本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：誘導(dǎo)多能干細胞(inducedpluripotentstemcells,ipscells)最初是日本人山中申彌(shinyayamanaka)于2006年利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因(oct4,sox2,klf4和c-myc)的組合轉(zhuǎn)入分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種細胞類型。ips細胞不僅可用于分化和移植，還可以提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發(fā)新的治療方法。人類ips細胞的建立被公認為2007年最重要的科技進展之一，這項技術(shù)不僅可以從體細胞建立個體特異的多能干細胞系，解決了細胞移植治療中的免疫排斥問題，而且為研究人類細胞的重編程的機理以及研究個體特異的疾病發(fā)生機理提供了有力的方法。在體外，ips細胞可定向誘導(dǎo)分化出多種細胞，比如神經(jīng)干細胞、肝臟干細胞、心肌干細胞等，因此，ips細胞在理論研究和臨床應(yīng)用等方面都極具應(yīng)用價值。在誘導(dǎo)多能干細胞增殖分化過程中會分泌出多種生長因子、蛋白質(zhì)、活性多肽、微量元素等促進細胞生長、活化、再生等的物質(zhì)。雖然誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的市場潛力很大，但其大量培養(yǎng)存在著較大困難，目前報道尚未多見。中國專利cn102732586b公開了一種間充質(zhì)干細胞分泌素的制備方法，所述制備方法包括細胞培養(yǎng)，分泌素溶液收集培養(yǎng)，純化，濃縮，利用了生物反應(yīng)器技術(shù)替代傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)瓶去制作間充質(zhì)干細胞分泌素，大幅縮減成本及所需空間，提高了充質(zhì)干細胞細胞分泌素的產(chǎn)量。中國專利申請cn101461772a公開了用于美容護膚的干細胞分泌因子的制備方法，所述制備方法包括細胞分離、干細胞擴增、干細胞因子體系的獲取和濃縮、貯存，該發(fā)明簡單易行，適宜大規(guī)模生產(chǎn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法簡單易行，適宜大規(guī)模生產(chǎn)，有效提高了誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的產(chǎn)量。本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法，包括以下步驟：s1重懸誘導(dǎo)多能干細胞，得誘導(dǎo)多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導(dǎo)多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應(yīng)器的誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24-72h，得誘導(dǎo)多能干細胞；s3在步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞分裂旺盛階段，用磷酸緩沖液沖洗誘導(dǎo)多能干細胞和三維載體2-4次，然后向生物反應(yīng)器中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液imdm/f12與磷酸緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)6-24h，收集生物反應(yīng)器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，濃縮，即得。本發(fā)明誘導(dǎo)多能干細胞分泌素通過超膜過濾，截留分子量為30kd，濃縮后所得的多種生命活性物，其包括蛋白質(zhì)、多肽及生物活性因子等多種成分。誘導(dǎo)多能干細胞分泌素中的多種生命活性成分具有復(fù)雜的生理作用，每種成分都可以對許多組織器官產(chǎn)生影響，同時每種形式生理機能的提高也不是單一因子的作用，而是需要多種因子的相互協(xié)調(diào)作用。該分泌物具有促進細胞增殖、分化、凋零，防止細胞衰老，參與免疫調(diào)節(jié)，抗氧化等作用。進一步地，所述步驟s2中細胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基imdm/f12和添加劑；其中，添加劑為2-4mg/ml人白蛋白、40-60μg/ml維生素c和3-7mg/ml人參皂苷單體rb1。人參皂苷單體rb1可以顯著提高誘導(dǎo)多能干細胞誘導(dǎo)效率，并可以顯著延緩細胞的衰老和促進細胞的增殖。進一步地，所述步驟s2中細胞培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基imdm/f12和添加劑組成；其中，添加劑為3mg/ml人白蛋白、50μg/ml維生素c和5mg/ml人參皂苷單體rb1。進一步地，所述步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞密度為1×108-1×109個/l。進一步地，所述步驟s3中基礎(chǔ)培養(yǎng)液imdm/f12與磷酸緩沖液的體積比為1:(2-6)。進一步地，所述步驟s3中磷酸緩沖液的濃度為0.01m，ph值為7.3。進一步地，所述步驟s4中濃縮方式為通過切向流過中控纖維超濾柱，體積濃縮1/8。同時，本發(fā)明制得的誘導(dǎo)多能干細胞分泌素可用于保健品或化妝品中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法簡單易行，適宜大規(guī)模生產(chǎn)，有效提高了誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的產(chǎn)量，且在抗衰老、抑制黑色素及修復(fù)受損細胞的應(yīng)用中效果較好。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，這些實施例僅用于例證的目的，并不限制于本發(fā)明的保護范圍。實施例1一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導(dǎo)多能干細胞，得誘導(dǎo)多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導(dǎo)多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應(yīng)器的誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)液imdm/f12+2mg/ml人白蛋白+40μg/ml維生素c+3mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24h，得誘導(dǎo)多能干細胞；s3在步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導(dǎo)多能干細胞和三維載體2次，然后向生物反應(yīng)器中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:2)繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集生物反應(yīng)器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。實施例2一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導(dǎo)多能干細胞，得誘導(dǎo)多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導(dǎo)多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應(yīng)器的誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+50μg/ml維生素c+5mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)48h，得誘導(dǎo)多能干細胞；s3在步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導(dǎo)多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應(yīng)器中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:4)繼續(xù)培養(yǎng)15h，收集生物反應(yīng)器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。實施例3一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導(dǎo)多能干細胞，得誘導(dǎo)多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導(dǎo)多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應(yīng)器的誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)液imdm/f12+4mg/ml人白蛋白+60μg/ml維生素c+7mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)72h，得誘導(dǎo)多能干細胞；s3在步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導(dǎo)多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應(yīng)器中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:6)繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集生物反應(yīng)器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。對比例1一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導(dǎo)多能干細胞，得誘導(dǎo)多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導(dǎo)多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應(yīng)器的誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+5.05mg/ml維生素c中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)48h，得誘導(dǎo)多能干細胞；s3在步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導(dǎo)多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應(yīng)器中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:4)繼續(xù)培養(yǎng)15h，收集生物反應(yīng)器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮1/8，即得。與實施例2的區(qū)別在于，步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)液里未添加人參皂苷單體rb1，增加了維生素c的用量。對比例2一種誘導(dǎo)多能干細胞分泌素的制備方法所述制備方法包括以下步驟：s1重懸誘導(dǎo)多能干細胞，得誘導(dǎo)多能干細胞懸液；s2將步驟s1所得誘導(dǎo)多能干細胞懸液分布于三維載體，并置于一生物反應(yīng)器的誘導(dǎo)多能干細胞培養(yǎng)液imdm/f12+3mg/ml人白蛋白+50μg/ml維生素c+5mg/ml人參皂苷單體rb1中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)48h，得誘導(dǎo)多能干細胞；s3在步驟s2中誘導(dǎo)多能干細胞分裂旺盛階段，用0.01m的磷酸緩沖液(ph＝7.3)沖洗誘導(dǎo)多能干細胞和三維載體3次，然后向生物反應(yīng)器中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液imdm/f12與磷酸緩沖液(體積比為1:4)繼續(xù)培養(yǎng)15h，收集生物反應(yīng)器中的上清液，得分泌素溶液；s4將步驟s3所得分泌素溶液離心，超膜過濾，常規(guī)濃縮1/8，即得。與實施例2的區(qū)別在于，將步驟s4中通過切向流過中控纖維超濾柱濃縮替換為常規(guī)濃縮。試驗例一、體外抗衰老試驗1.試驗材料：實施例1-3及對比例1-2制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物。2.試驗方法：取人皮膚成纖維母細胞(hdf細胞)，用含10％(v/v)fbs的dmem/f12培養(yǎng)基配制hdf細胞懸液，得到4×104cell/ml細胞懸液，分別注入3塊96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μl，每處理組別設(shè)復(fù)孔4孔，置于含5％(v/v)co2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h后棄原培養(yǎng)液，分別加入含1μg/ml的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物的1640培養(yǎng)液100μl，設(shè)含15％新生牛血清的1640培養(yǎng)液100μl為培養(yǎng)基對照組，設(shè)不含有新生牛血清的1640培養(yǎng)液為空白對照組，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、72h、120h、168h。各觀察期終止時，加入20μl/孔的mtt液，繼續(xù)培養(yǎng)6h，吸去原液，加入150μl/孔二甲基亞砜。震蕩10min，在免疫酶標儀上以490nm波長測定吸光度。按下列公式計算細胞相對存活率(rgr)：其中0h的細胞活力作為100％。3.試驗結(jié)果：誘導(dǎo)多能干細胞分泌物對hdf細胞相對存活率的影響結(jié)果見表1。表1誘導(dǎo)多能干細胞分泌物對hdf細胞相對存活率的影響由表1可知，本發(fā)明制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物對hdf細胞作用24-168h，沒有細胞毒性作用，反而具有促進hdf細胞增殖的作用。與對比例1-2相比，本發(fā)明制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物對hdf的生長的促進作用較明顯且在120h時達到高峰，說明本發(fā)明提供的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物的制備方法較好，且本發(fā)明制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物不會對細胞產(chǎn)生不正常的增生，對人體的使用安全性高。試驗例二、黑色素生成抑制效果試驗1.試驗材料：實施例1-3及對比例1-2制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物。2.試驗方法：使用小鼠惡性黑色素瘤細胞。使用含有胎牛血清10％的eagle’smem培養(yǎng)基)，在co2培養(yǎng)箱(5％co2、37℃)內(nèi)培養(yǎng)。將小鼠惡性黑色素瘤細胞制成細胞濃度3×105個/ml的懸浮液，將該懸浮液1ml注入含有培養(yǎng)基9ml的100mm培養(yǎng)皿中。第二天替換為分別含有1μg/ml的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天。培養(yǎng)結(jié)束后，刮取細胞，各組的細胞數(shù)總計為5×106個，進行離心。添加1mol/lnaoh500ml溶解后，測定其溶解液405nm處的吸光度。將無添加組作為100％，計算各組的黑素生成抑制率。3.試驗結(jié)果：黑素生成抑制率結(jié)果如表2所示。表2黑色素生成抑制結(jié)果組別實施例1組實施例2組實施例3組對比例1組對比例2組抑制率/％57.862.052.746.543.1由表2可知，本發(fā)明制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物能有效抑制黑色素生成，具有良好的美白效果。與對比例1-2相比，本發(fā)明實施例1-3制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物抑制黑色素生成的效果較好，說明本發(fā)明的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物制備方法制得的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物中抑制黑色素生成的有效成分含量較多。試驗例三、對紫外照射后細胞的修復(fù)作用用含10％(v/v)fbs的dmem/f12培養(yǎng)基(青霉素200u/ml、鏈霉素200u/ml，ph＝7.2)培養(yǎng)人包皮成纖維細胞(hff，atcc)至融合度為80％左右時，換用含1％(v/v)fbs的1640培養(yǎng)基，每天在紫外線下照射2h。陰性對照組用錫紙包住細胞培養(yǎng)瓶。細胞照射完四天后，觀察發(fā)現(xiàn)細胞開始出現(xiàn)皺縮，開始有個別的細胞漂浮在培養(yǎng)基中。第五天，用含1％(v/v)fbs的1640培養(yǎng)基稀釋各樣品，誘導(dǎo)多能干細胞分泌物高劑量組終濃度為100μg/ml，低劑量終濃度為1μg/ml；陽性對照組(即紫外照射后不加提取物)加入含1％(v/v)fbs的1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察細胞形態(tài)。結(jié)果表明，本發(fā)明制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物對紫外照射造成的細胞損傷具有顯著的修復(fù)作用。由以上試驗可知，本發(fā)明制備的誘導(dǎo)多能干細胞分泌物對人體安全，且能夠抗衰老、抑制黑色素的生成及修復(fù)受損細胞等，可用于保健品或化妝品中。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。當前第1頁12