一種快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的方法和試劑盒與流程

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。涉及熒光pcr技術(shù)；涉及一種肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變位點(diǎn)(a2063g)的檢測(cè)方法；還涉及使用該方法進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。

背景技術(shù)：

肺炎支原體(mycoplasmalpneumonia,mp)感染可引起包括上呼吸道感染、氣管支氣管炎、肺炎等臨床疾病。發(fā)病率以青少年最高，尤其是學(xué)齡期前后的兒童對(duì)肺炎支原體更易感。肺炎支原體感染占兒童社區(qū)獲得性肺炎的10％～40％。有研究表明，亞洲肺炎支原體在成人社區(qū)獲得性肺炎中占11.4％。近年來(lái),多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道肺炎支原體的感染率和耐藥率都有所升高,嚴(yán)重危害兒童和青少年的健康。研究顯示肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥嚴(yán)重。主要耐藥機(jī)制為23srrna上a2063g位點(diǎn)突變。所以，發(fā)病早期迅速檢測(cè)肺炎支原體及其是否耐藥，對(duì)臨床治療具有重要意義。

肺炎支原體潛伏期約為2-3周。臨床癥狀較輕且不典型。目前，對(duì)肺炎支原體的檢測(cè)主要方法有培養(yǎng)法、冷凝集試驗(yàn)法、elisa法和pcr法。而針對(duì)肺炎支原體耐藥性的檢測(cè)則主要是基于培養(yǎng)法的藥敏試驗(yàn)法。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法雖然結(jié)果可靠，但試驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)，且操作復(fù)雜，試驗(yàn)室要求高，對(duì)臨床早期診斷指導(dǎo)意義有限；冷凝集試驗(yàn)依賴?yán)淠氐牧?，但發(fā)病初期冷凝集素量少，該方法易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，并且部分其他疾病也有冷凝集素產(chǎn)生；elisa試驗(yàn)針對(duì)特異性抗體，但發(fā)病初期抗體量少，甚至部分個(gè)體無(wú)抗體，檢測(cè)結(jié)果靈敏度差，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；pcr方法靈敏度高，準(zhǔn)確度高，但傳統(tǒng)pcr方法需要電泳檢測(cè)，易出現(xiàn)樣本污染，不易操作。對(duì)肺炎支原體耐藥的檢測(cè)一般使用藥敏方法，該方法操作復(fù)雜，用時(shí)較長(zhǎng)。

熒光pcr方法特異性和敏感性都優(yōu)于傳統(tǒng)pcr技術(shù)，閉管檢測(cè)，減少污染，檢測(cè)速度快，結(jié)果易讀。

為此，有必要設(shè)計(jì)一種新型的試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)肺炎支原體及其耐藥性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供一種快速核酸檢測(cè)肺炎支原體的試劑，用來(lái)克服現(xiàn)有檢測(cè)試劑盒檢測(cè)速度慢、準(zhǔn)確性低的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的試劑，所述試劑包括第一試劑和第二試劑，所述第一試劑和第二試劑中均由體系液和引物組成，所述體系液中含有終濃度為以下的各物質(zhì)：1×q5buffer、200μmdntp、evagreen0.6μm、1×rox、bsa0.2-0.8mg/ml、甜菜堿0.2-0.8m、q5高保真酶0.1-0.5u/μl、純水，所述第一試劑中含有肺炎支原體檢測(cè)引物，所述第二試劑中含有耐藥性檢測(cè)引物。

dntp，deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脫氧核糖核苷三磷酸)的縮寫(xiě)。是包括datp,dgtp,dttp,dctp,等在內(nèi)的統(tǒng)稱，n是指含氮堿基，代表變量指代a、t、g、c、u等中的一種。在生物dna合成中，以及各種pcr(rt-pcr(reversetranscriptionpcr)、real-timepcr)中起原料作用。在pcr反應(yīng)中,使用低dntp濃度,可減少非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)的核苷酸錯(cuò)誤摻入。一般可根據(jù)靶序列的長(zhǎng)度和組成來(lái)決定最低dntp濃度。例如在100μl的反應(yīng)體系中,4種dntp的濃度為20μmol/l,可基本滿足合成2.6μgdna或10pmol/l的400bp序列。

evagreen是一種染料，它是biotium公司研發(fā)的新一代dna結(jié)合染料，它同時(shí)適合于實(shí)時(shí)定量pcr以及高分辨率熔解曲線分析(hrm)。這種染料通過(guò)一種被稱為“按要求釋放”的全新機(jī)制，選擇性結(jié)合雙鏈dna，從而大大降低了染料對(duì)pcr反應(yīng)的抑制作用。其具有的另一個(gè)重要的特性是安全、無(wú)毒。

甜菜堿是一種生物堿，具有強(qiáng)烈的吸濕性能，所以在制作工藝中經(jīng)常會(huì)使用抗結(jié)塊劑處理，其分子結(jié)構(gòu)、應(yīng)用效果與天然甜菜堿無(wú)明顯差別，屬于化學(xué)合成的天然物等同物。在本體系液中用于提高擴(kuò)增效率。

bsa是牛血清白蛋白，又稱第五組分，是牛血清中的一種白蛋白，包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66.430kda，等電點(diǎn)為4.7。牛血清白蛋白在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用，例如在westernblot中作為blockingagent；在酶切反應(yīng)緩沖液中加入bsa，通過(guò)提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，對(duì)酶起保護(hù)作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，能減輕有些不利環(huán)境因素如加熱，表面張力及化學(xué)因素引起的變性。在本體系液中主要作用是增加dna聚合酶的穩(wěn)定性。

體系液中rox是一種熒光試劑，在體系液中的作用是作為參比熒光的。rox內(nèi)參染料,用于消除信號(hào)本底以及效正孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào),最大限度的提高了擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。內(nèi)參基因是為了平衡不同模板之間的差異,而rox在不斷的加熱退火過(guò)程中的熒光比較穩(wěn)定,用以做為體系中的陽(yáng)性較正。rox不參與pcr反應(yīng),僅消除加樣誤差和儀器孔之間誤差作用。內(nèi)標(biāo)的作用：內(nèi)標(biāo)探針與標(biāo)基因探針采用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記,通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)是否正常來(lái)監(jiān)測(cè)待測(cè)樣本中是否具有pcr抑制物,避免pcr假陰性。rox的作用：用于校正加樣誤差和管間差異,便于儀器自動(dòng)分析報(bào)告熒光與內(nèi)參比熒光rox的比值,使定量更準(zhǔn)確。

q5高保真酶是newenglandbiolabs(neb)公司推出的一種性能強(qiáng)勁的dna聚合酶——q5超保真dna聚合酶。它不僅帶來(lái)了極為出色的保真度，還確保了各種擴(kuò)增子的可靠擴(kuò)增，而無(wú)論其gc含量如何。這種dna聚合酶的保真度比普通的taq酶高50倍，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的錯(cuò)誤率極低。因?yàn)榫酆厦概csso7ddna結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，從而改善了保真度、速度和性能可靠性。

此外，q5buffer是為了配合q5高保真酶而使用的。q5的緩沖液體系也為pcr產(chǎn)物的成功擴(kuò)增起到作用。它確保了各種擴(kuò)增子的可靠擴(kuò)增，而無(wú)論其gc含量如何。

1×q5buffer和1×rox均為濃度表示方式，該方式屬于本領(lǐng)域通用表示手段，本領(lǐng)域技術(shù)人員看到后可以理解。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述肺炎支原體檢測(cè)物引物包括

第一上游引物f1：gtcccgcttgaatgtgta，以及

第一下游引物r1：tcgcatcaacaagtctagc。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述耐藥性檢測(cè)物引物包括

第二上游引物f2：ttagccgcaacgggacgga，以及

第二下游引物r2：agtcaaactgcccacctaac。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述第二上游引物f2中3’末端三個(gè)堿基為硫化堿基。引物是一小段dna，由含有四種堿基的核苷酸組成。核苷酸之間是以第一核苷酸中五碳糖上3’-羥基和第二個(gè)核苷酸五碳糖上5’-羥基與一個(gè)磷酸形成3’，5’-磷酸二酯鍵連接。引物的3’末端是指核苷酸有3’-羥基的一端。dna聚合酶合成dna的方向是5’端→3’端，所以3’末端就是引物向下延長(zhǎng)的末端。高保真dna聚合酶具有3’->5’核酸外切酶活性，可以識(shí)別并切除發(fā)生錯(cuò)配的堿基。引物末端發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，高保真酶可切除末端錯(cuò)配，使dna鏈繼續(xù)延伸。若引物末端為硫化堿基并發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，聚合酶無(wú)法發(fā)揮外切酶活性。錯(cuò)配使dna鏈延伸中止。這就是分子開(kāi)關(guān)法檢測(cè)基因突變的原理。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：前面所述引物的濃度為0.25-1μm。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的方法，該方法包括以下步驟：

步驟a：樣品處理步驟，所述樣品處理步驟系將樣品進(jìn)行預(yù)處理后提取獲得待檢dna；

步驟b：加樣步驟，所述加樣步驟系將待檢dna及對(duì)照物加入前面所述試劑中；

步驟c：測(cè)試步驟，所述測(cè)試步驟系將pcr管放入熒光定量pcr儀上設(shè)置反應(yīng)條件后檢測(cè)熒光。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述步驟a包括以下分步驟：

步驟a1：取待測(cè)人痰液并使用液化試劑液化痰液；

步驟a2：對(duì)液化后痰液離心，棄上清液；

步驟a3：直接用dna提取試劑盒提取待測(cè)dna；或加入20～30μl三蒸水煮沸5分鐘，再取上清液做待檢dna。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述步驟b包括以下順序可變的分步驟：

步驟b1：將待檢dna分別加入第一試劑和第二試劑中，其中待檢dna與試劑體積比為1:9；

步驟b2：將陰性對(duì)照物分別加入第一試劑和第二試劑中，其中陰性對(duì)照物與試劑體積比為1:9，所述陰性對(duì)照物系指雙蒸水；

步驟b3：將陽(yáng)性對(duì)照物分別加入第一試劑和第二試劑中，其中陽(yáng)性對(duì)照物與試劑體積比為1:9，所述陽(yáng)性對(duì)照物系指野生型mp基因組dna。

本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是：所述步驟c中熒光定量pcr儀設(shè)置的反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃30s，98℃變性10s、72℃退火及延伸20s，30個(gè)循環(huán)并在72℃時(shí)檢測(cè)熒光。

本專利的第三個(gè)目的在于提供一種快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的試劑盒，所述試劑盒包括如前所述的第一試劑和第二試劑，還包括陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，其中所述陰性對(duì)照品為雙蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照品為野生型mp基因組dna。

本方案的基本原理是通過(guò)將上游引物3’末端放在2063位點(diǎn)上，并將末端三個(gè)堿基硫化。在擴(kuò)增過(guò)程中突變型模板與引物末端不匹配，具有5’->3’核酸外切酶活性的q5高保真酶對(duì)末端進(jìn)行切除，但由于堿基硫化后，q5高保真酶無(wú)法完成矯正，反應(yīng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。而野生型末端匹配，可以繼續(xù)擴(kuò)增。

現(xiàn)有技術(shù)中雖然以及存在使用熒光pcr進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，但是現(xiàn)有技術(shù)的原理是通過(guò)等位基因特異性實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)技術(shù)(具體原理是設(shè)計(jì)特異性和非特異性引物，使無(wú)5’→3’核酸外切酶活性的taq酶在引物末端不匹配的情況下，擴(kuò)增效率降低。)對(duì)野生和突變型的肺炎支原體分別進(jìn)行pcr。檢測(cè)野生型肺炎支原體時(shí)，特異性引物和非特異性引物pcr擴(kuò)增速度有所差別，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算反應(yīng)體系中的dna濃度，從而計(jì)算出是否發(fā)生突變以及突變的比例。

而本專利，使用具有5’→3’核酸外切酶活性的高保真聚合酶，配合3’末端硫化的引物。當(dāng)引物與模板發(fā)出錯(cuò)配時(shí)，高保真酶將發(fā)揮外切酶作用切除錯(cuò)配，但硫化后的引物使酶失效，所以無(wú)法切除錯(cuò)配，反應(yīng)無(wú)法延伸。

由此可見(jiàn)，本發(fā)明產(chǎn)品引物引入3’末端硫化結(jié)合高保真酶來(lái)提高特異性，技術(shù)上具有創(chuàng)新性；無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作簡(jiǎn)單，定性分析，更適合臨床使用。

本發(fā)明的有益效果是：本方案提供的快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的方法和試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確度高，反應(yīng)迅速，對(duì)反應(yīng)環(huán)境要求低，成本相對(duì)低廉，可以廣泛的進(jìn)行推廣。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本申請(qǐng)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)中記載的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變方法的基于熒光pcr檢測(cè)方法示意圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變體系靈敏度檢測(cè)的示意圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變體系特異性檢測(cè)的示意圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變方法野生型樣品實(shí)際檢測(cè)結(jié)果。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變方法突變型樣品實(shí)際檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的方法和試劑盒。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于熒光pcr技術(shù)對(duì)肺炎支原體及其大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變位點(diǎn)(a2063g)的快速檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒由體系液1、體系液2、陽(yáng)性對(duì)照品及陰性對(duì)照品組成。

所述試劑盒中所提供的體系液中含有終濃度為以下的各物質(zhì)：1×q5buffer、200μmdntp、evagreen0.6μm、1×rox、bsa0.2-0.8mg/ml、甜菜堿0.2-0.8m、q5高保真酶0.1-0.5u/μl、純水。

其中體系液1中的上游引物和下游引物為肺炎支原體檢測(cè)用引物，其序列分別為：

上游引物f1：gtcccgcttgaatgtgta

下游引物r1：tcgcatcaacaagtctagc

體系液2中包含的上游引物和下游引物為23srrna2063位點(diǎn)野生型mp檢測(cè)用引物，其序列為：

上游引物f2：ttagccgcaacgggacgga

下游引物r2：agtcaaactgcccacctaac

所述體系液2中上游引物，其特征在于引物3’末端三個(gè)堿基為硫化堿基。

圖1是本方案基因識(shí)別示意圖。

所述試劑盒反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃30s，98℃變性10s、72℃退火及延伸20s,30個(gè)循環(huán)并在72℃時(shí)檢測(cè)熒光。

所述試劑盒還包括陰性及陽(yáng)性對(duì)照品，所述陰性對(duì)照品為雙蒸水；所述陽(yáng)性對(duì)照品為野生型mp基因組dna。

本發(fā)明所述試劑盒，其使用方法具體步驟如下：

1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于疑似肺炎支原體感染的患者痰液等樣品；使用液化試劑液化痰液，10000rpm離心2分鐘，棄其上清液后，用dna提取試劑盒提取模板dna或加20～30μl三蒸水煮沸5分鐘，再取2μl上清液做待檢模板dna；

2)取體系液1和2各18μl，分別加入2μl待檢模板，并分別設(shè)置陰性對(duì)照管和陽(yáng)性對(duì)照管。加樣完成后，短暫離心。

3)將pcr管放入熒光定量pcr儀上設(shè)置反應(yīng)條件：預(yù)變性98℃30s，98℃變性10s、72℃退火及延伸20s,30個(gè)循環(huán)并在72℃時(shí)檢測(cè)熒光。

4)體系1中有s型曲線表明樣本中含有肺炎支原體，無(wú)s形曲線表明樣本中不含肺炎支原體；體系2種有s形曲線表明肺炎支原體不耐藥，無(wú)s形曲線則表明肺炎支原體耐藥。

本發(fā)明的基本原理是通過(guò)將上游引物3’末端放在2063位點(diǎn)上，并將末端三個(gè)堿基硫化。在擴(kuò)增過(guò)程中突變型模板與引物末端不匹配，具有5’->3’核酸外切酶活性的q5高保真酶對(duì)末端進(jìn)行切除，但由于堿基硫化后，q5高保真酶無(wú)法完成矯正，反應(yīng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。而野生型末端匹配，可以繼續(xù)擴(kuò)增。

下面結(jié)合附圖通過(guò)具體的肺炎支原體及2063耐藥突變檢測(cè)過(guò)程來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

實(shí)施例一

1引物制備

通過(guò)查閱文獻(xiàn)和用blast軟件分析篩選出肺炎支原體特異性基因及23srrna的核酸片段設(shè)計(jì)出引物并合成，得到如下的引物：

肺炎支原體檢測(cè)引物

序列編號(hào)1

上游引物f1：gtcccgcttgaatgtgta

序列編號(hào)2

下游引物r1：tcgcatcaacaagtctagc

耐藥突變檢測(cè)引物

序列編號(hào)3

上游引物f2：ttagccgcaacgggacgga

序列編號(hào)4

下游引物r2：agtcaaactgcccacctaac

2體系液制備

配制含有如下成分及濃度的的體系液：1×q5buffer4μl、200μmdntp、上游引物0.5μm、下游引物0.5μm、evagreen0.6μm、1×rox、bsa0.4mg/ml、甜菜堿0.8m、純水9.66μl和q5高保真酶0.5u/μl。體系液1中加入的上下游引物為f1、r1；體系液2中加入的上下游引物為f2、r2；

3陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品制備：

肺炎支原體使用相應(yīng)增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時(shí)后，取1.0ml增菌液使用試劑盒提取基因組dna分裝后作為陽(yáng)性對(duì)照品；將無(wú)菌水純分裝作為陰性對(duì)照品。

4樣品處理和模板制備

樣品范圍適用于疑似肺炎支原體感染的患者痰液等樣品。使用液化試劑液化痰液，10000rpm離心2分鐘，棄其上清液后，用dna提取試劑盒提取模板dna或加20～30μl三蒸水煮沸5分鐘，再取2μl上清液做待檢模板dna；

5加樣

按照下表加入各試劑：

表1各檢測(cè)管組分

6將檢測(cè)管放到熒光定量pcr儀上，設(shè)定預(yù)變性98℃30s，98℃變性10s、72℃退火及延伸20s,30個(gè)循環(huán)并在72℃時(shí)檢測(cè)熒光。

7結(jié)果判讀：2號(hào)和5號(hào)管在熒光定量pcr儀上出現(xiàn)s形曲線，3號(hào)和6號(hào)管在熒光定量pcr儀上無(wú)s形曲線則表明體系正常；檢測(cè)管1和檢測(cè)管4判讀見(jiàn)表2。

表2反應(yīng)結(jié)果判讀方法

圖2-5為測(cè)量結(jié)果圖譜。其中圖2為體系檢測(cè)靈敏度，可以看出不通過(guò)濃度之間曲線的差異。圖3為體系檢測(cè)特異性，可以看出本體系具有明顯的特異性區(qū)分。圖4為野生型樣本實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，圖5為突變型樣本實(shí)際檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合圖4、5即可區(qū)分樣品的具體類型。

本方案提供的快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的方法和試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確度高，反應(yīng)迅速，對(duì)反應(yīng)環(huán)境要求低，成本相對(duì)低廉，可以廣泛的進(jìn)行推廣。

現(xiàn)有技術(shù)中雖然以及存在使用熒光pcr進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，但是現(xiàn)有技術(shù)的原理是通過(guò)等位基因特異性實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)技術(shù)(具體原理是設(shè)計(jì)特異性和非特異性引物，使無(wú)5’→3’核酸外切酶活性的taq酶在引物末端不匹配的情況下，擴(kuò)增效率降低。)對(duì)野生和突變型的肺炎支原體分別進(jìn)行pcr。檢測(cè)野生型肺炎支原體時(shí)，特異性引物和非特異性引物pcr擴(kuò)增速度有所差別，再利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算反應(yīng)體系中的dna濃度，從而計(jì)算出是否發(fā)生突變以及突變的比例。

而本專利，使用具有5’→3’核酸外切酶活性的高保真聚合酶，配合3’末端硫化的引物。當(dāng)引物與模板發(fā)出錯(cuò)配時(shí)，高保真酶將發(fā)揮外切酶作用切除錯(cuò)配，但硫化后的引物使酶失效，所以無(wú)法切除錯(cuò)配，反應(yīng)無(wú)法延伸。

由此可見(jiàn)，本發(fā)明產(chǎn)品引物引入3’末端硫化結(jié)合高保真酶來(lái)提高特異性，技術(shù)上具有創(chuàng)新性；無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作簡(jiǎn)單，定性分析，更適合臨床使用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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sequencelisting

<110>北京百康芯生物科技有限公司

<120>一種快速核酸檢測(cè)肺炎支原體及耐藥突變的方法和試劑盒

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