一種腎纖維化miRNA標(biāo)記物的制作方法

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種腎纖維化mirna標(biāo)記物及其應(yīng)用，具體涉及一種與腎纖維化相關(guān)的mirna-576標(biāo)記物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

mirna是天然存在于體內(nèi)的21-22nt的非編碼rna分子，是一類通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默對靶基因表達進行調(diào)節(jié)的rna。據(jù)估計，生物體內(nèi)約有1/3的基因受mirna的調(diào)控。mirna與risc的復(fù)合體通過堿基配對可與靶基因mrna5’-utr或者3’-utr中的互補序列相結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mrna降解，從而負(fù)調(diào)控靶基因的表達。

腎纖維化(包括腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化)是各種原因引起的腎臟損害最后階段的主要病理基礎(chǔ)，腎纖維化發(fā)生機制較為復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，其中主要與細胞外基質(zhì)細胞產(chǎn)生細胞的增殖和活化，血管活性物質(zhì)、細胞因子以及細胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換失衡有關(guān)，腎間質(zhì)纖維化幾乎是所有原發(fā)或繼發(fā)腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑。

mirna是調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)源性非編碼小分子rna，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控，參與細胞周期、凋亡、發(fā)育、分化和新陳代謝等生理過程。mirna在細胞中表達失調(diào)會導(dǎo)致腎纖維化在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生，最新研究表明，一些mirna在腎纖維化患者的腎臟和尿液中異常表達，但何種mirna與腎纖維化的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)仍未達成共識。因此有必要尋找與腎纖維化發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的mirna，從而為臨床上判斷和治療腎纖維化提供一種有效手段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可用于判斷腎纖維化的mirna標(biāo)記物。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種用于預(yù)判腎纖維化風(fēng)險、診斷腎纖維化的mirna標(biāo)記物，所述mirna標(biāo)記物是mirna-576。所述mirna-576選自以下組中的至少一種：：mirna-576初始mirna、mirna-576前體mirna、成熟mirna-576；所述mirna-576初始mirna能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成熟mirna-576；所述mirna-576前體mirna能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成熟mirna-576。

應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的mirna-576包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其顯示完整mirna-576核酸分子相同的功能，盡管它們通過核苷酸殘基的缺失、置換或者插入而突變。

本領(lǐng)域人員熟知，為了保證mirna的穩(wěn)定性，可以在mirna的一端或者兩端增加保護性堿基，如tt，也可對mirna堿基進行修飾，但是不影響mirna的功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在不影響mirna-576功能的條件下，對mirna-576進行堿基修飾或者在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

在本發(fā)明的一些具體的實施方式中，所述mirna-576是成熟mirna-576。所述成熟mirna-576包括mirna-576-5p、mirna-576-3p，它們共同享有共同的種子序列。

雖然在某些具體實施方式中所使用的是成熟mirna-576，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期，初始mirna(pi-mirna-576)、前體mirna(pre-mirna-576)將可以獲得與成熟mirna-576同樣的技術(shù)效果，因為細胞有能力進一步將初始mirna(pi-mirna-576)、前體mirna(pre-mirna-576)加工為成熟mirna-576。

本發(fā)明的mirna-576核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的mirna-576主要呈單鏈形式，而mirna-576前體是部分自互補的，以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的核酸分子可以是rna、dna、pna、lna的形式。

本發(fā)明提供了mirna-576在制備預(yù)判腎纖維化風(fēng)險的工具中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了mirna-576在制備診斷腎纖維化的工具中的應(yīng)用。

本發(fā)明的實驗證明已發(fā)生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平顯著低于為未發(fā)生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平。因此，與未發(fā)生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平相比，如果受試者尿液中mirna-576的水平顯著降低，那么則可以判斷該受試者已發(fā)生腎纖維化，從而采取預(yù)防腎纖維化的方案或者為臨床治療方案的制定提供診斷基礎(chǔ)。

本發(fā)明還提供了mirna-576在判斷腎纖維化的工具中的應(yīng)用。與不發(fā)生腎纖維化的尿液中mirna-576的水平相比，如果受試者尿液中mirna-576的水平顯著境地，則表明受試者發(fā)生腎纖維化。

進一步，上述預(yù)判腎纖維化風(fēng)險、判斷腎纖維化是否發(fā)生的工具包括但不限于，芯片、試劑盒。所述工具包括用于待測樣本中mirna-576表達水平的試劑。所述試劑可以是針對mirna-576的引物或探針。

本發(fā)明還提供了上述mirna-576在高通量測序平臺中的應(yīng)用。通過高通量測序能獲知待檢測樣本腎組織或尿液中mirna-576的表達水平，將待測樣本的結(jié)果同未發(fā)生腎纖維化的腎組織或尿液相比，容易判斷待測樣本是否存在腎纖維化的風(fēng)險或者容易判斷待測樣本是否已經(jīng)發(fā)生了腎纖維化。因此，經(jīng)過高通量測序獲得mirna-576與腎纖維化相關(guān)性的應(yīng)用同樣包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)判腎纖維化風(fēng)險、診斷腎纖維化是否發(fā)生的芯片，所述芯片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于mirna-576的部分或全部序列。所述寡核苷酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的可用于判斷腎纖維化是否發(fā)生的mirna的寡核苷酸探針。將多種mirna的檢測探針放置在同一芯片上通過檢測多種mirna指標(biāo)聯(lián)合判斷腎纖維化的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

進一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因芯片領(lǐng)域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。

所述的mirna芯片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法，例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dt串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預(yù)定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的mirna芯片。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)判腎纖維化風(fēng)險、診斷腎纖維化是否發(fā)生的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測受試者腎組織或尿液中mirna-576的表達水平的試劑。與未發(fā)生腎纖維化的腎組織或尿液中的mirna-576的表達水平比較，若通過試劑盒檢測腎組織或尿液中mirna-576的表達水平顯著降低，則判斷該受試者的腎纖維化風(fēng)險很高或者已發(fā)生腎纖維化。

進一步，所述試劑包括針對mirna-576的引物和/或探針。所述試劑還包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的可用于判斷腎纖維化風(fēng)險，或者判斷腎纖維化是否發(fā)生的mirna的引物和/或探針。將多種mirna的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種mirna指標(biāo)聯(lián)合判斷腎纖維化的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的mirna-576可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達mirna-576的dna片段的載體轉(zhuǎn)染細胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。

病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及eb病毒)載體、甲病毒載體。

真核表達載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_載體，包括但不限于pcmv-myc表達載體、pcdna3.0表達載體、pcdna3.1表達載體、pegfp表達載體、pefbos表達載體、ptet表達載體、ptre表達載體、或者在公知表達載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pbin438、pcambia1301等。

可以表達mirna-576的dna片段可以通過如下方式獲?。簭膍irna數(shù)據(jù)庫中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)尋找mirna-576在基因組上的位置及具體序列信息，根據(jù)基因組序列確定mirna-576初始mirna的位置，在mirna-576初始mirna位置的上下游500-800bp區(qū)間內(nèi)設(shè)計特異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表達mirna-576的dna片段。

本發(fā)明還提供了前面所述的mirna-576在制備抑制或治療腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的實驗證明mirna-576與腎纖維化相關(guān)，在此基礎(chǔ)上，通過促進mirna-576的表達可用于抑制腎纖維化的發(fā)生或發(fā)展的風(fēng)險。

進一步，所述藥物包含mirna-576激動劑。所述mirna-576激動劑能夠促進mirna-576的表達或者能夠激活mirna-576的功能。所述mirna-576激動劑的抑制靶標(biāo)不限于mirna-576本身，還包括mirna-576的上下游，例如：編碼mirna-576的基因組序列，mirna-576靶基因、調(diào)控mirna-576的蛋白或者基因。

進一步，mirna-576抑制劑包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。

優(yōu)選地，所述mirna-576抑制劑是mirna-576的反義寡核苷酸或者mirna-576模擬物。

根據(jù)mirna-576序列容易設(shè)計出它的反義寡核苷酸，將反義寡核苷酸轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)后，它們能夠明顯下調(diào)mirna-576的表達?！胺戳x寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，as-ons或aso)”又稱為“反義核苷酸”，是指長度約為18-26nt(更特別的約19-22nt)的dna分子或rna分子或其類似物。

在本發(fā)明中，所述的“反義寡核苷酸”還包括采用如基于核酸鎖或核酸鏈骨架修飾技術(shù)等手段獲得的經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義寡核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義寡核苷酸的穩(wěn)定性、活性或治療效果。核酸鎖(lockednucleicacid，lna)通常是指通過一個亞甲基橋?qū)⒑颂堑?’氧原子和4’碳原子連接起來的修飾技術(shù)?；诤怂徭湽羌艿男揎椉夹g(shù)發(fā)展出的反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，例如將脫氧核苷酸鏈硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈。該方法是將dna骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。應(yīng)理解，任何能夠保持所述反義寡核苷酸的大部分或全部活性的修飾都包含在本發(fā)明中。

本發(fā)明的抑制腎纖維化的藥物還包含藥物學(xué)上可以接受的載體，所述載體包括但不限于：稀釋劑、緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮吸收劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。

所述藥物可以制成包括但不限于顯微注射劑、適于轉(zhuǎn)染的劑型、注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

所述藥物可以單獨施用；或者與其他能夠抑制腎纖維化的藥物進行組合施用。

所述藥物可以離體施用：將mirna-576或者mirna-576的表達載體在體外導(dǎo)入或轉(zhuǎn)染人體自身或異體細胞(或異種細胞)，經(jīng)體外細胞擴增后，輸回人體。

所述藥物可以體內(nèi)施用：將mirna-576或者mirna-576的表達載體直接導(dǎo)入體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸dna或rna。

所述的受試者可以是人類或者其他哺乳動物。更具體地，受試者是器官、組織、細胞。

附圖說明

圖1為mirna-576在腎纖維化人群和非纖維化人群的尿液中的表達情況；

圖2為腎小管上皮細胞hk-2在腎纖維化過程中的細胞形態(tài)變化情況；

圖3為mirna-576在腎纖維化細胞系中的表達情況；

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

本實施例證明mir-576在腎纖維化人群的尿液樣本中低表達。

1.mirna提取

使用tiangen的mirna提取試劑盒，每200μl尿液中加入等體積裂解液，振蕩器振蕩混勻30秒。室溫放置5min后，12,000rpm離心10min，取上清，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置5min后，12,000rpm離心15min，樣品會分成三層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，rna主要在水相中，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，緩慢加入轉(zhuǎn)移液體積1/3體積的無水乙醇混勻，一起轉(zhuǎn)入吸附柱，室溫放置2min,12,000rpm離心30秒，保留流出液。緩慢加入流出液體積2/3體積的無水乙醇，混勻，一起轉(zhuǎn)入吸附柱，室溫放置2min后12,000rpm離心30秒，離心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室溫12,000rpm離心30sec，棄廢液。500μl漂洗液，室溫12,000rpm離心30秒。將吸附柱放入2ml收集管中，室溫12,000rpm離心1min，去除殘余液體。再將吸附柱轉(zhuǎn)入一個新的1.5ml離心管中，加15-30μl無rna酶的水，室溫12,000rpm離心2min。

2.逆轉(zhuǎn)錄

將10pg-1μg的rna模板與2μl10倍緩沖液、2μldatp(10mm)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制劑和無核糖核酸酶水混合，體積最后為20μl，37℃孵育1h。然后反應(yīng)管中加入1μl0.5μg/μl特異性rt引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打斷rna和引物的二級結(jié)構(gòu)。最后，將上述20μl反應(yīng)混合物與4μl5倍緩沖液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5μl核糖核酸酶抑制劑，10μlpolya反應(yīng)混合液和4μl無核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

3.q-pcr檢測

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。配制以下反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl，正向引物(5μm/l)1μl，反向引物(5μm/l)1μl，模板cdna2μl，無酶水8.5μl。各項操作均于冰上進行。擴增程序為：95℃10min,(95℃20s，60℃55s)40個循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應(yīng)。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

4.結(jié)果

如圖1所示，在腎纖維化人群尿液中的mirna-576含量顯著低于未發(fā)生腎纖維化的人群(*p<0.05)，mirna-576能夠作為檢測腎纖維化的標(biāo)記物。

實施例2

本實施例證明mirna-576在腎纖維化細胞系中低表達。

1.emt細胞模型

emt是指上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，是腎纖維化過程的一部分。采用腎小管上皮細胞系hk-2細胞，在hk-2細胞培養(yǎng)液中加入tgf-β至終濃度為10ng/ml，培養(yǎng)48h后拍照觀察：未加入tgf-β的hk-2細胞具有典型的上皮細胞鵝卵石樣形態(tài)特征，胞間銜接緊密；加入tgf-β的hk-2顯示出梭形的形態(tài)，細胞間間隙明顯，細胞較為瘦縮，類似成纖維細胞的形態(tài)，如圖2所示。

2.mirna提取和反轉(zhuǎn)錄，參考實施例1中的實驗過程。

3.q-pcr檢測，參考實施例1中的實驗過程

4.結(jié)果

如圖3所示，在發(fā)生腎纖維化的細胞中，mirna-576的含量顯著低于對照細胞系(*p<0.05)，mirna-576是腎纖維化發(fā)生過程的標(biāo)記物。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

mir-576

auucuaauuucuccacgucuuu