人糞便中腸道菌群固定液及其制備方法與流程

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人糞便中腸道菌群固定液及其制備方法。

背景技術(shù)：

基于糞便樣本的人腸道菌群研究，是指通過采集人體糞便樣本，對糞便中的菌群進(jìn)行研究，其應(yīng)用主要包括：(1)研究腸道菌群與人體疾病的關(guān)系，因為部分疾病受到腸道菌群代謝物影響，比如肥胖、高血壓、糖尿病等；部分疾病發(fā)生之前腸道菌群會有變化，從而可在一定程度上進(jìn)行預(yù)測；(2)研究用藥物后腸道菌群的變化，如使用不同抗生素后腸道菌群的變化情況，以及是否某些抗生素作用比較低；或者使用激素類藥物腸道菌群的變化等；可以研究到達(dá)腸道的藥物作用情況；(3)研究腸道菌群與兒童營養(yǎng)吸收的關(guān)系，因為腸道菌群會幫助食物消化，產(chǎn)生人體需要的物質(zhì)比如氨基酸，維生素，短鏈脂肪酸等，用來提高食物消化并對人的營養(yǎng)作用。

通過糞便來研究腸道菌群常見的方法有：基于細(xì)菌16s擴(kuò)增子方法和基于細(xì)菌全基因metagenome研究方法，其過程主要包括：(1)采集糞便樣本；(2)提取糞便中的微生物dna；(3)對dna進(jìn)行高通量測序；(4)分析高通量測序獲得的數(shù)據(jù)獲得腸道菌群情況。其中第(1)步采集糞便樣本，為了保證其中微生物(腸道菌群)各種微生物組成的不變，通常會進(jìn)行冰凍保存，即將采集好的糞便在盡可能短的時間內(nèi)放到盡可能-80℃低溫冰箱進(jìn)行保存。因為脫離了腸道內(nèi)環(huán)境，在常溫中停留時間越久，則腸道菌群越會發(fā)生改變，比如某些菌數(shù)量會變多，某些菌數(shù)量會變少，甚至全部死亡。由于實驗條件和實驗周期等限制，一般情況不可能立即進(jìn)行第(2)步的dna提取。所以當(dāng)提取時，糞便中的微生物組成已經(jīng)與正常腸道環(huán)境中不同，研究也就沒有辦法獲得真實結(jié)果。因此，需要開發(fā)新型的固定人糞便中腸道菌群的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種人糞便中腸道菌群固定液及其制備方法，以在保證保存品質(zhì)的基礎(chǔ)上，延長收集的人體糞便在常溫下的保存時間，避免將收集的人體糞便進(jìn)行低溫凍存所帶來的不便；制備方法簡單，應(yīng)用范圍廣。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

第一方面，本發(fā)明提供了一種人糞便中腸道菌群固定液，每1000ml固定液中，原料組分包括：400～600mmoltris-hcl、3～7molnacl、50～150mmoledta和/或edta-na2，余量為水。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式中，原料組分還包括：1～3mol乙醇。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式中，每1000ml固定液中，原料組分包括：500mmoltris-hcl、100mmoledta和/或edta-na2、5molnacl、2mol乙醇，余量為水。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式中，tris-hcl的ph值為8.0。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式中，水為去離子水。

第二方面，本發(fā)明提供了上述人糞便中腸道菌群固定液的制備方法，包括如下步驟：將所有的原料組分混合均勻，得到固定液。

第三方面，本發(fā)明提供了上述人糞便中腸道菌群固定液的使用方法，包括如下步驟：將采集的糞便加入到固定液中，避光保存。需要說明的是，將采集的糞便加入到固定液中，固定液的加入量，只需要浸沒糞便即可。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式中，保存的時間為0～30天。

在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方式中，保存的溫度不高于40℃。

第三方面，本發(fā)明還保護(hù)上述人糞便中腸道菌群固定液在制備人糞便中腸道菌群固定產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有如下的有益效果：

(1)本發(fā)明首次采用tris-hcl、nacl、edta和/或edta-na2為主要成分配制固定液，雖然tris-hcl、nacl、edta、edta-na2均為常見的緩沖液組分，其組合經(jīng)常用于dna的提取緩沖液，但是國內(nèi)外并沒有報道過其組合具有固定腸道菌群的功能；

(2)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液，其中的tris-hcl為緩沖液成分，dna在該溶液中會去質(zhì)子化，提高其溶解性，與edta一同形成的te緩沖液，能有效的保護(hù)菌群中的dna降解；edta為金屬螯合劑，能螯合細(xì)菌所需的微量金屬元素，如鎂等，使得這類酶不能發(fā)揮作用，從而阻斷細(xì)菌的正常代謝活動，抑制細(xì)菌生長，具有一定的抑菌作用；nacl的主要作用是抑制細(xì)菌生長；乙醇的主要作用是抑制細(xì)菌生長；

(3)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以在保證保存品質(zhì)(糞便中腸道菌群組成穩(wěn)定)的基礎(chǔ)上，延長收集的人體糞便在常溫下的保存時間，避免將收集的人體糞便進(jìn)行低溫凍存所帶來的不便；

(4)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以直接將糞便加入裝有固定液的保存管中，然后常溫避光保存即可，不需要進(jìn)行低溫凍存，使用簡單；

(5)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液制備方法簡單，生產(chǎn)成本低，可控制在2～3元/ml，具有極廣的應(yīng)用價值。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例二中的糞便經(jīng)不同處理后的腸道菌群的組成柱狀圖；

圖2為本發(fā)明實施例二中的糞便經(jīng)不同處理后的測序分析結(jié)果主成分分析聚類圖；a—個體1；b—個體2；c—個體3；

圖3為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物bifidobacterium相對豐度變化圖；

圖4為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物clostridium相對豐度變化圖；

圖5為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物bifidobacterium相對豐度變化圖；

圖6為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物collinsella相對豐度變化圖；

圖7為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物eubacterium相對豐度變化圖；

圖8為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物faecalibacterium相對豐度變化圖；

圖9為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物fusobacterium相對豐度變化圖；

圖10為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物parabacteroides相對豐度變化圖；

圖11為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物ruminococcus相對豐度變化圖；

圖12為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的微生物bacteroides相對豐度變化圖；

圖13為本發(fā)明實施例三中的糞便經(jīng)不同處理后的主要功能基因相對豐度隨時間變化的圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只是作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

實施例一：人糞便中腸道菌群固定液及制備

本實施例提供一種人糞便中腸道菌群固定液，每1000ml所述固定液中，原料組分包括：500mmoltris-hcl(ph值為8.0)、100mmoledta、5molnacl、2mol乙醇，余量為去離子水。

制備方法包括：先配制1000mmol/l的tris-hcl溶液(ph值為8.0)，量取500ml的tris-hcl溶液，加入100mmoledta、5molnacl和2mol乙醇，然后加入去離子水至1l，混合均勻，得到固定液。

實施例二：細(xì)菌16s擴(kuò)增子研究腸道菌群組成

1、將同一個體一次排泄的糞便均分成30份采集，然后將采集的糞便分別放入含有等量的本發(fā)明實施例一制備得到的人糞便中腸道菌群固定液的30個采集管中，固定液能浸沒糞便(下同)。

將30個樣本在常溫下放置0～9天(第0天表示采集當(dāng)天)，每天凍存3管作為重復(fù)，再放入冰箱冷凍，9天后對所有凍存的糞便進(jìn)行dna提取、測序和分析(具體操作為本領(lǐng)域常用的操作方法)。

分析后腸道菌群的組成柱狀圖如圖1所示。途中不同顏色表示腸道菌群中不同種類的微生物。橫坐標(biāo)為天數(shù)，小數(shù)點后為每天重復(fù)的樣(每天重復(fù)三次)?？v坐標(biāo)為微生物的相對豐度。由圖1可知，從第0天到第9天腸道菌群微生物組成的變化小，這種變化主要來源于采集點所致。結(jié)果說明本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液效果很好。

2、使用本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液進(jìn)行糞便固定，同時使用國外產(chǎn)品進(jìn)行固定，最長常溫放置36天后進(jìn)行細(xì)菌16s擴(kuò)增子研究腸道菌群組成。由于需要糞便較多，因此選取不同個體進(jìn)行糞便采集，具體方案及結(jié)果如下：

個體1(a)：使用含有等量的本發(fā)明實施例一制備得到的人糞便中腸道菌群固定液的采集管36個，分別采集同一個體一次排泄的36份糞便，常溫下放置，從第0天(采集當(dāng)天)開始每個3天凍存3管，全部凍存完畢后進(jìn)行測序分析；

個體2(b)：使用含有等量的國外產(chǎn)品的采集管15個，分別采集同一個體一次排泄的15份糞便，常溫下放置，每隔一周凍存3管，一共凍存5周，全部凍存完畢后進(jìn)行測序分析；

個體3(c)：使用含有等量的國外產(chǎn)品的采集管15個，分別采集同一個體一次排泄的15份糞便，常溫下放置，每隔一周凍存3管，一共凍存5周，全部凍存完畢后進(jìn)行測序分析。

結(jié)果如下：使用主成分方法(通過對測序結(jié)果進(jìn)行分析)對樣本的物種組成進(jìn)行分析，腸道菌群組成越相似的樣本，聚得越緊密，腸道菌群組成越不相似的樣品，樣品間越疏遠(yuǎn)。由圖2可以看出，個體1(a)的30個樣本較個體2(b)和個體3(c)的15個樣本聚得更集中，說明個體1(a)的30個樣本非常相似。結(jié)果也說明，本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液較國外產(chǎn)品在固定腸道菌群狀態(tài)方面效果更優(yōu)。

實施例三：細(xì)菌全基因metagenome研究

使用本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液進(jìn)行糞便固定，最長常溫放置36天后進(jìn)行細(xì)菌全基因組metagenome研究(具體操作為本領(lǐng)域常用的操作方法)，觀察腸道菌群中微生物以及功能基因的變化情況，具體方案及結(jié)果如下：

將同一個體一次排泄的糞便均分成39份采集，然后將采集的糞便分別放入含有等量的本發(fā)明實施例一制備得到的人糞便中腸道菌群固定液的39個采集管中，固定液能浸沒糞便(下同)，常溫下放置。每隔3天取3管進(jìn)行凍存，一共36天(采集當(dāng)天也需要凍存3管)，全部凍存完畢后進(jìn)行細(xì)菌全基因metagenome研究。

結(jié)果如下：1、圖3-圖12顯示的是含量最高的10種微生物(包括：bifidobacterium、clostridium、bifidobacterium、collinsella、eubacterium、faecalibacterium、fusobacterium、parabacteroides、ruminococcus、bacteroides)，其相對豐度分別在36天中的變化情況。橫坐標(biāo)是不同樣品，按照天數(shù)進(jìn)行排列(即a01、a02、a03代表第3天凍存樣品，b01、b02、b03代表第6天凍存樣品，依此類推)，縱坐標(biāo)是該菌的相對豐度。線的平滑度表示對應(yīng)微生物豐度的變化。可以看出線相對較為平滑，說明腸道菌群中該微生物變化不大。需說明，由于不能百分百的混勻，因此會出現(xiàn)采集點上的偏差，由此也會出現(xiàn)波動，但均在統(tǒng)計學(xué)范圍內(nèi)。結(jié)果說明本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液效果很好。

2、圖13是功能基因豐度隨時間變化的圖：橫坐標(biāo)是不同樣品，按照天數(shù)進(jìn)行排列，縱坐標(biāo)是該類基因的相對豐度，線越平滑則變化越小。由圖13可以看出，氨基酸代謝(aminoacidmetabolism)相關(guān)基因在常溫放置36天情況下變化很小。結(jié)果說明本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液效果很好。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有如下的有益效果：(1)本發(fā)明首次采用tris-hcl、nacl、edta和/或edta-na2為主要成分配制固定液，雖然tris-hcl、nacl、edta、edta-na2均為常見的緩沖液組分，其組合經(jīng)常用于dna的提取緩沖液，但是國內(nèi)外并沒有報道過其組合具有固定腸道菌群的功能；(2)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液，其中的tris-hcl為緩沖液成分，dna在該溶液中會去質(zhì)子化，提高其溶解性，與edta一同形成的te緩沖液，能有效的保護(hù)菌群中的dna降解；edta為金屬螯合劑，能螯合細(xì)菌所需的微量金屬元素，如鎂等，使得這類酶不能發(fā)揮作用，從而阻斷細(xì)菌的正常代謝活動，抑制細(xì)菌生長，具有一定的抑菌作用；nacl的主要作用是抑制細(xì)菌生長；乙醇的主要作用是抑制細(xì)菌生長；(3)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以在保證保存品質(zhì)(糞便中腸道菌群組成穩(wěn)定)的基礎(chǔ)上，延長收集的人體糞便在常溫下的保存時間，避免將收集的人體糞便進(jìn)行低溫凍存所帶來的不便；(4)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液，可以直接將糞便加入裝有固定液的保存管中，然后常溫避光保存即可，不需要進(jìn)行低溫凍存，使用簡單；(5)本發(fā)明提供的人糞便中腸道菌群固定液制備方法簡單，生產(chǎn)成本低，可控制在2～3元/ml，具有極廣的應(yīng)用價值。

需要注意的是，除非另有說明，本申請使用的技術(shù)術(shù)語或者科學(xué)術(shù)語應(yīng)當(dāng)為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的通常意義。除非另外具體說明，否則在這些實施例中闡述的部件和步驟的相對步驟、數(shù)字表達(dá)式和數(shù)值并不限制本發(fā)明的范圍。在這里示出和描述的所有示例中，除非另有規(guī)定，任何具體值應(yīng)被解釋為僅僅是示例性的，而不是作為限制，因此，示例性實施例的其他示例可以具有不同的值。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。