一種GBS核酸檢測試劑盒的制作方法

本發(fā)明涉及一種基因檢測方法及基因檢測試劑盒和基因檢測設備，屬于醫(yī)學檢測
技術領域：
。
背景技術：
：b族鏈球菌(groupbstreptococcus，簡稱gbs)，正常寄居于陰道和直腸，它是一種條件致病菌，一般正常健康人群感染gbs并不致病。據統(tǒng)計約10％～30％的孕婦有感染gbs，其中40％～70％在分娩過程中會傳遞給新生兒。如果新生兒帶了這種菌，大約有1％～3％會出現(xiàn)早期侵入性感染，其中有5％會導致死亡。因此，gbs的檢測尤為重要?；驒z測是通過血液、其他體液或細胞對dna進行檢測的技術，是取被檢測者脫落的口腔黏膜細胞或其他組織細胞，擴增其基因信息后，通過特定設備對被檢測者細胞中的dna分子信息作檢測，預知身體患疾病的風險，分析它所含有的各種基因情況，從而使人們能了解自己的基因信息，從而通過改善自己的生活環(huán)境和生活習慣，避免或延緩疾病的發(fā)生?；驒z測可以診斷疾病，也可以用于疾病風險的預測。疾病診斷是用基因檢測技術檢測引起遺傳性疾病的突變基因。目前應用最廣泛的基因檢測是新生兒遺傳性疾病的檢測、遺傳疾病的診斷和某些常見病的輔助診斷。目前有1000多種遺傳性疾病可以通過基因檢測技術做出診斷。由于基因檢測時通常使用的樣本為生物組織細胞，因此檢測基因時需要對細胞進行裂解、清洗、擴增等步驟后，再利用光學檢測的方式去檢測基因。由于各個步驟中涉及不同的處理，通常樣品需要經過多個設備分別進行不同步驟的處理，檢測較為麻煩，而且在進行不同步驟時，有時還需要轉移樣品至不同的載體，這一過程容易引入污染，影響檢測精度。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于，提供一種gbs核酸檢測試劑盒。它可以用于完成整個gbs核酸檢測的工序，不僅可以脫離gbs核酸檢測對于大量設備的依賴，提升檢測效率，而且可以避免在檢測過程中引入污染，提升檢測精度。本發(fā)明的技術方案：一種gbs核酸檢測試劑盒，其特點是：包括頂部帶翻蓋的盒體，盒體內從上至下分別設有通過柱塞隔開的裂解區(qū)、第一清洗區(qū)、第二清洗區(qū)和反應區(qū)；所述柱塞水平設置，柱塞上設有豎直方向的柱塞孔；所述裂解區(qū)設有裂解液，裂解液內設有封存亞微米級超順磁磁珠和質控品的金屬攪拌子(磁性中空金屬球)；所述反應區(qū)設有含gbs特定基因片段和質控品特定基因片段的核酸擴增反應液。亞微米級超順磁磁珠直徑0.5-10μm，濃度為50-200mg/ml，有表面硅基包被。上述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述第二清洗區(qū)和反應區(qū)之間的柱塞的柱塞孔內設有用石蠟封閉的微型金屬容器(不銹鋼管)，微型金屬容器內設有包含核酸擴增酶及防污染酶的酶液。前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述質控品為菌體內包有特定質粒的大腸桿菌，所述特定質粒的序列內含通過克隆技術轉入的質控品特定基因片斷。前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述樣本裂解液成份為：前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述第一清洗區(qū)內設有第一核酸洗液，第一核酸洗液的成份為：鹽酸胍2.0-4.0mnacl2.0-4.0mddh2o溶劑前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述第二清洗區(qū)內設有第二核酸洗液，第二核酸洗液的成份為：乙醇50-70％質量百分比ddh2o溶劑前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述微型金屬容器內的酶液組分為：甘油50％質量百分比tris-hcl20mm(ph8.0)edta0.1mmtritomx-1000.1％質量百分比核酸擴增酶重組耐熱t(yī)aq酶，1.0-5.0u防污染酶重組耐熱ung酶，0.2-5.0uddh2o溶劑前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述核酸擴增反應液體中的gbs特定基因片段為sag0265、sag0771、sag2043，質控品特定基因片段為rnasep，核酸擴增反應液體的組分為：前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所述反應區(qū)底部設有向盒體外部方向凹進的隱藏區(qū)。前述的gbs核酸檢測試劑盒中，所所述柱塞孔帶3～5°的錐度，中心直徑為3～5mm，這樣的設置既有利于磁珠通過，又可利用毛細作用阻斷各個區(qū)間的液體自由穿過；b族鏈球菌(s.agalactiae)人(homosapiens)所述裂解區(qū)底端為上寬下窄的收口，每個收口邊與豎直方向夾25°～35°角，以便于充分裂解及磁珠順利匯合到柱塞孔內。各基因序列具體參見下表。上述基因及引物探針序列的方向均為5’-3’。探針為兩端標記，5’端標記為報告熒光，3’端標記為淬滅。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明利用柱塞在同一個試劑盒內分隔出多個區(qū)間(腔體)，各個區(qū)間可分別放置裂解液、兩道清洗液和核酸擴增反應液，使得基因檢測的多個步驟可在同一個試劑盒內(配合使用一臺設備)進行，不容易產生二次污染，而且工作效率大大提高，檢測精度也大大提高，而且更可以解決基因檢測需要很多配套設備的問題。本發(fā)明的試劑盒采用了熒光核酸擴增檢測方法，針對b族鏈球菌特異基因序列設計引物探針，并以生物工程方法引入含人rnasep基因序列質粒的大腸桿菌作為過程質控，用于防止假陰性，確保檢測有效性。在核酸擴增過程中可以配合儀器同步進行熒光檢測。以上過程都只需要在儀器和特定試劑盒內完成，類似poct，全自動一體化，不依賴檢測操作人員的技能水平及其他配套設備。本發(fā)明由于使用了柱塞進行分隔，它可以通過簡單的機械動作即可導通各個區(qū)間，無需其它處理(若采用石蠟等物質進行隔離，導通及裝配時需加熱，加熱會影響到試劑盒內的試劑及樣品，進行影響檢測精度)，操作上來說更為方便，而且柱塞的裝配更為簡單、便于各個區(qū)間內試劑的裝配。附圖說明圖1是本發(fā)明試劑盒的結構示意圖；圖2是圖1的側向示意圖；圖3是圖2的a部放大圖。附圖中的標記為：1-翻蓋，2-盒體，3-柱塞，301-柱塞孔，4-裂解區(qū)，5.1-第一清洗區(qū)，5.2-第二清洗區(qū)，6-反應區(qū)，7-彈簧，8-頂桿，601-隱藏區(qū)。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不作為對本發(fā)明限制的依據。實施例。一種gbs核酸檢測試劑盒，如圖1至圖3所示：包括頂部帶翻蓋1的盒體2，盒體2內從上至下分別設有通過柱塞3隔開的裂解區(qū)4、第一清洗區(qū)5.1、第二清洗區(qū)5.2和反應區(qū)6；所述柱塞3水平設置，柱塞3上設有豎直方向的柱塞孔301；所述裂解區(qū)4設有裂解液，裂解液內設有封存亞微米級超順磁磁珠和質控品的金屬攪拌子；所述反應區(qū)6設有含gbs特定基因片段和質控品特定基因片段的核酸擴增反應液。所述第二清洗區(qū)5.2和反應區(qū)6之間的柱塞3的柱塞孔301內設有用石蠟封閉的微型金屬容器，微型金屬容器內設有包含核酸擴增酶及防污染酶的酶液。所述質控品為菌體內包有特定質粒的大腸桿菌，所述特定質粒的序列內含通過克隆技術轉入的質控品特定基因片斷。即質控品為以生物工程方法引入含人rnasep基因序列質粒的大腸桿菌。所述樣本裂解液成份為：tris-hcl10-100mm(ph5.0-7.0)edta10-50mmnacl0.1-1.0mtritonx-1002.0-6.0％質量百分比十二烷基肌氨酸鈉5-10％質量百分比異硫氰酸胍1.0-3.0m鹽酸胍1.0-3.0mddh2o溶劑所述第一清洗區(qū)5.1內設有第一核酸洗液，第一核酸洗液的成份為：鹽酸胍2.0-4.0mnacl2.0-4.0mddh2o溶劑所述第二清洗區(qū)5.2內設有第二核酸洗液，第二核酸洗液的成份為：乙醇50-70％質量百分比ddh2o溶劑所述微型金屬容器內的酶液組分為：甘油50％質量百分比tris-hcl20mm(ph8.0)edta0.1mmtritomx-1000.1％質量百分比核酸擴增酶重組耐熱t(yī)aq酶，1.0-5.0u防污染酶重組耐熱ung酶，0.2-5.0uddh2o溶劑所述核酸擴增反應液體中的gbs特定基因片段為sag0265、sag0771、sag2043，質控品特定基因片段為rnasep，核酸擴增反應液體的組分為：tris-hcl10-50mm,ph8.0kcl20-200mmmgcl23.0-8.0mmdntps0.1-0.4mmdutp0.1-0.4mmsag2043p10.2-0.6umsag2043p20.2-0.6umsag2043p30.05-0.3umsag0265p10.2-0.6umsag0265p20.2-0.6umsag0265p30.05-0.3umsag0771p10.2-0.6umsag0771p20.2-0.6umsag0771p30.05-0.3umrnasepp10.2-0.6umrnasepp20.2-0.6umrnasepp30.05-0.3um所述反應區(qū)6底部設有向盒體2外部方向凹進的隱藏區(qū)601。所述柱塞孔301帶3～5°的錐度，中心直徑為3～5mm，所述裂解區(qū)4底端為上寬下窄的收口，每個收口邊與豎直方向夾25°～35°角。本發(fā)明中增加sag0771和sag0265引物探針對是擴增gbs基因組不同基因位置，可以提高gbs檢測出的陽性符合率。rnasep引物探針對是作為質控品，可以保障檢測核酸提取和擴增的有效性。本發(fā)明的試劑盒和檢測設備的具體使用方法：①將樣品放入盒體2，蓋上盒蓋1，然后將盒體2插入基因檢測設備的試劑盒容納槽9，在插入過程中，各個柱塞3的頂桿8依次被擋條13推動，使得各個柱塞3克服彈簧7的彈力發(fā)生移動，致使柱塞孔301對準分離腔體，導通裂解區(qū)4、清洗區(qū)5和反應區(qū)6，；②啟動電磁線圈陣列的混勻陣列，使混勻陣列的電磁線圈按環(huán)狀依次啟停，鐵磁性混勻球在磁力驅動下劇烈攪動裂解液和樣品，同時啟動靠近裂解區(qū)的制冷片，控制裂解溫度；③啟動電磁線圈陣列的拖動陣列，使拖動陣列的電磁線圈從上至下依次啟停，磁珠攜帶被裂解的樣品經過清洗液的清洗后，最終進入反應液，同時柱塞內攜帶酶組份的鋼管也帶入反應液，啟動靠近反應區(qū)的制冷片，控制反應溫度；④關閉電磁線圈陣列，磁珠因自重落入隱藏區(qū)601；⑤檢測光纖從盒體底部檢測光信號；⑥光學檢測模塊根據光信號分析出樣品基因。sequencelisting<110>杭州遂真生物技術有限公司<120>一種gbs核酸檢測試劑盒<130>20170508<160>16<170>patentinversion3.3<210>1<211>228<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>1ttgattgggaatcaaactccctctagttcagtagctgaaactacagaacaagggacagct60aatcctgctagtcaggatacttctagttacgttaatcagaatgtagcaccaacttatgag120caaccgcaagcgaataatacaccagttactccaggggttaacaatactgttccgactcca180ggaactggtactgtacctgctactaatgggacaggtgttgctcagtaa228<210>2<211>180<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>2accatagacatcacagtgagagaccagaatgctgaacctgtttcaggcaggacagttacc60ttaaaaacacaagctggtcgtgagattgctagcttggtttctggtgacaatggattaact120cgctttactgatcgtttactagatggaacattctaccaatattttgttgatgggaaaaaa180<210>3<211>240<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>3catatcaatatttgcttgactaaccttatttgctaaatgttgagttgaaaaagtgattgc60ttcaatcacatctgttaaggcttctacacgactaccaatagaattcaaatcataaactgt120ctcagggttggcacgcaatgaagtctttaatttttcaacactagtaatagcctcattaac180cgttttttcataatctgttccctgaacattatctttgatatttctcaactgaatgctatc240<210>4<211>181<212>dna<213>人（homosapiens）<400>4tcagcggctgcgcagactggcgcgcgcggacggtcatgggacttcagcatggcggtgttt60gcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggaacttgtggagac120agccgctcaccttggctattcagttgttgctatcaatcatatcgttgactttaaggaaaa180g181<210>5<211>21<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>5gaaggattatgtaacaactca21<210>6<211>21<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>6cccaaataattcctaagagag21<210>7<211>27<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>7atcaatcttaggtatactagcagcagc27<210>8<211>18<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>8gcaggacagttaccttaa18<210>9<211>21<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>9ccatctagtaaacgatcagta21<210>10<211>25<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>10agcgagttaatccattgtcaccaga25<210>11<211>19<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>11gcttcaatcacatctgtta19<210>12<211>19<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>12cggttaatgaggctattac19<210>13<211>21<212>dna<213>b族鏈球菌(s.agalactiae)<400>13agacttcattgcgtgccaacc21<210>14<211>19<212>dna<213>人（homosapiens）<400>14agatttggacctgcgagcg19<210>15<211>20<212>dna<213>人（homosapiens）<400>15gagcggctgtctccacaagt20<210>16<211>23<212>dna<213>人（homosapiens）<400>16ttctgacctgaaggctctgcgcg23當前第1頁12