一種檢測(cè)二價(jià)銅離子的熒光探針及其制備方法與應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及精細(xì)化工領(lǐng)域中cu²⁺檢測(cè)用熒光分子探針，具體為一種基于羅丹明染料的cu²⁺熒光分子探針的的制備及其在生物細(xì)胞成像和水體系銅離子檢測(cè)方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅是生物體中基本的微量元素之一，在不同的生理過(guò)程中銅作為催化輔助因子起著很重要作用。但是，在生物體內(nèi)攝入過(guò)量的銅也會(huì)產(chǎn)生毒性，能引起wilson’s、menkes和alzheimer’s等神經(jīng)性疾病。由于人類長(zhǎng)期大量對(duì)銅的過(guò)度使用，銅也成為環(huán)境中的一種重要污染物。美國(guó)環(huán)保局（epa）規(guī)定飲用水中銅離子的最高限為20μmol·l^-1。由于銅對(duì)人類的生存和發(fā)展具有重要意義，所以在化學(xué)反應(yīng)和生命活動(dòng)中對(duì)銅離子的檢測(cè)是非常有意義的。鑒于其對(duì)生命和環(huán)境的重要性，過(guò)去幾年中科學(xué)家們一直致力于采用熒光探針實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子在生物和環(huán)境系統(tǒng)中檢測(cè)的研究。

近年來(lái)，熒光分子探針技術(shù)由于具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，已經(jīng)成為檢測(cè)金屬離子污染的重要手段。熒光增強(qiáng)傳感材料可減少檢測(cè)錯(cuò)誤，對(duì)復(fù)雜體系檢測(cè)準(zhǔn)確，可同時(shí)用多種檢測(cè)物對(duì)不同分析物進(jìn)行檢測(cè)。羅丹明類染料由于具有摩爾吸光率大、水溶性好、熒光量子產(chǎn)率高和發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)等特點(diǎn)，在銅離子識(shí)別的領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的重視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)銅離子的熒光分子探針存在檢測(cè)靈敏度低、選擇性差和對(duì)ph值敏感等問(wèn)題，本發(fā)明主要目的在于提供一種可檢測(cè)二價(jià)銅離子且靈敏度高、選擇性好和對(duì)ph值不敏感的熒光分子探針；另一目的是提供該熒光分子探針的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種化合物ⅰ，該化合物為3',6'-雙(二乙氨基)-2-（（肼叉亞乙基）氨螺[異吲哚-1,9'-占噸]-3-酮，其化學(xué)式為：c30h34n6o2，具有如下結(jié)構(gòu)式：

。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了另外一種化合物即化合物ⅱ，該化合物為(e)-2-((3',6'-雙(二乙氨基)-3-氧螺[異吲哚-1,9'-占噸]-2-烯)亞胺)乙醛，具有如下結(jié)構(gòu)式：

。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述化合物ⅰ的制備方法，包括如下步驟：

在反應(yīng)容器中，加入1份(e)-2-((3',6'-雙(二乙氨基)-3-氧螺[異吲哚-1,9'-占噸]-2-烯)亞胺)乙醛和無(wú)水乙醇以及6份水合肼，加熱攪拌回流反應(yīng)，反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇，再分別加入50份二氯甲烷以及150份飽和氯化鈉溶液；分液漏斗分離，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，粗產(chǎn)物以柱色譜分離，得到化合物ⅰ。

在化合物ⅰ的制備過(guò)程中，加熱攪拌回流反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)溫度為30～60℃，優(yōu)選為40℃；加熱攪拌回流反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)時(shí)間為1～3h，優(yōu)選為1.5h。所述柱色譜采用體積比為1:5的乙酸乙酯和石油醚。

本發(fā)明再進(jìn)一步提供了一種化合物ⅲ，該化合物為2-氨基-3',6'-雙(二乙氨基)螺[異吲哚-1,9'-占噸]-3-酮，具有如下結(jié)構(gòu)式：

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本發(fā)明還提供了所述的化合物ⅱ的制備方法，包括如下步驟：

在反應(yīng)容器中，加入1份所述的化合物ⅲ、30份乙醇與3份乙二醛，加熱攪拌，反應(yīng)完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇，再分別加入50份二氯甲烷以及150份飽和氯化鈉溶液；分液漏斗分離，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，以柱色譜分離，得化合物ⅱ。

在化合物ⅱ的制備過(guò)程中，加熱攪拌過(guò)程的反應(yīng)溫度為30～60℃，優(yōu)選為40℃；加熱攪拌過(guò)程的反應(yīng)時(shí)間為1～3h，優(yōu)選為2h。

本發(fā)明更進(jìn)一步的提供了化合物ⅲ的制備方法，包括如下步驟：

在反應(yīng)容器中，加入1份羅丹明b（化合物ⅳ）和30份乙醇，室溫下攪拌，慢慢滴入5份水合肼；滴加完畢后，攪拌加熱回流，反應(yīng)完成后，冷卻溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇；然后加入鹽酸，不斷攪拌下，再慢慢加入氫氧化鈉溶液，直到ph達(dá)到9-10之間，出現(xiàn)大量白色沉淀；過(guò)濾，并用水洗滴濾餅3次；然后溶于二氯甲烷，以無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干溶劑得到化合物ⅲ。

在化合物ⅲ的制備過(guò)程中，室溫下攪拌過(guò)程的反應(yīng)時(shí)間為0.5～1.5h，優(yōu)選為1h；攪拌加熱回流的溫度為80℃、時(shí)間為1～3h，優(yōu)選為2h。

在化合物ⅰ、化合物ⅱ以及化合物ⅲ制備過(guò)程中，所有無(wú)水硫酸鈉干燥時(shí)間均優(yōu)選的為1h。

為了更清楚的說(shuō)明本發(fā)明所述化合物ⅰ、化合物ⅱ以及化合物ⅲ之間的關(guān)系，本發(fā)明提供了化合物ⅰ的制備路線：

上述制備路線是通過(guò)如下步驟：

將羅丹明b（ⅳ）溶于乙醇中，加入水合肼，回流，反應(yīng)結(jié)束后得羅丹明b酰肼ⅲ（化合物ⅲ）；然后將羅丹明b酰肼ⅲ溶于乙醇中，加入乙二醛反應(yīng)得化合物ⅱ，最后化合物ⅱ和水合肼反應(yīng)，經(jīng)過(guò)柱分離，真空干燥得化合物ⅰ純品。在本說(shuō)明書的實(shí)施例中更詳細(xì)地說(shuō)明了該化合物的合成和分析檢測(cè)方法。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述的化合物ⅰ、或者所述化合物ⅰ的制備方法制備獲得的化合物ⅰ作為熒光探針在二價(jià)銅離子的痕量分析檢測(cè)和活細(xì)胞內(nèi)銅離子熒光成像中的應(yīng)用。

為了更清楚的說(shuō)明本發(fā)明所述化合物ⅰ的應(yīng)用，本發(fā)明還提供了痕量二價(jià)銅離子含量測(cè)定的溶液體系，具體為：

在乙腈/水（1/1，v/v，10mmtris-hcl,ph=7.15)溶液中，加入用乙腈/水配制成的化合物ⅰ母液，稀釋，混合均勻后，加入待測(cè)樣品中，利用熒光光譜法定性和定量檢測(cè)溶液中的銅離子?；衔铫?duì)cu²⁺有高效的識(shí)別性能，加入銅離子能引發(fā)明顯的顏色變化：溶液的顏色從無(wú)色變成紫色，熒光從無(wú)色變成玫瑰紅色，同時(shí)探針?lè)肿英。ɑ衔铫。┑目垢蓴_能力強(qiáng)和檢測(cè)限較低。具體應(yīng)用如下：將探針?lè)肿英∨渲瞥?.5mm的溶液，然后稀釋成10μm。在乙腈和水溶液中，加入5當(dāng)量的二價(jià)銅離子之后，在571nm出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)的發(fā)射峰。

本發(fā)明提供的化合物ⅰ作為熒光探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)二價(jià)銅離子染色：探針?lè)肿油高^(guò)細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的銅離子絡(luò)合發(fā)出熒光，用熒光顯微鏡能清晰地觀察到發(fā)射玫瑰紅色熒光的細(xì)胞成像。即該熒光探針可用于活體細(xì)胞的熒光成像技術(shù)。

本發(fā)明的熒光探針用于待測(cè)物中二價(jià)銅離子的痕量檢測(cè)，具有如下特征：1.選擇性好。分子探針ⅰ在乙腈/水溶液體系中對(duì)二價(jià)銅離子可以很好地識(shí)別，常見(jiàn)金屬離子（na⁺，k⁺，mg²⁺，ca²⁺，ba²⁺，mn²⁺，cd²⁺，cr³⁺，co²⁺，ni²⁺，ag⁺，pb²⁺，zn²⁺，fe³⁺,hg²⁺）對(duì)其檢測(cè)干擾很小；2.靈敏度高，在水溶液中該探針對(duì)銅離子的線性響應(yīng)范圍至少為5.9×10^-8~2.3×10^-6mol/l。最低檢出限為4.1×10^-8mol/l；3.熒光及顏色變化肉眼可見(jiàn)；4.該探針對(duì)ph不敏感；5.該探針可以應(yīng)用于環(huán)境水體系、活體細(xì)胞中銅離子的檢測(cè)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。

本發(fā)明所述的熒光探針可以用于水環(huán)境和生物細(xì)胞體系中二價(jià)銅離子的含量檢測(cè)，具體為熒光檢測(cè)和細(xì)胞成像檢測(cè)。

本發(fā)明所提供的一類似羅丹明熒光團(tuán)為母體的熒光探針的制備方法，反應(yīng)條件溫和，合成步驟少，產(chǎn)物產(chǎn)率高，原料價(jià)廉易得。本發(fā)明所提供的熒光探針對(duì)銅離子選擇性和靈敏度高，檢測(cè)限低至亞納摩爾級(jí)，并且可用肉眼來(lái)識(shí)別熒光及顏色的變化，是一種良好的檢測(cè)銅離子的熒光探針。本發(fā)明所提供的熒光探針還可應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)銅離子的熒光成像，在與銅離子相關(guān)疾病的早期診斷及致病機(jī)理研究上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的化合物i在cdcl3試劑中的氫核磁共振譜圖。

圖2是本發(fā)明的化合物i在cdcl3試劑中的碳核磁共振譜圖。

圖3為本發(fā)明化合物i對(duì)二價(jià)銅離子的熒光滴定光譜圖（圖3a）和紫外滴定光譜圖（圖3b）。激發(fā)波長(zhǎng)為520nm。化合物i的終濃度為10μm,逐漸加入0～70μm的cu²⁺,測(cè)試體系為乙腈水溶液（乙腈/水=1/1,v/v，10mmtris-hcl，ph=7.15）。

圖4是本發(fā)明化合物i對(duì)cu²⁺的選擇性的熒光發(fā)射光譜（圖4a）及紫外吸收光譜（圖4b），熒光探針化合物i的濃度為10μm，cu²⁺的濃度為50μm，其他常見(jiàn)陽(yáng)離子的濃度為50μm。激發(fā)波長(zhǎng)為520nm。

圖5是本發(fā)明的化合物i在乙腈水溶液中檢測(cè)銅離子時(shí)對(duì)常見(jiàn)陽(yáng)離子的抗干擾熒光對(duì)比圖?；衔飅的濃度10μm，銅離子和其他常見(jiàn)陽(yáng)離子的濃度50μm。激發(fā)波長(zhǎng)為520nm，發(fā)射波長(zhǎng)為571nm。

圖6是本發(fā)明的化合物i在乙腈水溶液中檢測(cè)銅離子時(shí)對(duì)常見(jiàn)陰離子的抗干擾熒光對(duì)比圖。化合物i的濃度10μm，銅離子和其他常見(jiàn)陰離子的濃度50μm。激發(fā)波長(zhǎng)為520nm，發(fā)射波長(zhǎng)為571nm。

圖7是用cu²⁺與edta檢驗(yàn)本發(fā)明的化合物i對(duì)cu²⁺識(shí)別的不可逆過(guò)程?；衔飅的濃度10μm，cu²⁺的濃度為50μm，加入過(guò)量的edta，測(cè)試體系的熒光光譜。

圖8是本發(fā)明的化合物i溶液在銅離子加入前后溶液顏色的變化。

圖9是本發(fā)明的化合物i溶液在銅離子加入前后溶液用紫外燈照射后熒光顏色的變化。

圖10是ph對(duì)本發(fā)明的化合物i熒光光譜的影響。

圖11本發(fā)明的化合物i應(yīng)用與細(xì)胞中對(duì)外源性銅離子進(jìn)行熒光成像圖。其中（a）探針濃度為10μm加入到hela細(xì)胞中培養(yǎng)30min后明場(chǎng)圖，（b）cu²⁺加入前熒光成像圖，（c）cu²⁺加入后明場(chǎng)圖，（d）cu²⁺加入后熒光成像圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明。這些實(shí)施例僅起說(shuō)明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。在本發(fā)明中所有的原料或添加劑的“份”均指的是質(zhì)量份。在下面的實(shí)施例中，所有提及的乙腈/水溶液、或者乙腈水溶液、或者水乙腈溶液、或者水/乙腈溶液均是乙腈/水（1/1，v/v，10mmtris-hcl,ph=7.15)溶液。

實(shí)施例1：熒光探針i的制備

步驟一：化合物ⅱ根據(jù)文獻(xiàn)bioorganic&medicinalchemistryletters,2013,23,2916–2919方法合成。

步驟二：將300.0mg化合物ⅱ加入20ml無(wú)水乙醇中，再加入85%的水合肼2.0ml（1.7g），然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，回流反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，將溶液冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇，再分別加入50份二氯甲烷以及150份飽和氯化鈉溶液；分液漏斗分離，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干溶劑；用石油醚（bp60-90°c）/乙酸乙酯(v:v)=5:1為展開(kāi)劑通過(guò)硅膠柱色譜分離，真空干燥得273.1mg的黃色固體化合物ⅰ。產(chǎn)率：89.2%。

由于步驟一合成的化合物ⅱ有部分雜質(zhì)，因此近似的認(rèn)為化合物ⅱ與水合肼的質(zhì)量比為1:6。

¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)=7.94(dd,j=8.0,4.0hz,1h),7.52–7.38(m,2h),7.11(dd,j=8.0,4.0hz,1h),6.47(s,1h),6.45(s,1h),6.42(d,j=2.4hz,2h),6.30(d,j=2.4hz,1h),6.28(d,j=2.4hz,1h),3.62(s,2h),3.34(q,j=7.0hz,8h),1.17(t,j=7.0hz,12h)。

¹³c-nmr(100mhz,cdcl3):δ(ppm)=¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ166.20,153.86,151.56,148.89,147.21,135.88,132.56,130.00,128.16,128.12,123.85,123.01,108.02,104.45,97.93,65.97,44.38,12.62。

hrms(esi)m/z:計(jì)算值c30h35n6o2[m+h]⁺511.2821;實(shí)測(cè)值511.2818。

ft-ir(kbr,cm^-1):3425,2977,2932,2901,1736,1698,1635,1615,1556,1511,1470,1431,1379,1333,1255,1237,1123,1083,1051,1013,877,857,821,761,711,650。

實(shí)施例2：化合物i與不同濃度cu²⁺作用后的光譜變化

將化合物i以10μm的濃度加入到乙腈/水溶液中，然后逐漸增大加入的銅離子濃度(0～70μm)，記錄響應(yīng)的紫外和熒光光譜，測(cè)試結(jié)果顯示于圖3a和3b中，從圖中可以看出，隨著銅離子濃度的增加，562nm處的紫外吸收強(qiáng)度和571nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸增加，在cu²⁺達(dá)到60μm時(shí)，紫外吸收和熒光強(qiáng)度達(dá)到飽和，再增加cu²⁺濃度，二者強(qiáng)度均不再增加。

實(shí)施例3：化合物i對(duì)常見(jiàn)陽(yáng)離子的選擇性

使用化合物i評(píng)價(jià)對(duì)銅離子的選擇性，將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的二價(jià)銅離子和各種常見(jiàn)陽(yáng)離子的乙腈水溶液中（分別為化合物i與二價(jià)銅離子的乙腈水溶液、化合物i與任一一種常見(jiàn)陽(yáng)離子的乙腈水溶液），測(cè)試結(jié)果顯示于圖4中（紫外光譜和熒光光譜）。從圖中可以看到，化合物i（探針）對(duì)二價(jià)銅離子具有很高的選擇性，銅離子的加入使得化合物i的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而其他常見(jiàn)陽(yáng)離子的加入則無(wú)明顯變化。

實(shí)施例4：常見(jiàn)陽(yáng)離子對(duì)化合物i檢測(cè)cu²⁺的干擾研究

將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的cu²⁺和50μm的各種常見(jiàn)陽(yáng)離子的乙腈水溶液中，激發(fā)波長(zhǎng)為520nm，發(fā)射波長(zhǎng)為571nm，測(cè)試結(jié)果顯示于圖5。從圖中可以看到，化合物針i對(duì)二價(jià)銅離子具有很高的選擇識(shí)別能力和抗干擾能力，檢測(cè)cu²⁺時(shí)幾乎不受常見(jiàn)陽(yáng)離子的干擾。圖5中橫坐標(biāo)中的none表示的是將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的銅離子的乙腈水溶液中，其他均是將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的銅離子和任一一種常見(jiàn)陽(yáng)離子的乙腈水溶液中。

實(shí)施例5:常見(jiàn)陰離子對(duì)化合物i檢測(cè)cu²⁺的干擾研究

將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的cu²⁺和50μm的各種常見(jiàn)陰離子的測(cè)試乙腈水溶液中，激發(fā)波長(zhǎng)為520nm，發(fā)射波長(zhǎng)為571nm，測(cè)試結(jié)果顯示于圖6。從圖中可以看到，化合物i對(duì)二價(jià)銅離子具有很高的選擇識(shí)別能力和抗干擾能力，檢測(cè)cu²⁺時(shí)幾乎不受常見(jiàn)陰離子的干擾。圖6中橫坐標(biāo)中的none表示的是將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的銅離子的乙腈水溶液中，其他均是將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的銅離子和任一一種常見(jiàn)陰離子的乙腈水溶液中。

實(shí)施例6:化合物i作為熒光分子探針對(duì)cu²⁺檢測(cè)的可逆性測(cè)試

把cu²⁺加到化合物i的乙腈/水溶液中，使化合物i的熒光恢復(fù)，然后加入過(guò)量的cu²⁺絡(luò)合劑edta，發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)幾乎沒(méi)有發(fā)生變化（見(jiàn)圖7）。表明這個(gè)識(shí)別過(guò)程不可逆。

實(shí)施例7：化合物i對(duì)cu²⁺的可視化檢測(cè)

將濃度為10μm的化合物i加到含有50μm的cu²⁺的乙腈水溶液中，如圖8所示，cu²⁺可以使化合物i的乙腈水溶液發(fā)生明顯的顏色變化，溶液顏色從無(wú)色變成紫紅色，伴隨著紫外燈下肉眼可視的cu²⁺誘導(dǎo)作為熒光探針的化合物i發(fā)出明亮的玫瑰紅色熒光（圖9），說(shuō)明是一種具有雙通道識(shí)別功能的熒光探針。

實(shí)施例8：化合物i熒光光譜和ph的關(guān)系。

配制濃度為10μm化合物i的乙腈水溶液，用ph計(jì)把體系的ph值調(diào)到11.0，然后，從ph=11.0到ph=2.3進(jìn)行熒光滴定。檢測(cè)ph對(duì)化合物i熒光光譜的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10，在ph=5.0～11.0范圍內(nèi)，化合物i幾乎沒(méi)有熒光，說(shuō)明化合物i對(duì)ph不敏感。

實(shí)施例9：化合物i作為熒光探針對(duì)細(xì)胞外源性cu²⁺熒光成像

我們將本發(fā)明化合物i應(yīng)用于hela細(xì)胞中對(duì)外源性的銅離子進(jìn)行熒光成像應(yīng)用。具體操作步驟如下：在37℃將10μm探針加入到育有hela細(xì)胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)30min后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像。首先進(jìn)行明場(chǎng)成像，可以看到細(xì)胞大致的輪廓，然后進(jìn)行激發(fā)觀察在未加入cu²⁺前的熒光成像情況，此時(shí)觀察不到熒光發(fā)射。向體系中加入50μmcu²⁺的水溶液后，等待10min后進(jìn)行激發(fā)可以觀察到有熒光發(fā)出，說(shuō)明此熒光探針可以對(duì)外源性的cu²⁺進(jìn)行熒光成像。具體結(jié)果見(jiàn)圖11。