本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學手段檢測致病菌的方法，具體為一種用于檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分子標記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌是水產(chǎn)品中引起食物中毒的重要病原菌之一，在海產(chǎn)品中的攜帶率高達45。7％。在我國沿海地區(qū)，由副溶血弧菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒事件首位，其中也包括臺灣??；在日本，由該菌引起的食物中毒占第二位。所以，副溶血弧菌是食品安全檢測中的一項重要指標。但目前法定的副溶血弧菌檢測方法仍然是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，操作繁瑣、費時、費力，常常需要5～6天才能完成，而且鑒定副溶血弧菌的生化指標非常不穩(wěn)定，常常需要重復(fù)實驗才能最終確定是否為副溶血弧菌，此類方法已不能滿足目前對大量食品樣品快速檢測的需求，急切需要建立一種快速、有效的檢測方法。
基于聚合酶鏈式反應(yīng)的檢測方法具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點，因此，日益受到重視，并逐漸開始應(yīng)用于副溶血弧菌的檢測。檢測靶點是分子檢測方法的關(guān)鍵，目前，用于副溶血弧菌pcr檢測的靶點在其他弧菌中也普遍存在，且同源性非常高，極易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。此外，pcr檢測還易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這主要是由于抑制劑的存在等因素造成的。pcr技術(shù)雖然在不斷的得到發(fā)展與改進，但目前仍然沒有找到消除抑制劑的有效方法，極大程度上限制了該技術(shù)在實際檢測工作中的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種能夠避免水產(chǎn)品中副溶血弧菌檢測過程中出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準確性，本發(fā)明提供了一種用于檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分子標記及其應(yīng)用。
技術(shù)方案：一種用于檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優(yōu)選的，所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。
表1分子標記序列
所述的分子標記在制備檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌試劑盒中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
優(yōu)選的，所述試劑盒檢測水產(chǎn)品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產(chǎn)品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50～500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10～50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
優(yōu)選的，所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
優(yōu)選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標記具有特異性好的優(yōu)點，能夠避免水產(chǎn)品中副溶血弧菌檢測過程中出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，提高檢測結(jié)果的準確性；(2)本發(fā)明所述分子標記靈敏度高，提高了pcr檢測副溶血弧菌的可信度，為水產(chǎn)品中副溶血弧菌的檢測提供方便、準確、有效的方法。
附圖說明
圖1是實施例1～3檢測結(jié)果圖；
其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；2為實施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。
具體實施方式
實施例1
一種用于檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在制備檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測水產(chǎn)品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產(chǎn)品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
實施例2
一種用于檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在制備檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測水產(chǎn)品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產(chǎn)品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋250倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋25倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
實施例3
一種用于檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在制備檢測水產(chǎn)品中副溶血弧菌試劑盒中的應(yīng)用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測水產(chǎn)品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產(chǎn)品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋500倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。
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