一種提取動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的方法與流程

本發(fā)明涉及一種提取動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的方法。

背景技術(shù)：

細(xì)胞是一切生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。動(dòng)物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞質(zhì)膜，細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)膜是指圍繞在細(xì)胞最外層，由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖類組成的生物膜，在結(jié)構(gòu)上作為細(xì)胞的界限，使細(xì)胞具有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，同時(shí)可以介導(dǎo)細(xì)胞與環(huán)境之間的物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞等過(guò)程。細(xì)胞質(zhì)是指細(xì)胞質(zhì)膜包圍的除核區(qū)外的一切半透明、膠狀、顆粒狀物質(zhì)的總稱，由細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、內(nèi)膜系統(tǒng)、細(xì)胞骨架和包含物組成，細(xì)胞質(zhì)是生命活動(dòng)的主要場(chǎng)所。細(xì)胞質(zhì)包括基質(zhì)、細(xì)胞器和后含物，在生活狀態(tài)下為透明的膠狀物?；|(zhì)是指細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈液態(tài)的部分，是細(xì)胞質(zhì)的基本成分，主要含有多種可溶性酶、糖、無(wú)機(jī)鹽和水等。細(xì)胞器是分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、具有一定形態(tài)、在細(xì)胞生理活動(dòng)中起重要作用的結(jié)構(gòu)，包括線粒體、質(zhì)體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、細(xì)胞骨架（微絲、微管、中間纖維）、中心粒以及周圍物質(zhì)等。

細(xì)胞核是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)最大、最重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞遺傳與代謝的調(diào)控中心。細(xì)胞核主要由核被膜、核纖層、染色質(zhì)、核仁及核體組成。細(xì)胞核是遺傳信息的儲(chǔ)存場(chǎng)所，與細(xì)胞遺傳及代謝活動(dòng)密切相關(guān)的基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物的加工過(guò)程均在此進(jìn)行。染色質(zhì)作為遺傳物質(zhì)的載體，是指間期細(xì)胞核內(nèi)由dna、組蛋白、非組蛋白及少量rna組成的線性復(fù)合結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)是細(xì)胞遺傳與代謝調(diào)控中心的最重要成員，幾乎所有細(xì)胞生命活動(dòng)都要從染色質(zhì)開始。與基因組直接相關(guān)的細(xì)胞活動(dòng)都是在染色質(zhì)水平進(jìn)行，如dna復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、同源重組、dna修復(fù)，包括轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的修復(fù)以及dna和組蛋白的各種修飾。與染色質(zhì)dna結(jié)合的蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)dna分子遺傳信息的組織、復(fù)制和閱讀。這些dna結(jié)合蛋白包括兩類：一類是組蛋白，與dna結(jié)合但沒(méi)有序列特異性；另一類是非組蛋白，與特定的dna序列或組蛋白相結(jié)合。

目前從組織或細(xì)胞全裂解液中分離提取染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白比較困難，沒(méi)有較好的方法，本發(fā)明提供了一種能夠快速簡(jiǎn)便提取染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的方法，對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)各組分重要功能的研究具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所提出的一種提取動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的方法，目的在于填補(bǔ)提取染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白這一領(lǐng)域的空白。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種提取動(dòng)物細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的方法，包括以下步驟：

a.收集細(xì)胞

棄去培養(yǎng)液，使用稀釋后的0.25%的胰酶溶液進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞消化，離心棄上清，保留細(xì)胞沉淀，用適量pbs重懸細(xì)胞沉淀，離心棄上清，保留沉淀；

b.細(xì)胞勻漿裂解

（1）向步驟a所得沉淀中加入buffer1，震蕩后冰浴2-5分鐘；

（2）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)，冰上勻漿50-60次左右后冰上靜置1-2h；

（3）600-800g，4℃離心5-10分鐘，得到的沉淀即粗細(xì)胞核組分；

（4）吸取步驟b（3）所得上清，600-800g，4℃，5-10分鐘，反復(fù)多次離心，直至沒(méi)有沉淀，最終得到的上清即為胞漿和胞膜的混合組分；

c.細(xì)胞核的制備

用適量buffer1重懸步驟b（3）得到的粗核，離心棄上清；重復(fù)上述離心過(guò)程4-5次，最終得到的沉淀即為完整且純度較高的細(xì)胞核組分；

d.細(xì)胞染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的分離

（1）用適量的buffer2溶解細(xì)胞核組分，冰浴30-60min，離心，獲得沉淀和上清，上清即為核內(nèi)可溶性組分；

（2）將步驟d（1）得到的沉淀用buffer2重懸，離心，棄去上清，重復(fù)離心2-3次，最終得到的沉淀即為細(xì)胞核內(nèi)不溶性的染色質(zhì)組分；

e.染色質(zhì)相關(guān)蛋白的檢測(cè)

（1）胞漿和胞膜的混合組分以及核內(nèi)可溶性組分：根據(jù)上清體積加1/3體積的三氯醋酸水溶液，-20℃過(guò)夜。第二天取出，4000-5000g，4℃離心5-10分鐘，棄上清，冰上干燥后加入1×sds細(xì)胞裂解液，4℃裂解蛋白；

（2）細(xì)胞核組分以及細(xì)胞核內(nèi)不可溶性的染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白組分：直接加入1×sds細(xì)胞裂解液，4℃裂解蛋白；

上述組分蛋白裂解后加熱變性，測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行westernblot檢測(cè)。

所述步驟a中使用稀釋后的0.25%的胰酶溶液進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞消化，1000rpm，離心5-10分鐘后棄上清，保留細(xì)胞沉淀，用適量pbs重懸細(xì)胞沉淀，800-900g，離心5-10分鐘后棄上清，保留沉淀。

所述步驟b（1）中按照每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加500-600μl體積的比例加入適量的buffer1。

所述步驟c中用適量buffer1重懸步驟b（3）得到的粗核，4000-5000g，4℃離心5-10分鐘，棄上清；

所述步驟d（1）和d（2）低速離心條件為1700-2000g，5-10分鐘，4℃。

本發(fā)明獲得了如下有益效果：

使用本發(fā)明所述方法獲得的純度較高的染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白，不含有胞漿和胞膜成分。解決了目前提取染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白比較困難的問(wèn)題，為染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的功能研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)方法流程圖；

圖2是westernbloting檢測(cè)本發(fā)明所述方法獲得的各組分中內(nèi)參蛋白表達(dá)圖。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案及其所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果，以人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-231為例，下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)方法流程圖參見(jiàn)圖1。

一、溶液的配置

（1）buffer1：含10mmhepes（ph為7.9），1.5mmmgcl2，0.34m蔗糖，10%甘油，1mm二硫蘇糖醇和磷酸酶抑制劑。

（2）buffer2：含有3mmedta，0.2mmegta，1mm二硫蘇糖醇，以及磷酸酶抑制劑。

（3）500mmhepes溶液配方：天平稱取hepes粉末5.9575g，溶于40ml的ddw中。再用0.5mnaoh溶液調(diào)整ph值至7.9，用ddw定容到50ml即可。使用前稀釋到指定濃度。

二、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

使用人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-231進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-231構(gòu)自美國(guó)atcc（americantypeculturecollection）細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞使用dmem培養(yǎng)基（添加10%的胎牛血清fbs、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素）培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%co2的環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)液用量為每10cm培養(yǎng)皿使用10ml含血清培養(yǎng)液。

1.收集細(xì)胞

首先棄去培養(yǎng)液，再用常溫的pbs溶液清洗培養(yǎng)皿3次，用無(wú)菌移液管吸去殘留液體。使用稀釋后的0.25%的胰酶溶液（優(yōu)選1：3稀釋）進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞的消化過(guò)程，約1分鐘。終止細(xì)胞細(xì)化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，800g離心10分鐘。棄去上清，得到細(xì)胞沉淀。

2.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行勻漿裂解

（1）按照每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加500μl體積的比例加入適量的buffer1。首先震蕩混合液使得細(xì)胞充分重懸，再行冰浴2分鐘。

（2）將細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)（2mldounce勻漿器，每個(gè)勻漿器最多加500μl懸液），在冰上進(jìn)行上下方向的手動(dòng)勻漿約50次左右，之后在冰上靜置一小時(shí)左右（注意：破碎細(xì)胞是提取細(xì)胞成分的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有效的研磨方式是上下方向的推拉研磨）。

（3）將勻漿器內(nèi)的細(xì)胞裂解混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5mlep管中。再以800g，4℃離心5分鐘。此時(shí)得到的沉淀則是細(xì)胞核的粗制品。

（4）吸取上清并轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷ep管中。800g，4℃，5分鐘多次離心，直至上清離心后管底無(wú)肉眼可見(jiàn)沉淀，此時(shí)最終得到的上清則是胞漿和胞膜的混合組分（上清1）。3.細(xì)胞核的制備

3.加入與2（1）等量的buffer1于步驟2（3）得到的粗核沉淀中，混合均勻。再以4000g，4℃離心5分鐘后，棄上清。重復(fù)這一離心過(guò)程4-5次，最后離心后上清應(yīng)清亮。棄去上清，此時(shí)得到的沉淀為完整沒(méi)有破碎的細(xì)胞核（沉淀1）。

4.細(xì)胞染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白的分離

（1）用適量的buffer2溶解細(xì)胞核（沉淀1），冰上作用30分鐘，再低速離心（1700g，5分鐘，4℃）進(jìn)一步獲得沉淀和上清2（核內(nèi)可溶性組分）。

（2）將步驟4（1）得到的沉淀用buffer2重懸后，離心（1700g，5分鐘，4℃），得到沉淀2（核內(nèi)不溶性染色質(zhì)組分）。

5.染色質(zhì)相關(guān)蛋白的檢測(cè)

（1）對(duì)于獲得的上清1（胞漿和胞膜的混合組分）以及上清2（核內(nèi)可溶性組分）：需要根據(jù)最終獲得的上清體積，加1/3體積的三氯醋酸水溶液（30%）混勻，置于-20℃中過(guò)夜。第二天取出，5000g，4℃離心10分鐘，棄去上清。再打開ep管蓋，冰上空氣略干約30分鐘左右，加適量細(xì)胞裂解液（1×sdslysisbuffer），4度裂解蛋白。

（2）對(duì)獲得的沉淀1（細(xì)胞核）以及沉淀2（細(xì)胞核內(nèi)不可溶性的染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白組分），直接加入適量的1×sds細(xì)胞裂解液，4℃裂解蛋白。

上述組分蛋白裂解后即可加熱變性，測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行常規(guī)westernblot檢測(cè)即可。

6.westernblot實(shí)驗(yàn)

使用上述染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白提取方法得到以下各組分，進(jìn)行蛋白樣本制備，進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn)。

另外pmsf儲(chǔ)存濃度為100mm，用前加，添加比例為1:1000。最終定容為10ml。

westernblot實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（1）選擇sds-page濃縮上膠濃度為5%，分離下膠濃度為8%。

（2）使用恒流進(jìn)行電泳分離，樣本處于濃縮上膠（一塊膠）時(shí)使用20ma，濃縮膠30分鐘左右的時(shí)間。樣本開始進(jìn)入下膠開始分離時(shí)，則將電流設(shè)置為40ma（相應(yīng)的電壓應(yīng)該小于110v）。分離過(guò)程需要約1.5小時(shí)。

（3）使用濕法轉(zhuǎn)膜，恒流250ma轉(zhuǎn)膜3小時(shí)。

（4）室溫封閉1小時(shí)，一抗采用4度過(guò)夜孵育，二抗室溫孵育50分鐘。使用的抗體濃度：

使用胞核表達(dá)蛋白histone作為胞核組分的陽(yáng)性對(duì)照，胞漿表達(dá)蛋白β-actin作為胞漿組分的陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（參見(jiàn)圖2）：β-actin（胞漿組分的陽(yáng)性對(duì)照）在胞漿和胞膜的混合組分中有表達(dá)，在胞核組分（上清1）、核內(nèi)不可溶性的染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白組分（沉淀2）和核內(nèi)可溶性組分（上清2）中均無(wú)表達(dá)；histone（染色質(zhì)的組成蛋白，屬于核內(nèi)不可溶組分）在胞核組分（上清1）和核內(nèi)不可溶性的染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白組分（沉淀2）中均有表達(dá)，而在胞漿和胞膜的混合組分（上清1）和核內(nèi)可溶性組分（上清2）中無(wú)表達(dá)。此結(jié)果驗(yàn)證了該方法提取的染色質(zhì)及其相關(guān)蛋白沒(méi)有摻雜胞漿、胞膜組分，提取方法有效。