本發(fā)明屬于細胞免疫領(lǐng)域，涉及cik細胞，具體涉及改性殼聚糖在cik細胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用及制備商品化培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿的用途。
背景技術(shù)：
：殼聚糖(chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-b-d葡萄糖。自1859年，法國人rouget首先得到殼聚糖后，這種天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等優(yōu)良性能被各行各業(yè)廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫(yī)學(xué)工程等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用研究取得了重大進展。針對患者，殼聚糖降血脂、降血糖的作用已有研究報告。生物治療是繼手術(shù)、化療及放療3種傳統(tǒng)模式之后的第4大腫瘤治療模式，前3種模式或毒副作用較大，或不能清除體內(nèi)殘存腫瘤細胞，大部分腫瘤患者終因復(fù)發(fā)或難治而導(dǎo)致死亡。細胞免疫治療技術(shù)在腫瘤的生物治療中占有重要地位,顯示出良好的應(yīng)用前景，并逐漸成為腫瘤治療的重要手段之一。細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine-inducedkillercell，cik)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非常有前景的過繼免疫細胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優(yōu)點，已經(jīng)成為腫瘤生物免疫治療的主力軍。cik細胞的主要效應(yīng)細胞為cd3+cd56+表型t淋巴細胞，兼有nk細胞和t細胞的特征。在功能上，cik一方面擁有t淋巴細胞強大抗腫瘤活性，另一方面擁有nk細胞非mhc限制性的殺傷腫瘤的特點，其增殖迅速、對正常造血影響輕微。cik細胞的擴增活力和殺瘤活性直接關(guān)系到治療成本和效果。目前尚未見殼聚糖及其衍生產(chǎn)品在cik細胞培養(yǎng)擴增方面的應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種改性殼聚糖，以及該改性殼聚糖在cik細胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用及制備商品化培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿的用途，該改性殼聚糖可以提高cik細胞的擴增活力和殺瘤活性，降低細胞治療成本并提升治療效果。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：一種離子液體輻照改性殼聚糖，由如下方法制備而成：用離子液體對殼聚糖輻照改性，所述離子液體的陽離子的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：其中，r為己基或辛基。優(yōu)選地，所述離子液體的陰離子為溴離子或氯離子，離子液體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：優(yōu)選地，所述改性殼聚糖由如下方法制備而成：先將離子液體用水溶解制成8-12mmol/l的離子液體水溶液，然后向該離子液體水溶液中添加殼聚糖，至完全溶解混合均勻，殼聚糖濃度為30-50g/l，再將該溶液于攪拌條件下輻照反應(yīng)，輻照劑量為40-60kgy，最后用乙醇沉淀洗滌、抽濾，收集濾餅，濾餅干燥研磨即得。上述改性殼聚糖在cik細胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用。一種用于cik細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，含有有效濃度的上述改性殼聚糖。一種用于cik細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)器皿內(nèi)壁包被有有效厚度的包被層，包被層的材料為上述改性殼聚糖。優(yōu)選地，該培養(yǎng)器皿內(nèi)部用氬氣填充密封。本發(fā)明優(yōu)點：本發(fā)明提供了一種改性殼聚糖，實驗證明該改性殼聚糖可以提高cik細胞的擴增活力和殺瘤活性，可以用于降低細胞治療成本并提升治療效果，用于制備商品化培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿。附圖說明圖1為各離子液體的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。具體實施方式為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例進一步介紹。實施例中未特別強調(diào)的實驗材料均為常規(guī)實驗材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。實施例1：改性殼聚糖的制備根據(jù)采用的離子液體種類不同，實驗分為4組平行操作，即己基溴化吡啶組、己基氯化吡啶組、辛基溴化吡啶組、辛基氯化吡啶組。改性方法如下：先將上述離子液體用水溶解制成10mmol/l的離子液體水溶液，然后向該離子液體水溶液中添加殼聚糖，至完全溶解混合均勻，殼聚糖濃度為40g/l，再將該溶液于攪拌條件下輻照反應(yīng)(輻照源為co60)，輻照劑量為50kgy，最后向溶液中加入95％乙醇(6倍于反應(yīng)溶液體積)靜置沉淀，抽濾洗滌收集濾餅，濾餅于40℃以下低溫干燥后研磨至80目。當然，離子液體水溶的濃度可以在8-12mmol/l調(diào)整，殼聚糖濃度可以在30-50g/l，輻照劑量可以在40-60kgy調(diào)整。干燥溫度不要超過40℃，否則會變色。各離子液體化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。實施例2：改性殼聚糖對cik細胞擴增活力和殺瘤活性的影響一、實驗材料10％胎牛血清和rpmi-1640培養(yǎng)液購于gibco公司，淋巴細胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司(tbd)，il-2購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，抗人cd3單抗購自gibco公司，ifn-γ購自美國peprotec公司，il-1α購自美國peprotec公司，cck-8試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。balb/c裸鼠，均選用雌性裸鼠，鼠齡6-7周，體重18-23g，在spf條件下的裸鼠室內(nèi)飼養(yǎng)，由南京大學(xué)實驗動物中心提供。胃癌mgc-803細胞購自上海歌凡生物細胞庫。二、實驗方法1、cik細胞的分離和培養(yǎng)(1)單個核細胞的分離：采集健康志愿者外周血，預(yù)冷的pbs1:1稀釋，緩慢加入淋巴細胞分離液上層，650g，4℃離心20min，收集白色細胞層，分離單個核細胞，rpmi-1640培養(yǎng)基重懸細胞后置于37℃，5％co2孵箱中孵育2h。(2)cik細胞的培養(yǎng)：收集單核細胞中的懸浮細胞，調(diào)整細胞密度至2.5×106/ml，均分為三組進行培養(yǎng)，分組及培養(yǎng)方法如下：常規(guī)組：0天時，在完全培養(yǎng)基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)，放入5％co2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24h后，添加il-2(500u/ml)、il-1α(l00u/ml)和抗人cd3單抗(20μg/ml)。每2-3d進行換液，并補充等量的細胞因子，在培養(yǎng)過程中，添加新鮮培養(yǎng)基前用臺盼藍染色檢測細胞的活率，統(tǒng)計細胞的絕對數(shù)目；連續(xù)培養(yǎng)12天，收集細胞；對比組：0天時，在完全培養(yǎng)基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和未改性殼聚糖(30μg/ml)，放入5％co2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24h后，按照常規(guī)組后續(xù)方法培養(yǎng)，統(tǒng)計細胞的絕對數(shù)目，收集細胞；誘導(dǎo)a-d組：0天時，在完全培養(yǎng)基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和上述己基溴化吡啶組、己基氯化吡啶組、辛基溴化吡啶組、辛基氯化吡啶組制備的改性殼聚糖(30μg/ml)，放入5％co2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24h后，按照常規(guī)組后續(xù)方法培養(yǎng)，統(tǒng)計細胞的絕對數(shù)目，收集細胞。2、cik細胞的體外腫瘤殺傷活性使用cck-8法檢測體外各組cik細胞對胃癌mgc-803細胞的殺瘤活性，以對數(shù)生長期的mgc-803細胞作為靶細胞，待貼壁培養(yǎng)24h后，分別以培養(yǎng)12天的各組cik細胞作為效應(yīng)細胞，分別置于37℃、5％co2、飽和濕度下的細胞培養(yǎng)箱中，待貼壁24h后，按效靶比為10:1加入效應(yīng)細胞，設(shè)效應(yīng)細胞對照與靶細胞對照，每組3個復(fù)孔，效應(yīng)細胞與靶細胞共培養(yǎng)24h后，每孔按10％的體積加入cck-8溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)4h后，酶聯(lián)免疫撿測儀選擇波長為450nm測定各孔光吸光值，并按照下式計算殺傷活性(殺傷率)：殺傷率＝[1-(實驗組od值-效應(yīng)細胞組od值)/靶細胞組od值]×l00％。3、cik細胞的體內(nèi)腫瘤殺傷活性將balb/c裸鼠右腋皮下接種0.2ml1×106/mlmgc-803胃癌細胞后，再隨機分成7組：對照組、常規(guī)組、對比組和誘導(dǎo)a-d組，每組20只。10d后常規(guī)組、對比組和誘導(dǎo)a-d組的每只裸鼠在接種腫瘤細胞部位處注射0.2ml1×107/ml的cik細胞(分別對應(yīng)按照上述常規(guī)組、對比組、誘導(dǎo)a-d組誘導(dǎo)培養(yǎng)12天)，對照組裸鼠注射0.2ml生理鹽水，連續(xù)注射5d。15d后每組剝離腫瘤塊并稱重，按照如下公式計算抑瘤率(％)：抑瘤率＝(對照組瘤質(zhì)量-實驗組瘤質(zhì)量)/對照組瘤質(zhì)量×100％。4、統(tǒng)計學(xué)分析使用spss20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行t檢驗，p<0.05認為差異顯著。三、實驗結(jié)果1、各組cik細胞的增殖與活率接種時各組都為2.5×106個細胞，培養(yǎng)至第12天時，各組增殖倍數(shù)如下表所示，與常規(guī)組相比，對比組無顯著性差異(p＞0.05)，誘導(dǎo)a-d組增殖倍數(shù)顯著提高，與常規(guī)組相比具有顯著性差異(p＜0.05)。每次補液前臺盼藍染色檢測細胞活率，保證活率約95％。常規(guī)組對比組誘導(dǎo)a組誘導(dǎo)b組誘導(dǎo)c組誘導(dǎo)d組增殖倍數(shù)1771852762793083022、體外各組cik細胞對胃癌mgc-803細胞的殺瘤活性分別取培養(yǎng)至第12天時各組cik細胞對mgc-803細胞進行殺傷實驗，在效靶比為10:1時，各組cik細胞均表現(xiàn)出明顯的殺瘤活性，其中誘導(dǎo)組制備的cik細胞比常規(guī)組和對比組制備的cik細胞具有更強的殺瘤活性，且差異顯著(p＜0.05)。各組cik細胞對mgc-803細胞的殺傷率如下表所示。3、體內(nèi)各組cik細胞對胃癌移植瘤的殺瘤活性全部實驗裸鼠在接種第7天時在接種部位均有腫瘤形成，直徑為0.8-1cm。cik細胞干預(yù)15天后，常規(guī)組、對比組、誘導(dǎo)組所有裸鼠的腫塊均有所縮小，而對照組所有裸鼠的腫塊均增大。解剖時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，常規(guī)組、對比組、誘導(dǎo)組的腫瘤塊較小且局限，而對照組的腫瘤塊大且有腫瘤局部浸潤現(xiàn)象。常規(guī)組、對比組、誘導(dǎo)組抑瘤率見下表。從上表可以看出，誘導(dǎo)組比常規(guī)組和對比組具有更優(yōu)的體內(nèi)抑瘤率，差異顯著(p＜0.05)。實施例3：改性殼聚糖的應(yīng)用(制備商品化培養(yǎng)基和包被培養(yǎng)瓶)培養(yǎng)基：在現(xiàn)有的rpmi-1640培養(yǎng)液中添加實施例1制備的改性殼聚糖，質(zhì)量體積濃度為30μg/ml，當然也可以設(shè)計成其他的濃度。包被細胞培養(yǎng)瓶：在現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)瓶(或其他可能用于cik細胞培養(yǎng)的容器，如培養(yǎng)皿)內(nèi)表面包被0.2-0.3mm厚度的包被層，包被層材料即為上述改性殼聚糖。在一個優(yōu)選實施例中，將包被有該包被層的細胞培養(yǎng)瓶中填充滿氬氣密封儲存。若不填充滿氬氣，50±5℃放置30天，包被層顏色顯著加深，由乳白色變成深褐色(cik細胞培養(yǎng)效果顯著降低)；若用氬氣保護則不會出現(xiàn)這種情況。該方法可以提高包被培養(yǎng)瓶的高溫穩(wěn)定性，延長保質(zhì)期。上述實施例僅用于進一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當明白，任何簡單替換或修改均不脫離本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。當前第1頁12