一種蘋果多酚氧化酶活性促進劑及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于酶活性技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘋果多酚氧化酶活性促進劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多酚氧化酶是自然界中分布極廣的一種金屬蛋白酶，普遍存在于植物中，能夠?qū)⒎踊蚨喾友趸蓪?yīng)的醌。其在食品、醫(yī)藥及環(huán)保行業(yè)有著廣泛應(yīng)用，研究其活性可以更好地解決食物儲存、植物抵抗病原體及病毒侵害、含酚類有機物工業(yè)廢水的生物降解等問題。

目前，研究人員多數(shù)研究提純后的多酚氧化酶(ppo)，包括探究酶的最佳活性條件，表面活性劑(十二烷基硫酸鈉(sds))對酶活性的激發(fā)等，以達到最大可能提高酶活性的目的。ppo大量存在于植物中，其中蘋果中含量豐富，我國蘋果種植面積和產(chǎn)量均占世界總量的40％以上，但從蘋果中提取的ppo活性較低。

專利cn105734025a利用十六烷基三甲基溴化銨(ctab)和十二烷基三甲基溴化銨(dtab)提高蘋果中ppo粗酶的活性。十六烷基三甲基溴化銨和十二烷基三甲基溴化銨是由一個親水基和一個疏水基通過化學鍵連接構(gòu)成的單鏈表面活性劑，屬于傳統(tǒng)的表面活性劑。當ctab濃度為0.3-1.0mm時，粗酶活性可提高最大為75％左右。當dtab濃度為15mm時，粗酶活性提高最大為50％。從以上數(shù)據(jù)可知，傳統(tǒng)表面活性劑的用量較多，且對酶活性的調(diào)控作用也不夠明顯。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明將gemini表面活性劑與傳統(tǒng)單鏈表面活性劑進行復配，探究了表面活性劑復配體系對多酚氧化酶活性的影響，以期尋找協(xié)同效應(yīng)較好的復配體系，以降低表面活性劑的用量，拓展其應(yīng)用范圍。

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠更大程度提高蘋果多酚氧化酶活性的促進劑，及利用該促進劑提高蘋果多酚氧化酶活性的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種蘋果多酚氧化酶活性促進劑，包括十二烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基溴化銨與gemini表面活性劑以重量比為10～2000:1～4比例混合的混合物，所述gemini表面活性劑為二溴化-雙(二甲基十二烷基)戊二銨或二溴化-雙(二甲基十六烷基)戊二銨。

優(yōu)選的，所述蘋果多酚氧化酶活性促進劑，包括十二烷基三甲基溴化銨與gemini表面活性劑以重量比為200～2000:1～4比例混合的混合物，所述gemini表面活性劑為二溴化-雙(二甲基十二烷基)戊二銨或二溴化-雙(二甲基十六烷基)戊二銨。

優(yōu)選的，所述蘋果多酚氧化酶活性促進劑，包括十六烷基三甲基溴化銨與gemini表面活性劑以重量比為10～100:1～4比例混合的混合物，所述gemini表面活性劑為二溴化-雙(二甲基十二烷基)戊二銨或二溴化-雙(二甲基十六烷基)戊二銨。

本發(fā)明還包括采用上述促進劑提高蘋果多酚氧化酶活性的應(yīng)用，提取蘋果多酚氧化酶粗酶液，在所述促進劑存在的條件下，以多酚氧化酶為催化劑進行催化反應(yīng)。

優(yōu)選的，在所述催化反應(yīng)體系中，所述促進劑在所述催化反應(yīng)體系中的濃度分別為：十二烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基溴化銨0.1～20mm，gemini表面活性劑5～45μm。

優(yōu)選的，所述催化反應(yīng)體系中，還包括底物鄰苯二酚和溶解所述底物的磷酸鹽緩沖溶液，所述磷酸鹽緩沖溶液的ph值為6.0～8.0。

優(yōu)選的，所述催化反應(yīng)的溫度為30℃～50℃。

優(yōu)選的，所述蘋果多酚氧化酶粗酶液提取步驟包括：將冷凍后的蘋果在濃度為0.1～0.3mph為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液中打漿，料液比為1.5～2.0ml/g，將得到的漿液過濾、離心，得到的上清液為蘋果多酚氧化酶粗酶液。

優(yōu)選的，所述磷酸鹽緩沖液中還含有體積分數(shù)為0.1～0.3％的tritonx-100和質(zhì)量分數(shù)為1～3％的pvpp。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明的蘋果多酚氧化酶活性促進劑包括gemini表面活性劑與傳統(tǒng)單鏈表面活性劑進行復配的混合表面活性劑。gemini表面活性劑有著優(yōu)良的物理化學性質(zhì)：低的臨界膠束濃度、超低界面張力、低krafft點、良好的增溶性等。本發(fā)明中的gemini表面活性劑為二溴化-雙(二甲基十二烷基)戊二銨或二溴化-雙(二甲基十六烷基)戊二銨，傳統(tǒng)單鏈表面活性劑為十二烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基溴化銨，將傳統(tǒng)單鏈表面活性劑與gemini表面活性劑以一定比例復配，得到的促進劑能夠?qū)⑻O果多酚氧化酶的活性提高至240％，且促進劑的用量少，大大提高了表面活性劑的應(yīng)用范圍。

附圖說明

圖1為dtab存在下不同濃度的16-5-16對ppo酶活性的影響；

圖2為dtab存在下不同濃度的12-5-12對ppo酶活性的影響；

圖3為16-5-16存在下不同濃度的dtab對ppo酶活性的影響；

圖4為12-5-12存在下不同濃度的dtab對ppo酶活性的影響；

圖5為ctab存在下不同濃度的16-5-16對ppo酶活性的影響；

圖6為ctab存在下不同濃度的12-5-12對ppo酶活性的影響。

具體實施方式

本發(fā)明將gemini表面活性劑與傳統(tǒng)單鏈表面活性劑進行復配，探究了表面活性劑復配體系對多酚氧化酶(ppo)活性的影響，從而得到了一種能夠提高蘋果多酚氧化酶活性的促進劑。該促進劑為包括十二烷基三甲基溴化銨(dtab)或十六烷基三甲基溴化銨(ctab)與gemini表面活性劑以重量比為10～2000:1～4比例混合的混合物，其中，gemini表面活性劑為二溴化-雙(二甲基十二烷基)戊二銨(12-5-12)或二溴化-雙(二甲基十六烷基)戊二銨(16-5-16)。

本發(fā)明中，十二烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基溴化銨與gemini表面活性劑的重量比優(yōu)選為30～1800:1～4。

本發(fā)明中，當十二烷基三甲基溴化銨與本發(fā)明的gemini表面活性劑二溴化-雙(二甲基十二烷基)戊二銨或二溴化-雙(二甲基十六烷基)戊二銨復配時，優(yōu)選十二烷基三甲基溴化銨與gemini表面活性劑的復配比例，按重量比計，優(yōu)選為200:1～4，更優(yōu)選為200:1～3，最優(yōu)選為200:1～2。

本發(fā)明中，當十六烷基三甲基溴化銨與本發(fā)明的gemini表面活性劑二溴化-雙(二甲基十二烷基)戊二銨或二溴化-雙(二甲基十六烷基)戊二銨復配時，優(yōu)選十六烷基三甲基溴化銨與gemini表面活性劑的復配比例，按重量比計，優(yōu)選為30:1～4，更優(yōu)選為30:1～3，最優(yōu)選為30:1～2。

本發(fā)明研究了在30℃、ph為7.0條件下，dtab存在下0～50μm濃度的16-5-16對ppo酶活性的影響(將表面活性劑濃度為0時的酶活性定義為100％)。由圖1可知，當加入15mmdtab后，隨著16-5-16濃度的提高，ppo酶活性提高，16-5-16在體系中的濃度為30μm時活性達到最大，能夠?qū)⒚富钚蕴岣?0％。而加入2mmdtab時，16-5-16濃度于10μm處即能將酶活性提高140％左右，而對于兩種組分單獨作用于ppo酶，dtab為15mm時能使酶活性最高提高50％，16-5-16為30μm時可使酶活性最高提升45％，顯示出本發(fā)明復配體系的優(yōu)越性。

圖2為在30℃、ph為7.0條件下，dtab存在下0～50μm濃度的12-5-12對ppo酶活性的影響(將表面活性劑濃度為0時的酶活性定義為100％)。由圖2可知，當加入2mmdtab后，12-5-12濃度為20μm時能將酶活性提升75％，而當這兩種組分單獨存在時，dtab為15mm時能將酶活性最高提高50％，12-5-12為20μm時能將酶活性最高提高35％，說明dtab與12-5-12復配之后的優(yōu)越性。

為了進一步驗證該結(jié)論，選取特定濃度的gemini表面活性劑，改變dtab的濃度，探究兩種組分共同作用對ppo酶活性的調(diào)控作用，結(jié)果如圖3和4所示。

圖3和4所示為在30℃、ph為7.0條件下，gemini表面活性劑存在下，0～20mm濃度的dtab對ppo酶活性的影響(將表面活性劑濃度為0時的酶活性定義為100％)。加入gemini表面活性劑，在dtab濃度于2mm時能夠大幅度提高酶活性，當加入10μm16-5-16后酶活性提高了140％；相比于不加gemini表面活性劑，dtab最多能夠?qū)⒚富钚蕴岣?0％，所需濃度達15mm；相比于不加dtab，16-5-16最多能夠?qū)⒚富钚蕴岣?5％，所需濃度為30μm。對比之下，復配體系將酶活性提高了100％左右。

本發(fā)明研究了在30℃、ph為7.0條件下，ctab存在下0～50μm濃度的16-5-16對ppo酶活性的影響(將表面活性劑濃度為0時的酶活性定義為100％)。由圖5可知當分別加入0.3、0.8mmctab后，16-5-16提高ppo酶活性的能力得以提高，濃度為10～30μm時酶活性達到最大，將酶活性提升100％，而當這兩種組分單獨存在時，ctab為0.3mm時能將酶活性最高提高75％，16-5-16為30μm時能將酶活性最高提高45％，同樣也表明本發(fā)明復配體系相比于單一組分更具有優(yōu)越性。

圖6所示為在30℃、ph為7.0條件下，ctab存在下0～50μm濃度的12-5-12對粗酶活性的影響(將表面活性劑濃度為0時的酶活性定義為100％)。當分別加入0.3、0.8mmctab后，12-5-12濃度為5μm時活性達到最大，酶活性提升了80％左右，而當這兩種組分單獨存在時，ctab為0.3mm時能將酶活性最高提高75％，12-5-12為20μm時能將酶活性最高提高35％?？梢园l(fā)現(xiàn)，ctab與12-5-12復配后，對ppo酶活性提升作用不明顯。

從圖5和圖6可知，gemini表面活性劑與ctab復配體系作用于ppo酶而使酶活性提升程度大小為：16-5-16>12-5-12。為了進一步驗證該結(jié)論，選取特定濃度的gemini表面活性劑，改變ctab的濃度，探究兩種組分共同作用對ppo酶活性的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)與不加入gemini表面活性劑相比，ctab濃度小于0.3mm時加入gemini表面活性劑能小幅度提高ppo酶活性；然而當ctab濃度大于0.3mm后，加入16-5-16，酶活性保持穩(wěn)定；加入12-5-12，酶活性稍有下降。

綜上所述，對于ppo粗酶，加入單一的表面活性劑將酶活性提升程度最大如下：dtab為15mm時可將酶活性提高50％，ctab為0.3mm時可酶活性提高75％，16-5-16為30μm時可將酶活性提高45％，12-5-12為20μm時可將酶活性提高35％。dtab(2mm)/16-5-16(10μm)和dtab(2mm)/12-5-12(20μm)復配體系能將ppo酶活性分別提高140％和75％左右，ctab(0.3mm)/16-5-16(10μm)和ctab(0.3mm)/12-5-12(5μm)復配體系分別能將ppo酶活性提高100％和80％左右。

本發(fā)明還包括利用上述促進劑提高蘋果多酚氧化酶活性的應(yīng)用。該應(yīng)用的具體步驟包括：提取蘋果多酚氧化酶粗酶液，在所述促進劑存在的條件下，以多酚氧化酶為催化劑進行催化反應(yīng)。

本發(fā)明中，提取蘋果多酚氧化酶粗酶液的方法沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的粗酶提取方法即可。在本發(fā)明具體實施例中，優(yōu)選將蘋果冷凍后，在磷酸鹽緩沖液中勻漿、過濾、離心后得到的上清液為蘋果多酚氧化酶粗酶液。

本發(fā)明中，優(yōu)選將蘋果切片后進行勻漿。

本發(fā)明中，磷酸鹽緩沖液的濃度優(yōu)選為0.1～0.3m，進一步優(yōu)選為0.2～0.25m。磷酸鹽緩沖液的ph值優(yōu)選為6.0～8.0，進一步優(yōu)選為7.0。

本發(fā)明中，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液中還包括tritonx-100和pvpp(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)，作為酶活性的穩(wěn)定劑。

本發(fā)明中，優(yōu)選tritonx-100的體積分數(shù)為0.1～0.3％，更優(yōu)選為0.2～0.25％。

本發(fā)明中，優(yōu)選pvpp的質(zhì)量分數(shù)為1～3％，更優(yōu)選為2～2.5％。

本發(fā)明中，勻漿時的料液比為1.5～2.0ml/g，更優(yōu)選為1.7～1.8ml/g。

將勻漿后的漿液過濾。本發(fā)明對過濾的方式?jīng)]有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的過濾方式即可。在本發(fā)明具體實施例中，優(yōu)選用四層紗布擠壓過濾。

將過濾后的濾液進行離心。本發(fā)明對離心的方式?jīng)]有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的離心方式即可。本發(fā)明中，優(yōu)選在4℃下進行離心，離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選為8000～12000rpm，更優(yōu)選為10000rpm，離心時間優(yōu)選為20～30min，更優(yōu)選為25min。離心后得到的上清液即為本發(fā)明的蘋果多酚氧化酶粗酶液。

本發(fā)明的促進劑在對多酚氧化酶進行催化時，促進劑在催化反應(yīng)體系中的濃度分別為：十二烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基溴化銨0.1～20mm，gemini表面活性劑5～45μm，更優(yōu)選為：十二烷基三甲基溴化銨或十六烷基三甲基溴化銨0.3～15mm，gemini表面活性劑10～40μm。

本發(fā)明中，多酚氧化酶催化的底物優(yōu)選為鄰苯二酚，但并非是對本發(fā)明的限制。磷酸鹽緩沖液用于溶解底物鄰苯二酚。優(yōu)選磷酸鹽緩沖液的ph值為6.0～8.0，更優(yōu)選為7.0。

本發(fā)明中，多酚氧化酶的催化溫度優(yōu)選為30～50℃，更優(yōu)選為30～40℃。

通過加入促進劑，使蘋果多酚氧化酶的活性最大提高至240％。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

1、預處理

將山東煙臺紅富士蘋果在清水中洗凈，瀝干，放置于-20℃冰柜中冷凍12h。

2、粗酶液的提取

將冷凍過的蘋果削成片狀，稱取58.82g，加入100ml磷酸鹽緩沖溶液(0.2m，ph＝6.5，含0.25％(v/v)(250μl)tritonx-100和2％(w/w)(3.38g)pvpp)，液料比為1.7ml/g，混合打漿1min，用四層冰紗布過濾，分離出濾液，將得到的濾液在4℃下10000rpm離心10min，取上清液，于-20℃冰柜中儲存?zhèn)溆谩?/p>

3、多酚氧化酶活性的測定

以鄰苯二酚為底物，將ppo粗提液稀釋25倍加入促進劑進行ppo酶活性的測試。測試體系中，鄰苯二酚的濃度為150mm。促進劑為dtab和16-5-16的復配，其在測試體系中的濃度分別為：dtab為2.0mm，16-5-16為10μm。測試波長為420nm。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高140％。

實施例2

促進劑為dtab和12-5-12的復配，其在測試體系中的濃度分別為：dtab為2.0mm，12-5-12為20μm。其余與實施例1相同。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高75％。

實施例3

促進劑為ctab和16-5-16的復配，其在測試體系中的濃度分別為：ctab為0.3mm，16-5-16為10μm。其余與實施例1相同。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高100％。

實施例4

促進劑為ctab和12-5-12的復配，其在測試體系中的濃度分別為：ctab為0.3mm，12-5-12為5μm。其余與實施例1相同。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高80％。

對比例1

促進劑為dtab，其在測試體系中的濃度為15mm，其余與實施例1相同。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高50％。

對比例2

促進劑為ctab，其在測試體系中的濃度為0.3mm。其余與實施例1相同。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高75％。

對比例3

促進劑為16-5-16，其在測試體系中的濃度為10μm。其余與實施例1相同。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高20％。

對比例4

促進劑為12-5-12，其在測試體系中的濃度為20μm。其余與實施例1相同。

相對于未加促進劑而言，添加促進劑后ppo的酶活力提高35％。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。