一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段檢測微生物耐藥基因的方法，具體為一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1922年，細菌學(xué)家從鼻涕培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了一種“溶菌酶”，這便是青霉素的原型。1927年，弗萊明正式發(fā)表文章聲明青霉素的發(fā)現(xiàn)。但直到1939年澳大利亞人費羅里和德國人錢恩，才發(fā)明了青霉素的提純技術(shù)，兩年之后青霉素開始正式應(yīng)用于臨床。從此，細菌性疾病的治療進入了一個新的時代。在之后的數(shù)十年里，抗菌藥物家族不斷壯大，新型抗菌藥物不斷被用于感染性疾病的治療，為無數(shù)與疾病斗爭的人們帶來了福音。但隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌耐藥性問題越來越嚴重，細菌耐藥突變菌株的出現(xiàn)再一次讓感染性疾病的治療成為世界難題。有研究表明，人類“超級細菌”——抗甲氧西林金黃色牛源大腸桿菌，其中部分變異菌株是來自于豬的一種新型細菌。全球因各類傳染病平均每年死亡1700多萬人，其中耐藥菌株的廣泛傳播和多重耐藥菌株的出現(xiàn)為其主要原因之一。據(jù)報道，1972年墨西哥有1萬余人感染耐氯霉素傷寒桿菌，導(dǎo)致一千多人治療無效死亡；1992年美國有1.3萬余人死于耐藥突變菌的感染。大腸桿菌是人和動物腸道中最主要的一種共生菌，亦是危害人類及動物健康的重要致病菌，其某些血清型具有強致病性，可引起人類和多種動物發(fā)生腹瀉，甚至死亡。由于大腸桿菌并多并發(fā)或繼發(fā)于其他病毒或細菌性疾病，所以在畜禽養(yǎng)殖中抗菌藥物常常作為飼料添加劑使用，往往會給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種檢測喹諾酮類藥物對大腸桿菌突變選擇窗的影響，探明牛源大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀及流行的耐藥基因類型的方法，本發(fā)明提供了一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記及其應(yīng)用。技術(shù)方案：一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。優(yōu)選的，所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。表1分子標記序列名稱序列(5’-3’)seqidno.p1-fnh2-t(10)gcaaaccggactacgtcacc1p1-rtcaatcctcttcggagttccc2p2-fnh2-t(10)acgtctatgccaaccgtcctg3p2-rgcagtgccaccgccaatgtcc4p3-fnh2-t(10)tgtaacacgcaagcacgatg5p3-raaccttctccgccccgagt6所述分子標記在制備檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。優(yōu)選的，所述試劑盒檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50～400倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋20～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。優(yōu)選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。優(yōu)選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。優(yōu)選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。優(yōu)選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。有益效果：(1)本發(fā)明所述分子標記在細菌感染治療過程中可以實時檢測耐藥突變菌株的產(chǎn)生，能夠?qū)咕幬锏目咕Я捌浞滥退幫蛔兡芰M行評價；(2)本發(fā)明所述分子標記具有特異性高、靈敏度強、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。附圖說明圖1是實施例1～3檢測結(jié)果圖；其中，m為分子量為1000bp的maker；1為實施例1pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；2為實施例2pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果；3為實施例3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果。具體實施方式實施例1一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標記在制備檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實施例2一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標記在制備檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋400倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋20倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。實施例3一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子標記p1、p2和p3的上游引物5’端進行氨基化修飾并附加10個堿基t。所述分子標記在制備檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、雙蒸水。所述試劑盒檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的步驟包括：(1)取樣：選取純化后的牛源大腸桿菌，劃線接種培養(yǎng)基，形成單個菌落，向無菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接種針挑取單菌落于甘油中洗滌數(shù)次，-20℃保存；(2)以步驟(1)收集的菌體作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋200倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋50倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應(yīng)緩沖液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環(huán)；72℃，5min。所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環(huán)；72℃，4min。sequencelisting<110>蘇州喬納森新材料科技有限公司<120>一種用于檢測牛源大腸桿菌喹諾酮耐藥基因的分子標記及其應(yīng)用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcaaaccggactacgtcacc20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tcaatcctcttcggagttccc21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3acgtctatgccaaccgtcctg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4gcagtgccaccgccaatgtcc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tgtaacacgcaagcacgatg20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6aaccttctccgccccgagt19當(dāng)前第1頁12