5，控制發(fā)酵罐保溫37℃進(jìn)行發(fā)酵，過程中調(diào)整通氣量為32.7m3/h，維持壓力0.08mpa，在溶氧低于70時(shí)，調(diào)整壓力為0.1mpa；于接種后開始計(jì)時(shí)，每小時(shí)測發(fā)酵液od600，并在發(fā)酵液ph和溶氧開始上升時(shí)，再次計(jì)時(shí)，并維持該狀態(tài)4.5h，該過程為產(chǎn)物積累時(shí)間，得到含硫酸軟骨素發(fā)酵液。
實(shí)施例4
本實(shí)施例所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例3，其區(qū)別僅在于，所述步驟(3)中，還包括取葡萄糖酸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵的步驟，具體的，取葡萄糖酸桿菌接種至與步驟(1)中相同的種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，得到葡萄糖酸桿菌種子液，并在接種所述巨大芽孢桿菌種子液的同時(shí)，按照2v/v％的接種量將所述葡萄糖酸桿菌種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。
實(shí)施例5
本實(shí)施例所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例3，其區(qū)別僅在于，所述步驟(3)中，還包括取葡萄糖酸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵的步驟，具體的，取葡萄糖酸桿菌接種至與步驟(1)中相同的種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，得到葡萄糖酸桿菌種子液，并在接種所述巨大芽孢桿菌種子液之后2h，按照3v/v％的接種量將所述葡萄糖酸桿菌種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。
實(shí)施例6
本實(shí)施例所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例3，其區(qū)別僅在于，所述步驟(3)中，還包括取葡萄糖酸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵的步驟，具體的，取葡萄糖酸桿菌接種至與步驟(1)中相同的種子培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，得到葡萄糖酸桿菌種子液，并在接種所述巨大芽孢桿菌種子液之后4h，按照3v/v％的接種量將所述葡萄糖酸桿菌種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中。
對(duì)比例1
本對(duì)比例所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例3，其區(qū)別僅在于，所述發(fā)酵過程采用葡萄糖酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵。
實(shí)施例發(fā)酵液中硫酸軟骨素含量測定
1、硫酸軟骨素產(chǎn)量的測定方法
本發(fā)明對(duì)所得發(fā)酵液中硫酸軟骨素含量的測定采用現(xiàn)有技術(shù)種方法進(jìn)行，具體參照中國專利cn102220270a中方法進(jìn)行，具體操作為：取待檢測發(fā)酵液于3000rpm離心30min，收集上清液，并以鯊魚硫酸軟骨素作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制100、200、300、400、500mg/l的標(biāo)準(zhǔn)溶液；將上清液與標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，用高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量。
色譜條件：
色譜柱：150mmzorbaxsb-aq；
流動(dòng)相：乙腈-2.28mmol/l四甲基氯化銨水溶液(體積比為10：90)，用0.45μm濾膜過濾；
柱溫：25℃；
檢測波長：195nm；
進(jìn)樣量：10μl；
流速：0.5ml/min。
擬合回歸方程y＝0.1469x-1.5009，r2＝0.9990，標(biāo)準(zhǔn)曲線在100-500mg/l之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，以此檢測發(fā)酵液中硫酸軟骨素的含量。
2、發(fā)酵液硫酸軟骨素含量檢測結(jié)果
按照上述檢測方法對(duì)實(shí)施例1-6中發(fā)酵所得發(fā)酵液中的硫酸軟骨素含量進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果于下表1。
表1發(fā)酵液中的硫酸軟骨素含量
從上述數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，利用巨大芽孢桿菌和葡萄糖酸桿菌聯(lián)合發(fā)酵，有效提高了發(fā)酵液中硫酸軟骨素的含量。
實(shí)施例7
本實(shí)施例所述純化提取發(fā)酵液中硫酸軟骨素的方法，具體包括如下步驟：
(4)酶解：取實(shí)施例5所得發(fā)酵液，以離心機(jī)固液分離并收集料液，離心結(jié)束后，將料液用0.22μm過濾板過濾，收集濾液，并調(diào)節(jié)濾液ph9.5-10，并加入占所述濾液體積0.5v/v％的堿性蛋白酶進(jìn)行酶解處理3h；隨后將酶解后的料液用0.22μm過濾板過濾，并用50k卷膜進(jìn)行超濾處理，當(dāng)料液濃縮至50l時(shí)，進(jìn)行等體積超濾，直至濾液電導(dǎo)率降至2-3.5ms/cm，將料液濃縮至40-50l，備用；
(5)酸解：將超濾處理后的料液轉(zhuǎn)移至酸解罐內(nèi)，升溫至85-90℃，調(diào)節(jié)ph2.3-2.5，維持該溫度至料液出現(xiàn)大量沉淀物，隨后冷卻料液，用0.22μm過濾板過濾，收集料液并調(diào)節(jié)料液ph7.0，并用30k板式超濾膜進(jìn)行超濾處理，當(dāng)料液濃縮至5-6l時(shí)，進(jìn)行等體積超濾，直至濾液電導(dǎo)率降至0.9ms/cm以下時(shí)，將料液濃縮至4-5l，備用；
(6)堿解：將所得料液升溫至55℃，調(diào)節(jié)ph＝12，并加入占料液體積0.6v/v％的雙氧水保溫處理4-5h，以氧化去除所含內(nèi)毒素；
(7)精制：將所得料液無菌操作臺(tái)內(nèi)，用原料酒精進(jìn)行沉淀，上清酒精控制在65-70度，用原料酒精進(jìn)行脫水，至上清酒精大于90度；脫水后，用沙芯漏斗進(jìn)行抽濾，收集軟骨素固體，并用真空干燥箱進(jìn)行烘干，烘干溫度為65℃，烘干后收集軟骨素粉末，置于4℃冰箱中保存。
稱取所得軟骨素粉末量，計(jì)算單位體積發(fā)酵液所提取硫酸軟骨素的提取量為755mg/l，計(jì)算硫酸軟骨素的產(chǎn)物收率為81％。
實(shí)施例8
本實(shí)施例所述純化提取發(fā)酵液中硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例7，其區(qū)別僅在于，所述步驟(4)中，還包括在固液分離后調(diào)節(jié)ph步驟前，將所得濾液冷卻至0℃并保溫30min的步驟，隨后自然解凍至室溫，再進(jìn)行ph調(diào)節(jié)。
稱取所得軟骨素粉末量，計(jì)算單位體積發(fā)酵液所提取硫酸軟骨素的提取量為792mg/l，計(jì)算硫酸軟骨素的產(chǎn)物收率為85％。
實(shí)施例9
本實(shí)施例所述純化提取發(fā)酵液中硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例7，其區(qū)別僅在于，所述步驟(4)中，還包括在固液分離后調(diào)節(jié)ph步驟前，將所得濾液冷卻至0℃并保溫60min的步驟，隨后自然解凍至室溫，再進(jìn)行ph調(diào)節(jié)。
稱取所得軟骨素粉末量，計(jì)算單位體積發(fā)酵液所提取硫酸軟骨素的提取量為802mg/l，計(jì)算硫酸軟骨素的產(chǎn)物收率為86％。
實(shí)施例10
本實(shí)施例所述純化提取發(fā)酵液中硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例9，其區(qū)別僅在于，所述步驟(4)中，還包括在堿性蛋白酶酶解后，加入占所述濾液體積0.5v/v％的蛋白酶k繼續(xù)酶解10min的步驟。
稱取所得軟骨素粉末量，計(jì)算單位體積發(fā)酵液所提取硫酸軟骨素的提取量為857mg/l，計(jì)算硫酸軟骨素的產(chǎn)物收率為92％。
實(shí)施例11
本實(shí)施例所述純化提取發(fā)酵液中硫酸軟骨素的方法同實(shí)施例9，其區(qū)別僅在于，所述步驟(4)中，還包括在堿性蛋白酶酶解后，加入占所述濾液體積0.5v/v％的蛋白酶k繼續(xù)酶解20min的步驟。
稱取所得軟骨素粉末量，計(jì)算單位體積發(fā)酵液所提取硫酸軟骨素的提取量為876mg/l，計(jì)算硫酸軟骨素的產(chǎn)物收率為94％。
從上述數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明所述生產(chǎn)硫酸軟骨素的方法，可有效提高發(fā)酵液中硫酸軟骨素的產(chǎn)物收率。
顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。