一種用于研究破骨細(xì)胞融合的熒光蛋白標(biāo)記方法與流程

本發(fā)明屬于醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種用于研究破骨細(xì)胞融合的熒光蛋白標(biāo)記方法。

背景技術(shù)：

在本技術(shù)之前，用于觀察破骨細(xì)胞融合的技術(shù)主要有兩類：1.借助延時(shí)攝影顯微鏡(time-lapsemicrescope)進(jìn)行活細(xì)胞攝影；2.借助病毒包裝原理進(jìn)行研究。具體如下：

延時(shí)攝影技術(shù)：即借助延時(shí)攝影顯微鏡每間隔一定時(shí)間采集明場(chǎng)中活細(xì)胞的圖像，借此研究是否發(fā)生了破骨細(xì)胞的融合。但是明場(chǎng)情況下即便放大倍數(shù)很高也無(wú)法清晰直觀地觀察破骨細(xì)胞融合過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核數(shù)目等細(xì)節(jié)，更不能定量分析多少細(xì)胞發(fā)生了融合。因此無(wú)法研究干預(yù)因素對(duì)破骨細(xì)胞融合過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞核數(shù)目、融合的細(xì)胞數(shù)目等方面的影響。

例如下例已發(fā)表的研究，如圖7。

在明場(chǎng)環(huán)境下只能觀察到細(xì)胞間類似“相互靠近”的距離變化，而后發(fā)生了細(xì)胞形態(tài)的模糊改變。無(wú)法觀察到具體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核數(shù)目的改變；更無(wú)法定量分析此刻有多少細(xì)胞發(fā)生了融合。

病毒包裝原理：即將包裝障礙的熒光報(bào)道基因標(biāo)記的病毒質(zhì)粒和輔助包裝質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到破骨前體細(xì)胞系raw264.7中，若破骨前體細(xì)胞系發(fā)生了融合則會(huì)產(chǎn)生包裝完成（具有感染能力）的成熟的熒光報(bào)道基因標(biāo)記的病毒上清液。將這個(gè)上清液加到模式細(xì)胞系的培養(yǎng)基中，則模式細(xì)胞系被上述病毒感染后可在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達(dá)。但這個(gè)過(guò)程是間接地研究破骨細(xì)胞融合，完全不能觀察到破骨細(xì)胞融合過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核數(shù)目等細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。并且也無(wú)法直接定量破骨細(xì)胞的融合數(shù)目。并且過(guò)程繁復(fù)耗時(shí)，病毒包裝的技術(shù)復(fù)雜，所需實(shí)驗(yàn)儀器和試劑較多；更嚴(yán)重的是存在病毒感染的生物安全問(wèn)題，不是每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室都能開(kāi)展研究（僅限具有病毒研究的生物安全等級(jí)較高的研究室）。

實(shí)驗(yàn)示意圖如圖8。

研發(fā)過(guò)程中遇到的難題：如何能夠可視地、清晰地觀察到破骨細(xì)胞融合的全程。并且在這個(gè)過(guò)程中還能觀察到細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核數(shù)目的改變。更難地是還要能用于定量研究干擾因素對(duì)破骨細(xì)胞融合效率的影響。

如果能夠得到便捷、清晰、直觀、可視、便捷的技術(shù)去觀察破骨細(xì)胞融合過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞核數(shù)目等細(xì)胞行為的改變；同時(shí)最好還能定量研究干預(yù)因素對(duì)破骨細(xì)胞融合效率的影響的方法，是現(xiàn)在的需求和發(fā)展趨勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于研究破骨細(xì)胞融合的熒光蛋白標(biāo)記方法，可以直觀可視地觀察破骨細(xì)胞融合過(guò)程，從而觀察破骨細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核數(shù)目及可以定量研究融合的細(xì)胞數(shù)目；也可以利用本熒光標(biāo)記方法直觀可視地觀察到這些因素對(duì)融合過(guò)程、融合效率和融合中細(xì)胞行為產(chǎn)生了哪些影響，從而為研究破骨細(xì)胞融合提供了簡(jiǎn)便、可靠的工具。

解決以上技術(shù)問(wèn)題的本發(fā)明中的一種用于研究破骨細(xì)胞融合的熒光蛋白標(biāo)記方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）將含ctsk-cre轉(zhuǎn)基因的小鼠原代骨髓單核細(xì)胞（bonemarrowmonocytes,bmms）和含rosa^mtmg的轉(zhuǎn)基因小鼠原代骨髓單核細(xì)胞以3:1-1:3的比例混合培養(yǎng)；

（2）進(jìn)行破骨分化向誘導(dǎo)；

（3）熒光顯微鏡觀察。

所述步驟（1）中混合培養(yǎng)前先cre重組酶能特異性識(shí)別loxpdna序列，使loxp位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組，從而實(shí)現(xiàn)條件性基因打靶，混合培養(yǎng)后ctsk-cre轉(zhuǎn)基因的小鼠原代骨髓單核細(xì)胞與rosa^mtmg的轉(zhuǎn)基因小鼠原代骨髓單核細(xì)胞發(fā)生融合，最終產(chǎn)生綠色熒光蛋白。

ctsk在骨骼系統(tǒng)中是破骨細(xì)胞特異性表達(dá)的基因，因此cre重組酶只在破骨細(xì)胞中表達(dá)。而rosa^mtmg轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞在無(wú)cre重組酶時(shí)細(xì)胞膜表達(dá)紅色熒光蛋白，而在cre重組酶存在的情況下則通過(guò)上述cre/loxp系統(tǒng)原理剪切掉紅色熒光蛋白的基因而啟動(dòng)綠色熒光蛋白基因的表達(dá)，此時(shí)的細(xì)胞膜上表達(dá)綠色熒光蛋白。

所述步驟（1）中培養(yǎng)條件為：含10%fbs，1%p/s的dmem培養(yǎng)基，37℃恒溫孵箱，5%二氧化碳，95%氧氣。

所述培養(yǎng)條件中，混合后細(xì)胞總量達(dá)到以下要求：a、96孔板細(xì)胞總量為3000-8000，培養(yǎng)基體積為100ul；b、其他的孔板或者培養(yǎng)皿應(yīng)根據(jù)其底面積與96孔板的底面積進(jìn)行比例換算，得到最終的混合細(xì)胞量。

所述步驟（2）中誘導(dǎo)過(guò)程：混合培養(yǎng)的第一天在培養(yǎng)基中加入濃度為50ng/ml的mscf（巨噬細(xì)胞集落刺激因子macrophagecolony-stimulatingfactor）,混合培養(yǎng)第三天全換液，液體為所述步驟（1）中配制的培養(yǎng)基，并加入50ng/mlmcsf+50ng/mlrankl（核因子κb受體活化因子配體）。

所述步驟（1）中ctsk-cre轉(zhuǎn)基因的小鼠原代骨髓單核細(xì)胞和含rosa^mtmg的轉(zhuǎn)基因小鼠原代骨髓單核細(xì)胞以3:1-1:3的比例混合培養(yǎng)。

所述步驟（3）熒光顯微鏡觀察中紅色熒光采用tdtomato適用的檢測(cè)參數(shù)，激發(fā)峰554nm，發(fā)射峰581nm；綠色熒光采用egfp適用的檢測(cè)參數(shù)，激發(fā)峰488nm，發(fā)射峰507nm。

本發(fā)明中破骨分化向誘導(dǎo)后第三天起開(kāi)始觀察。

本發(fā)明中將兩種轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓單核細(xì)胞混合破骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)，借助熒光顯微鏡即可觀察到破骨細(xì)胞融合的過(guò)程（含ctsk-cre的細(xì)胞若與含rosa^mtmg的細(xì)胞融合，則融合后的細(xì)胞中既含有cre又含有rosa^mtmg；故融合后的細(xì)胞膜表達(dá)綠色熒光蛋白），并且能夠可視化的得到融合過(guò)程中破骨細(xì)胞數(shù)目形態(tài)的變化以及定量分析發(fā)生了融合的破骨細(xì)胞數(shù)目（定量計(jì)數(shù)綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目）。

本發(fā)明中還可以借助細(xì)胞核熒光染料如hoechst或dapi，從而觀察融合過(guò)程中細(xì)胞核數(shù)目的改變。在熒光顯微鏡下觀察前，可用終濃度為100ng/ml的dapi染色1分鐘或用終濃度為1ug/ml的hoechst染色20分鐘，去除染料后用pbs清洗3次，然后加入100ul的pbs于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

在觀察融合的方法中，本發(fā)明中方法直觀、簡(jiǎn)單，具有無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞染色、不需要進(jìn)行轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢(shì)。并且可以利用有無(wú)綠色熒光出現(xiàn)作為融合與否的標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確性和可重復(fù)性高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)通過(guò)延時(shí)攝影顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的方法，也避免了觀察者對(duì)細(xì)胞形態(tài)的誤判造成結(jié)果的偏差。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做更進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明中的原理示意圖

圖2為本發(fā)明中實(shí)施例1的細(xì)胞熒光圖

圖3-圖6為本發(fā)明中實(shí)施例2的細(xì)胞熒光圖

圖7為本發(fā)明中延時(shí)攝影技術(shù)的觀察圖

圖8為本發(fā)明中病毒包裝實(shí)驗(yàn)示意圖

其中標(biāo)識(shí)為：1.綠色熒光陽(yáng)性標(biāo)記

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中cre重組酶能特異性識(shí)別loxpdna序列，使loxp位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組，從而實(shí)現(xiàn)條件性基因打靶。利用cre/loxp系統(tǒng)原理，將含ctsk-cre轉(zhuǎn)基因的小鼠原代骨髓單核細(xì)胞（bonemarrowmonocytes,bmms）和含rosa^mtmg的轉(zhuǎn)基因小鼠原代骨髓單核細(xì)胞混合培養(yǎng)，并進(jìn)行破骨分化向誘導(dǎo)。因ctsk在骨骼系統(tǒng)中是破骨細(xì)胞特異性表達(dá)的標(biāo)志，因此cre重組酶只在破骨細(xì)胞中表達(dá)。而rosa^mtmg轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞在無(wú)cre重組酶時(shí)細(xì)胞膜表達(dá)紅色熒光蛋白，而在cre重組酶存在的情況下則通過(guò)上述cre/loxp系統(tǒng)原理剪切掉紅色熒光蛋白的基因而啟動(dòng)綠色熒光蛋白基因的表達(dá)，因此此時(shí)的細(xì)胞膜上表達(dá)綠色熒光蛋白。因此將上述兩種轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓單核細(xì)胞混合破骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)的這個(gè)過(guò)程中，借助熒光顯微鏡即可觀察到破骨細(xì)胞融合的過(guò)程（含ctsk-cre的細(xì)胞若與含rosa^mtmg的細(xì)胞融合，則融合后的細(xì)胞中既含有cre又含有rosa^mtmg；故融合后的細(xì)胞膜表達(dá)綠色熒光蛋白），并且能夠可視化的得到融合過(guò)程中破骨細(xì)胞數(shù)目形態(tài)的變化以及定量分析發(fā)生了融合的破骨細(xì)胞數(shù)目（定量計(jì)數(shù)綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)目）。借助細(xì)胞核熒光染料如hoechst或dapi還可以觀察融合過(guò)程中細(xì)胞核數(shù)目的改變。

原理示意如圖1。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說(shuō)明：

實(shí)施例1

將ctsk-cre轉(zhuǎn)基因小鼠與rosa^mtmg轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓單核細(xì)胞分離，以1:1的比例混合培養(yǎng)。

混合培養(yǎng)后ctsk-cre轉(zhuǎn)基因的小鼠原代骨髓單核細(xì)胞與rosa^mtmg的轉(zhuǎn)基因小鼠原代骨髓單核細(xì)胞發(fā)生融合。cre重組酶能特異性識(shí)別loxpdna序列，使loxp位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組，從而實(shí)現(xiàn)條件性基因打靶，最終產(chǎn)生綠色熒光蛋白。

培養(yǎng)條件為：dmem培養(yǎng)基（含10%fbs，1%p/s），37℃恒溫孵箱，5%二氧化碳，95%氧氣。

培養(yǎng)條件中，混合后細(xì)胞總量達(dá)到以下要求：a、96孔板細(xì)胞總量為3000-8000，培養(yǎng)基體積為100ul；b、其他的孔板或者培養(yǎng)皿應(yīng)根據(jù)其底面積與96孔板的底面積進(jìn)行比例換算，得到最終的混合細(xì)胞量。

混合培養(yǎng)的第一天加入mscf（終濃度為50ng/ml），第三天全換液，培養(yǎng)基中加入50ng/mlmcsf+50ng/mlrankl。

并從第三天起觀察融合細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞核數(shù)目和融合細(xì)胞的數(shù)目改變。結(jié)果如下圖2。

熒光顯微鏡觀察中紅色熒光采用tdtomato適用的檢測(cè)參數(shù)，激發(fā)峰554nm，發(fā)射峰581nm；綠色熒光采用egfp適用的檢測(cè)參數(shù)，激發(fā)峰488nm，發(fā)射峰507nm。

在熒光顯微鏡下觀察，破骨向分化誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3天觀察到一定量的綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。細(xì)胞形態(tài)較修長(zhǎng)，胞體較小，細(xì)胞核多為1-2個(gè)。第4-5天觀察到綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞體積變大，細(xì)胞核數(shù)目也增加為2-8個(gè)。第6天開(kāi)始細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)不對(duì)稱性（極性），并且在第7天觀察到融合后多核的綠色熒光細(xì)胞相互接近，細(xì)胞伸出“偽足樣”細(xì)胞突連通，細(xì)胞核數(shù)目繼續(xù)增加。第8-10天融合后的綠色熒光細(xì)胞的體積更大，細(xì)胞形態(tài)較融合初期發(fā)生了明顯的改變，同時(shí)細(xì)胞核的數(shù)目在第10天為10-16個(gè)。

利用這種熒光標(biāo)記方法第一次使得整個(gè)融合過(guò)程中破骨細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的移動(dòng)和融合的細(xì)胞行為（如融合前細(xì)胞相互接近、融合后的細(xì)胞還可以繼續(xù)融合等）清楚地可視化。利用原有的延時(shí)攝影技術(shù)因其信息有限，模糊粗略且需要依靠觀察者大量的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)去判斷哪些是融合后細(xì)胞，所以無(wú)法清晰直觀地觀察到細(xì)胞行為的改變和細(xì)胞形態(tài)的變化。因此本熒光標(biāo)記方法直觀，可視，可靠性高，操作簡(jiǎn)單。

實(shí)施例2

將ctsk-cre轉(zhuǎn)基因小鼠與rosa^mtmg轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓單核細(xì)胞分離，以1:1的比例混合培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件為：dmem培養(yǎng)基（含10%fbs，1%p/s），37℃恒溫孵箱，5%二氧化碳，95%氧氣。

培養(yǎng)條件中，混合后細(xì)胞總量達(dá)到以下要求：a、96孔板細(xì)胞總量為3000-8000，培養(yǎng)基體積為100ul；b、其他的孔板或者培養(yǎng)皿應(yīng)根據(jù)其底面積與96孔板的底面積進(jìn)行比例換算，得到最終的混合細(xì)胞量。

混合培養(yǎng)的第一天加入mscf（終濃度為50ng/ml），第三天全換液。

分為不同rankl濃度組和不同pth濃度組，以研究rankl濃度和pth濃度對(duì)破骨細(xì)胞融合數(shù)目和效率的影響。培養(yǎng)基中加入50ng/mlmcsf，而rankl濃度或pth濃度由低到高分別為5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，150ng/ml,200ng/ml。并從第三天起觀察融合融合后綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目改變。其中，熒光顯微鏡觀察中紅色熒光采用tdtomato適用的檢測(cè)參數(shù)，激發(fā)峰554nm，發(fā)射峰581nm；綠色熒光采用egfp適用的檢測(cè)參數(shù)，激發(fā)峰488nm，發(fā)射峰507nm。

結(jié)果如下圖3-圖6。

由上述結(jié)果可知：破骨細(xì)胞融合的數(shù)目隨著rankl濃度的增加而增加，呈現(xiàn)正相關(guān)的濃度依賴效應(yīng)；而破骨細(xì)胞融合的數(shù)目與pth的濃度不存在濃度依賴效應(yīng)。雖然大量的研究已經(jīng)說(shuō)明了rankl對(duì)于破骨細(xì)胞形成的重要作用，但是因?yàn)樵屑夹g(shù)的局限尚無(wú)報(bào)道關(guān)于rankl對(duì)于破骨細(xì)胞融合過(guò)程的影響。而利用本熒光標(biāo)記方法首次使得融合的觀察直觀可視化，從而利用簡(jiǎn)單地?zé)晒怙@微鏡觀察即可在本方法的基礎(chǔ)上可視化地研究rankl對(duì)于融合效率和融合過(guò)程的影響。

因此，在將來(lái)研究可能影響破骨細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)時(shí)，也可以利用本熒光標(biāo)記方法直觀可視地觀察到這些因素對(duì)融合過(guò)程、融合效率和融合中細(xì)胞行為產(chǎn)生了哪些影響，從而為研究破骨細(xì)胞融合提供了簡(jiǎn)便、可靠的工具。

實(shí)施例3

其它內(nèi)容如實(shí)施例1，將ctsk-cre轉(zhuǎn)基因小鼠與rosa^mtmg轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓單核細(xì)胞分離，以3:1的比例混合培養(yǎng)。

實(shí)施例4

其它內(nèi)容如實(shí)施例1，將ctsk-cre轉(zhuǎn)基因小鼠與rosa^mtmg轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓單核細(xì)胞分離，以1:1的比例混合培養(yǎng)。

同時(shí)借助細(xì)胞核熒光染料如hoechst或dapi，從而觀察融合過(guò)程中細(xì)胞核數(shù)目的改變。在熒光顯微鏡下觀察前，可用終濃度為100ng/ml的dapi染色1分鐘或用終濃度為1ug/ml的hoechst染色20分鐘，去除染料后用pbs清洗3次，然后加入100ul的pbs于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。從而可以觀察到融合過(guò)程中細(xì)胞核數(shù)目的改變，從而獲得更多信息使研究更推進(jìn)一步。