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一種免疫原性強(qiáng)的血清2型豬鏈球菌及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11246191閱讀:1540來源:國知局
一種免疫原性強(qiáng)的血清2型豬鏈球菌及其應(yīng)用的制造方法與工藝

本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種免疫原性強(qiáng)的血清2型豬鏈球菌及其應(yīng)用。



背景技術(shù):

豬鏈球菌(streptococcussuis,ss)是一種世界性的可引起豬重大疾病的重要病原菌之一,同時(shí)它也是一種人獸共患病病原體。人感染豬鏈球菌的途徑主要是接觸病死豬,致病菌經(jīng)破損皮膚和黏膜侵入,或食入未煮熟的病死豬肉而感染。近年來,人感染豬鏈球菌的報(bào)道大量增加,而這些病例主要來自亞洲國家。我國于2005年在四川省爆發(fā)的豬鏈球菌疫情共感染215人,病死率將近20%。

目前公認(rèn)的豬鏈球菌的血清型有33種(1-31,33,1/2),經(jīng)流行病學(xué)分析,臨床上豬鏈球菌主要以2、7、9型是引起豬感染的重要流行血清型,血清2型致病力最強(qiáng),極易引起人的感染和死亡。

由于臨床中常大量不合理使用抗生素來控制細(xì)菌性疾病,致使豬場的細(xì)菌在抗生素的壓力下進(jìn)化出耐藥菌群。因此,用藥物防控豬鏈球菌的難度越來越大,而且隨著人們對食品安全問題的重視,抗生素在動(dòng)物疫病防控中的應(yīng)用會(huì)越來越少,疫病的防控更多的會(huì)依賴疫苗。豬鏈球菌血清型眾多,且不同血清型之間的毒力和致病力差異較大,各血清型之間的交叉保護(hù)很低,所以,目前已有的商品化疫苗均不能對該病提供完全的免疫保護(hù)。因此,篩選免疫原性強(qiáng)并具有交叉保護(hù)力的豬鏈球菌通用菌株,是制備高效的豬鏈球菌疫苗的關(guān)鍵所在。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于一種免疫原性強(qiáng)的血清2型豬鏈球菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:

一種豬鏈球菌,該豬鏈球菌的保藏編號為gdmccno:60188,記名為豬鏈球菌gdzq株。

本發(fā)明提供的豬鏈球菌gdzq株,于2017年05月17日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓,廣東省微生物研究所),保藏號為:gdmccno:60188,保藏中心建議的分類命名為streptococcusporcinus。保藏中心于2017年05月18日鑒定菌株是存活的。

上述豬鏈球菌在制備防控豬鏈球菌病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的,所述的藥物為疫苗。

一種疫苗,是用上述所述的豬鏈球菌作為抗原制備的。

優(yōu)選的,所述的疫苗為滅活疫苗。

優(yōu)選的,所述疫苗中的佐劑為鋁膠。

優(yōu)選的,所述的疫苗為單價(jià)疫苗。

優(yōu)選的,所述的豬鏈球菌的含量為1×108~3×1012cfu/ml。

本發(fā)明的有益效果是:

本發(fā)明申請人從160多株菌株中篩選出一株血清2型豬鏈球菌,記名為豬鏈球菌gdzq株,其毒力較強(qiáng),5×108cfu即可引起全部試驗(yàn)仔豬死亡;免疫原性強(qiáng),疫苗抗原含量僅需1×108cfu即可對試驗(yàn)仔豬產(chǎn)生100%的免疫保護(hù),優(yōu)于目前市面上的同類產(chǎn)品。此外豬鏈球菌gdzq具有較好的交叉保護(hù)力,能保護(hù)豬免受目前國內(nèi)主要的流行血清2、7、9型豬鏈球菌的侵害。

利用本發(fā)明篩選出的豬鏈球菌gdzq制備豬鏈球菌疫苗,工藝簡單,僅需單獨(dú)培養(yǎng)豬鏈球菌gdzq,經(jīng)常規(guī)處理即可制備得到豬鏈球菌疫苗。本發(fā)明技術(shù)工藝簡單,成本低廉,可以克服目前市場上多價(jià)豬鏈球菌疫苗生產(chǎn)中工藝繁瑣的缺陷。

本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供了預(yù)防豬豬鏈球菌病的單價(jià)疫苗,可以彌補(bǔ)市場的空白。所述單價(jià)疫苗具有較好的交叉保護(hù)力,利用其對豬進(jìn)行免疫接種,可以抵御國內(nèi)主要的豬鏈球菌流行血清型2、7、9型菌株的侵害,市場前景廣闊。

附圖說明

圖1為血平板培養(yǎng)結(jié)果;

圖2為革蘭氏染色結(jié)果;

圖3為豬鏈球菌pcr鑒定結(jié)果;

圖4為豬鏈球菌血清型分型結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1豬鏈球菌gdzq株的分離、鑒定和毒力試驗(yàn)

一、豬鏈球菌菌株的分離和篩選

1、豬鏈球菌菌株的分離

2015年于廣東肇慶某豬鏈球菌發(fā)病豬場采集病料,無菌取發(fā)病豬的腦組織,接種到tha瓊脂培養(yǎng)基上,置37℃培養(yǎng)24~36h后挑選典型的單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。挑選純化好的單菌落接種于thb液體培養(yǎng)液中,37℃搖床(220r/min)培養(yǎng)過夜。純培養(yǎng)物接種含綿羊血的瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24h后,可見形成直徑1~2mm透明,圓潤的菌落,在血平板中呈β溶血(圖1)。挑取上述單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡下觀察,可見藍(lán)紫色,卵圓形或圓形,成雙或成鏈狀的菌落分布于視野中(圖2),初步判斷為鏈球菌。

2、豬鏈球菌菌株的篩選

對初步證實(shí)是豬鏈球菌菌株的160多株菌株進(jìn)行篩選。經(jīng)毒力、生長特性等的比對驗(yàn)證,最終篩選出易于培養(yǎng)、毒力較強(qiáng)的豬鏈球菌1株,進(jìn)行如下研究。

二、豬鏈球菌菌株的16srrna鑒定

對毒力最強(qiáng)的豬鏈球菌菌株進(jìn)行16srrnapcr鑒定,引物序列如下:

p1:5’-cagtatttaccgcatggtagatat-3’(seqidno:1);

p2:5’-gtaagataccgtcaagtgagaa-3’(seqidno:2)。

經(jīng)pcr檢測可疑菌落擴(kuò)增出大小約為294bp的特異性條帶(圖3),pcr產(chǎn)物送上海生工生物公司進(jìn)行序列測定,測序結(jié)果與ncbigenbank中已有序列比對,比對結(jié)果顯示,分離到的菌株為豬鏈球菌。將菌株命名為gdzq株。

三、豬鏈球菌gdzq株的血清型鑒定

1凝集試驗(yàn)

將上述鑒定為豬鏈球菌的菌株gdzq進(jìn)行血清凝集試驗(yàn),取10l標(biāo)準(zhǔn)陽性血清于玻片上,取10l純化的豬鏈球菌菌液充分混勻,輕輕搖動(dòng)3分鐘,日光燈下觀察結(jié)果,若有顆粒狀物質(zhì)出現(xiàn),則為陽性;若為均勻混懸液,則為陰性。經(jīng)鑒定豬鏈球菌gdzq株為血清型2型。

2pcr定型

用pcr方法對菌株gdzq株進(jìn)行血清型定型。定型引物為:

cps2i-f:ttcgtattaacttacttggcgt(seqidno:3);

cps2i-r:taaatccccatatgccaaatcc(seqidno:4)。

pcr的結(jié)果顯示gdzq株為血清型2型,見圖4。

四、.豬鏈球菌gdzq株的致病力研究

取20頭15日齡仔豬隨機(jī)分成a、b、c、d四組,每組5頭,進(jìn)行豬鏈球菌攻毒,劑量及分組如表1。

表1豬鏈球菌gdzq株攻毒結(jié)果

每頭豬分別頸部肌肉注射,每天觀察仔豬發(fā)病情況,連續(xù)觀察10天。試驗(yàn)結(jié)果顯示,a、b、c所有試驗(yàn)仔豬于攻毒后48h均開始表現(xiàn)出臥地不起,食欲廢絕,呼吸困難,呼吸羅音,并出現(xiàn)抽搐,四肢劃水狀等一系列神經(jīng)癥狀,d組有3頭仔豬于攻毒后4天出現(xiàn)上述癥狀,對照組仔豬正常。試驗(yàn)證實(shí),豬鏈球菌gdzq株對仔豬有較強(qiáng)的致病力。

實(shí)施例2豬鏈球菌疫苗的制備以及免疫效力檢測

一、豬鏈球菌疫苗的制備

通過以下步驟制備疫苗:

1)一級種子液制備:取凍干保存的豬鏈球菌gdzq株接種于tsa固體平板,在溫度為37℃的條件下培養(yǎng)18h;然后挑取單菌落于tsb培養(yǎng)基(含5%新生牛血清)中,在溫度為37℃的條件下,以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)18h,進(jìn)行純粹檢驗(yàn)合格后,作為一級種子液,置2~8℃保存?zhèn)溆?,保存時(shí)間均不超過3天。

2)二級種子液制備:取步驟1)得到的一級種子液,按種子液與培養(yǎng)基的體積比1:20接種于tsb培養(yǎng)基中,在溫度為37℃的條件下,以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)16h,進(jìn)行純粹檢驗(yàn)合格后,作為二級種子液,置2~8℃保存?zhèn)溆?,保存時(shí)間均不超過3天。

3)原菌液制備:取步驟2)得到的二級種子培養(yǎng)液,按種子液與培養(yǎng)基的體積比1:100接種于tsb培養(yǎng)基中,在溫度為37℃的條件下,以轉(zhuǎn)速120rpm振蕩培養(yǎng)24h后,得到原菌液。

4)活菌計(jì)數(shù):將步驟3)中獲得的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),步驟如下:

取豬鏈球菌gdzq株菌液1ml,用ph7.4pbs做10倍系列稀釋,每個(gè)稀釋度換1支吸管。具體方法是:準(zhǔn)確吸取菌液100μl,放入盛有稀釋液900μl的第一支1.5ml離心管中(不接觸液面),另取1支1ml槍頭將第一管液體混合均勻后,吸取100μl放入盛有稀釋液900μl的第2支1.5ml離心管中,依次稀釋至最后1管。根據(jù)對樣品含菌數(shù)的估計(jì),選擇適宜稀釋度,吸取最終稀釋度的菌液接種適宜的培養(yǎng)基平板3個(gè),每個(gè)滴100μl,使菌液散開,置37℃涼干后,翻轉(zhuǎn)平板,培養(yǎng)48~72h,按照下列方法數(shù)出每個(gè)平皿中的菌落個(gè)數(shù),計(jì)算每ml菌液中的活菌數(shù)(cfu/ml)。

5)滅活:在上述步驟3)制備的菌液中加入終濃度為0.2~0.4%的甲醛溶液,37℃振蕩滅活24h。

6)乳化:在步驟5)得到的滅活菌液中取樣,按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn);將原菌液在轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下無菌離心10min取沉淀的菌體,用無菌生理鹽水重懸菌體后洗滌,經(jīng)洗滌的菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為2×108cfu/ml的制苗菌液,將制苗菌液與鋁膠佐劑以體積比4:1~9:1混合,轉(zhuǎn)速8000rpm的條件下乳化20min,得到治療豬鏈球菌病的疫苗,2~8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、豬鏈球菌疫苗的免疫效力檢測

1.最小免疫效力試驗(yàn)

取25頭15日齡仔豬,隨機(jī)分成a、b、c、d、e共5組,每組5頭,其中a組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗,0.5ml/頭,14天后二免,0.5ml/頭;b組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗,1ml/頭,14天后二免,1ml/頭;c組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗,2ml/頭,14天后二免,2ml/頭;d組頸部肌肉注射市售豬鏈球菌商品疫苗,2ml/頭,14天后二免,2ml/頭;e組仔豬分別注射生理鹽水,2ml/頭。所有實(shí)驗(yàn)組在二免14天后分別用豬鏈球菌血清2型菌株進(jìn)行攻毒,3×109cfu/頭,連續(xù)觀察10天,觀察記錄仔豬發(fā)病和死亡情況,計(jì)算每組保護(hù)率,如表2所示。

表2豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗對仔豬的免疫保護(hù)結(jié)果

表2結(jié)果顯示,豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗對仔豬能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效力,免疫0.5ml,1ml、2ml組的保護(hù)率均為100%,即疫苗的抗原含量為1×108cfu可對仔豬形成較好的免疫保護(hù),商品疫苗免疫組有40%仔豬發(fā)病,攻毒對照組仔豬100%發(fā)病。

2.交叉保護(hù)試驗(yàn)

取30頭15日齡仔豬,隨機(jī)分成a、b、c、d、e、f6組,每組5頭,其中a、b、c組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗,2ml/頭,14天后二免,2ml/頭;d、e、f組仔豬頸部肌肉注射生理鹽水,2ml/頭,14天后二免,2ml/頭。a、d組在二免14天后分別用2型標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行攻毒,3×109cfu/頭;b、e組在二免14天后分別用7型菌株進(jìn)行攻毒,3×109cfu/頭;c、f組在二免14天后分別用9型菌株進(jìn)行攻毒,3×109cfu/頭,連續(xù)觀察10天,觀察記錄仔豬發(fā)病和死亡情況,計(jì)算每組保護(hù)率,如表3所示。

表3豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗對仔豬的交叉保護(hù)結(jié)果

表3結(jié)果顯示,豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗可對2、7、9型菌株的攻毒分別產(chǎn)生100%的交叉免疫保護(hù)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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