本發(fā)明涉及組織工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種屏障加強(qiáng)的體外重組表皮模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：皮膚是人體與外界環(huán)境接觸的屏障，保護(hù)體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物的侵襲。人體皮膚主要由三部分構(gòu)成，即表皮層、真皮層和皮下組織。表皮層位于皮膚的最外層，由基底層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和角質(zhì)層構(gòu)成。角質(zhì)層是表皮細(xì)胞分化的最后產(chǎn)物，由角質(zhì)形成細(xì)胞及其細(xì)胞間脂質(zhì)基質(zhì)組成，厚度大約為10μm，是皮膚屏障功能的主要結(jié)構(gòu)，因此角質(zhì)層的屏障功能一直是組織工程皮膚的主要研究課題，很多研究者在如何提高組織工程皮膚模型角質(zhì)層屏障方面付諸了大量努力。近年來，有越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞緊密連接對(duì)維持機(jī)體表皮正常結(jié)構(gòu)及功能具有重要作用，承擔(dān)著部分皮膚屏障功能。緊密連接是一種細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu)，它的主要功能是：將表皮細(xì)胞緊密連接，使細(xì)胞不易受到破壞；控制分子的細(xì)胞旁通路，對(duì)分子大小、離子類型、細(xì)胞滲透性有選擇性，具有細(xì)胞間透過屏障功能；維持細(xì)胞的極性，分離細(xì)胞膜基底部分和胞膜頂部的脂質(zhì)；緊密連接蛋白還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；此外，緊密連接可能還參與表皮鈣離子梯度（ca2+）形成和板層小體的極性分泌過程，是皮膚屏障功能的重要組成部分和關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子?，F(xiàn)有的組織工程皮膚模型產(chǎn)品雖然在一般的結(jié)構(gòu)、組成和生物化學(xué)方面與人類皮膚具有高度相似性，可用于皮膚毒性測(cè)試，但其滲透性相比于人類皮膚仍然要高得多。造成模型屏障功能缺陷的因素除了脂質(zhì)組成和板層結(jié)構(gòu)上的異常外，可能還有細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)的不完整，角質(zhì)層正常脫落過程受損和非角化的微觀病灶的存在，這些方面的缺陷導(dǎo)致現(xiàn)有的重組表皮模型屏障功能不完善，限制了這些皮膚模型在皮膚吸收和滲透實(shí)驗(yàn)等其他方面的應(yīng)用。具有成纖維細(xì)胞真皮層和表皮層的全層皮膚模型雖然在組織結(jié)構(gòu)上更類似于人體天然皮膚，并且能在一定程度上降低滲透性，但真皮層的加入又會(huì)引入其他影響，如在模型制備過程中，下層成纖維細(xì)胞的來源，數(shù)量以及狀態(tài)的差異性對(duì)于表皮細(xì)胞的增殖及分化有較大影響，造成模型穩(wěn)定性差，影響模型對(duì)化學(xué)物質(zhì)評(píng)判的準(zhǔn)確性。另外由于成纖維細(xì)胞在體外分化的過程中，會(huì)自身分泌的膠原，對(duì)外界的膠原支架或者其他生物材料支架進(jìn)行塑形，易導(dǎo)致真皮部分乃至模型收縮，引起測(cè)試物從模型邊緣的滲漏，干擾測(cè)試結(jié)果的評(píng)判；最后，成纖維細(xì)胞的存在也要求構(gòu)建體系的培養(yǎng)液必須含有血清，引進(jìn)了不可預(yù)估的安全風(fēng)險(xiǎn)。并且，模型構(gòu)建工藝繁瑣，制備周期長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種屏障加強(qiáng)的體外重組表皮模型的構(gòu)建方法，能夠從兩方面加強(qiáng)組織工程重建表皮模型的屏障功能，滿足皮膚吸收和滲透試驗(yàn)要求，擴(kuò)大了產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供過一種屏障加強(qiáng)的體外重組表皮模型的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：1、表皮模型構(gòu)建培養(yǎng)基配制：（1）表皮細(xì)胞培養(yǎng)液配制：以kc-growth培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，每500ml中添加l-谷氨酰胺1.0~1.5mm和牛垂體提取物12~25mg。（2）表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液：在（1）的基礎(chǔ)上添加表皮生長(zhǎng)因子0.5~5μg、氫化可的松2~50μg、胰島素1~10mg、腺嘌呤5~25mg、轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5~6μg、氯化鈣0.03~0.2mm。（3）表皮細(xì)胞ta培養(yǎng)液：在（2）基礎(chǔ)上，每500ml中添加脂質(zhì)混合物（l-絲氨酸0.25～5mm、棕櫚酸0.4～5μm、亞油酸0.01~0.05mm、精氨琥珀酸0.025~0.05mm、牛血清白蛋白0.01~0.05mm）、巨噬細(xì)胞活化肽2(macrophage-activatinglipopeptidemalp2)2.5~5.0mg、維生素c15~25μg，調(diào)整氯化鈣濃度為1.0~1.5mm。2、表皮干細(xì)胞分離和培養(yǎng)：表皮干細(xì)胞分離：將人體皮膚組織置于培養(yǎng)皿中，加入75%酒精10ml，迅速進(jìn)行沖洗，轉(zhuǎn)入pbs溶液中，用剪刀剝離去除皮下疏松結(jié)締組織，用pbs浸洗，將組織塊切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml質(zhì)量比為1%的dispase消化液，4℃消化過夜，分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，再加入10ml質(zhì)量比為0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分鐘，獲得分離成單個(gè)細(xì)胞的表皮細(xì)胞溶液，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾表皮碎片，1000rpm離心7分鐘，去掉上層清液，用pbs洗滌下層細(xì)胞，然后1000rpm離心7分鐘，倒掉上清液，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，按2~4×106/瓶接種到iv型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育10-15min，吸出培養(yǎng)基，更換新鮮表皮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隔48h換一次液。3、組織工程表皮構(gòu)建：將步驟2中獲得的表皮干細(xì)胞用胰酶消化液消化，用表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液制成密度為1×106~6×106個(gè)/ml的表皮干細(xì)胞分散液，取200μl接種于含有聚碳酸酯濾膜的細(xì)胞培養(yǎng)小室中，震蕩均勻，在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育20~30min。將接種后的細(xì)胞培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)入表皮模型培養(yǎng)模具中，小室外的培養(yǎng)皿中加入新鮮表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液，37℃，5%co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24~48h后，吸去細(xì)胞小室中的剩余培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)小室升至氣液面，更換表皮細(xì)胞ta培養(yǎng)液，37℃5%co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12~14天后可得具有形態(tài)分化完全的基底層、棘層、顆粒層、角質(zhì)層的組織工程表皮模型。本發(fā)明采用表皮干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，聚碳酸脂膜作為支架構(gòu)建用于滲透試驗(yàn)的屏障加強(qiáng)的重組表皮模型。表皮干細(xì)胞增殖和分化能力強(qiáng)，在無真皮層支持的條件下形成的表皮組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整、功能和活性體外維持時(shí)間較長(zhǎng)；聚碳酸脂膜具有無毒性、生物相容性好的特點(diǎn)，以此為支架材料標(biāo)準(zhǔn)化程度高、批間差異小、生產(chǎn)周期短。本發(fā)明中還在氣液面培養(yǎng)階段中添加了脂質(zhì)混合物和巨噬細(xì)胞活化肽2，脂質(zhì)混合物的添加通過調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞脂質(zhì)合成，改善了角質(zhì)層的脂質(zhì)組成和屏障功能，同時(shí)巨噬細(xì)胞活化肽2通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)緊密連接滲透屏障，從兩方面加強(qiáng)組織工程重建表皮模型的屏障功能，能夠滿足皮膚吸收和滲透試驗(yàn)要求，擴(kuò)大了產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的皮膚刺激性體外重組表皮模型和屏障加強(qiáng)的重組表皮模型組織學(xué)染色結(jié)果對(duì)比圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地描述。實(shí)施例1本發(fā)明實(shí)施例提供一種屏障功能加強(qiáng)的體外重組表皮模型構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：1、表皮模型構(gòu)建培養(yǎng)基配制：表皮細(xì)胞培養(yǎng)液配制：以kc-growth培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，每500ml中添加l-谷氨酰胺1.0~1.5mm和牛垂體提取物12~25mg。表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液：在（1）的基礎(chǔ)上添加表皮生長(zhǎng)因子0.5~5μg、氫化可的松2~50μg、胰島素1~10mg、腺嘌呤5~25mg、轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5~6μg、氯化鈣0.03~0.2mm。表皮細(xì)胞ta培養(yǎng)液：在（2）基礎(chǔ)上，每500ml中添加脂質(zhì)混合物（l-絲氨酸0.25～5mm、棕櫚酸0.4～5μm、亞油酸0.01~0.05mm、精氨琥珀酸0.025~0.05mm、牛血清白蛋白0.01~0.05mm）、巨噬細(xì)胞活化肽2(macrophage-activatinglipopeptidemalp-2)2.5~5.0mg、維生素c15~25μg，調(diào)整氯化鈣濃度為1.0~1.5mm。2、表皮干細(xì)胞分離和培養(yǎng)：表皮干細(xì)胞分離：將人體皮膚組織置于培養(yǎng)皿中，加入75%酒精10ml，迅速進(jìn)行沖洗，轉(zhuǎn)入pbs溶液中，用剪刀剝離去除皮下疏松結(jié)締組織，用pbs浸洗，將組織塊切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml質(zhì)量比為1%的dispase消化液，4℃消化過夜，分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，再加入10ml質(zhì)量比為0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分鐘，獲得分離成單個(gè)細(xì)胞的表皮細(xì)胞溶液，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾表皮碎片，1000rpm離心7分鐘，去掉上層清液，用pbs洗滌下層細(xì)胞，然后1000rpm離心7分鐘，倒掉上清液，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，按2~4×106/瓶接種到iv型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育10~15min，吸出培養(yǎng)基，更換新鮮表皮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隔48h換一次液。3、組織工程表皮構(gòu)建：將步驟2中獲得的表皮干細(xì)胞用胰酶消化液消化，用表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液制成密度為1.25×106個(gè)/ml的表皮干細(xì)胞分散液，取200μl接種于含有聚碳酸酯濾膜的細(xì)胞培養(yǎng)小室中，震蕩均勻，在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育20~30min。將接種后的細(xì)胞培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)入表皮模型培養(yǎng)模具中，小室外的培養(yǎng)皿中加入新鮮表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液，37℃，5%co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸去細(xì)胞小室中的剩余培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)小室升至氣液面，更換表皮細(xì)胞ta培養(yǎng)液，37℃5%co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)14天后可得具有形態(tài)分化完全的基底層、棘層、顆粒層、角質(zhì)層的組織工程表皮模型。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例提供一種屏障功能加強(qiáng)的體外重組表皮模型構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：1、表皮模型構(gòu)建專用培養(yǎng)基配制：表皮細(xì)胞培養(yǎng)液配制：以kc-growth培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，每500ml中添加l-谷氨酰胺1.0~1.5mm和牛垂體提取物12~25mg。表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液：在（1）的基礎(chǔ)上添加表皮生長(zhǎng)因子0.5~5μg、氫化可的松2~50μg、胰島素1~10mg、腺嘌呤5~25mg、轉(zhuǎn)鐵蛋白2.5~6μg、氯化鈣0.03~0.2mm。表皮細(xì)胞ta培養(yǎng)液：在（2）基礎(chǔ)上，每500ml中添加脂質(zhì)混合物（l-絲氨酸0.25～5mm、棕櫚酸0.4～5μm、亞油酸0.01~0.05mm、精氨琥珀酸0.025~0.05mm、牛血清白蛋白0.01~0.05mm）、巨噬細(xì)胞活化肽2(macrophage-activatinglipopeptidemalp-2)2.5~5.0mg、維生素c15~25μg，調(diào)整氯化鈣濃度為1.0~1.5mm。2、表皮干細(xì)胞分離和培養(yǎng)：表皮干細(xì)胞分離：將人體皮膚組織置于培養(yǎng)皿中，加入75%酒精10ml，迅速進(jìn)行沖洗，轉(zhuǎn)入pbs溶液中，用剪刀剝離去除皮下疏松結(jié)締組織，用pbs浸洗，將組織塊切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml質(zhì)量比為1%的dispase消化液，4℃消化過夜，分離真皮、表皮，收集表皮皮片，剪為碎塊，再加入10ml質(zhì)量比為0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分鐘，獲得分離成單個(gè)細(xì)胞的表皮細(xì)胞溶液，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾表皮碎片，1000rpm離心7分鐘，去掉上層清液，用pbs洗滌下層細(xì)胞，然后1000rpm離心7分鐘，倒掉上清液，加入表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，按2~4×106/瓶接種到iv型膠原包被的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育10~15min，吸出培養(yǎng)基，更換新鮮表皮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隔48h換一次液。3、組織工程表皮構(gòu)建：將步驟2中獲得的表皮干細(xì)胞用胰酶消化液消化，用表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液制成密度為2.5×106個(gè)/ml的表皮干細(xì)胞分散液，取200μl接種于含有聚碳酸酯濾膜的細(xì)胞培養(yǎng)小室中，震蕩均勻，在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中孵育20~30min。將接種后的細(xì)胞培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)入表皮模型培養(yǎng)模具中，小室外的培養(yǎng)皿中加入新鮮表皮細(xì)胞tu培養(yǎng)液，37℃，5%co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸去細(xì)胞小室中的剩余培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)小室升至氣液面，更換表皮細(xì)胞ta培養(yǎng)液，37℃5%co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12天后可得具有形態(tài)分化完全的基底層、棘層、顆粒層、角質(zhì)層的組織工程表皮模型。實(shí)施例3體外重組表皮模型在化學(xué)品皮膚吸收滲透實(shí)驗(yàn)中的用途，其使用方法如下：1、皮膚預(yù)處理選用健康的人體腹部皮膚，仔細(xì)剔除皮下黏膜和脂肪組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干皮膚表面生理鹽水，解剖鏡下選取適當(dāng)大小未損傷的皮膚備用。體外重組表皮模型（刺激模型），屏障加強(qiáng)表皮模型（滲透模型）分別在氣液面培養(yǎng)10或14天，用來做滲透試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前檢查人體皮服和表皮模型的完整性，確保屏障沒有任何損傷。2、經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)（1）采用franz擴(kuò)散池進(jìn)行透皮試驗(yàn)（有效滲透面s為0.196cm2，接收池容積為4.1ml），將人體皮膚或表皮模型固定于供給室和接收池之間，皮膚角質(zhì)層面向供給室，真皮層一側(cè)朝向接受池；接收液為pbs液、ph=7.4，接受液液面要與皮膚內(nèi)層接觸；保持32±1℃恒溫水浴，并確保水浴夾層無氣泡，開啟電磁攪拌器以600rpm/min的速度攪拌。（2）將樣品加至供給室中（一般固體樣品添加量為1~5mg/cm2，液體最多添加量為10μl/cm2）于1h、2h、4h、8h、16h、24h取出接收液0.3ml(每次取樣后均補(bǔ)加等量的接受液)，將取得的樣品進(jìn)行離心，取上清液，再用0.45μm濾膜過濾.（3）將過濾液用hplc測(cè)定樣品含量。液相色譜條件見下表1。表1樣品hplc檢測(cè)條件樣品流動(dòng)相流速(ml/min)檢測(cè)波長(zhǎng)(nm)溫度咖啡因乙腈：水：甲醇（10:70:20v/v/v）127025℃氫化可的松乙腈：水：(40:60v/v)124225℃3、樣品對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定精密稱量一定質(zhì)量的對(duì)照品置于棕色容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，低溫避光保存?zhèn)溆?。測(cè)試時(shí)，按一定濃度梯度倍比稀釋，色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰面積。以色譜峰面積y對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度c(μg·ml-1)進(jìn)行線性回歸。同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程中要排除皮膚溶出物/空白基質(zhì)在樣品保留時(shí)間時(shí)沒有吸收峰，排除樣品測(cè)定的干擾。4、計(jì)算累積透皮量q，公式如下：q=[cn×v+∑ci×v0]/s(i=1…n-1)q：累積滲透量；s：有效擴(kuò)散面積；v：接收室中接收液體積；v0：每次取樣的體積；ci：第1次至上次取樣時(shí)接收液中藥物濃度；cn：該次取樣時(shí)接收液中藥物濃度。此外透皮速率和遲滯時(shí)間根據(jù)累積滲透量對(duì)時(shí)間的斜率計(jì)算得到，其中將單位面積藥物累積透過量(μg/cm2)對(duì)時(shí)間作圖，直線部分的斜率即為穩(wěn)態(tài)通透速率(j,μg/cm2/h)，直線與x軸的交點(diǎn)為時(shí)滯(t,h)；藥物的滲透系數(shù)(kp,cm/h)則是穩(wěn)態(tài)通透速率(j)與藥物在供給液中溶解度(cs，mg/ml)的比值，滲透系數(shù)根據(jù)fick’s第一擴(kuò)散定律（j=kpcs）計(jì)算得到。兩種樣品在人體皮膚、體外重組表皮模型和屏障加強(qiáng)的體外重組表皮模型上的滲透測(cè)試結(jié)果見表2，從表中可以看出通過本發(fā)明構(gòu)建的表皮模型，具有更強(qiáng)的屏障功能，對(duì)兩種滲透標(biāo)準(zhǔn)品（咖啡因和氫化可的松）的滲透性雖然仍高于人體皮膚，但相比于優(yōu)化前的表皮模型，滲透性顯著降低。表2樣品在三種皮膚替代物上的24h體外滲實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖1，可以看出，體外重組表皮模型和屏障加強(qiáng)的重組表皮模型組織學(xué)染色結(jié)果對(duì)比圖，從he染色圖中可以看出采用本發(fā)明構(gòu)建的屏障加強(qiáng)的重組表皮模型具有更厚的角質(zhì)層，屏障功能更強(qiáng)。盡管以上結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方案，上述的具體實(shí)施方案僅僅是示意性的、指導(dǎo)性的，而不是限制性的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本說明書的啟示下，在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求所保護(hù)的范圍的情況下，還可以做出很多種的形式，這些均屬于本發(fā)明保護(hù)之列。當(dāng)前第1頁12