本發(fā)明涉及農用肥料領域，尤其涉及一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑的方法。
背景技術：
早在公元12世紀中葉海藻肥已被西歐等地的人們廣泛利用。17世紀法國政府大力推薦在沿海地區(qū)用海藻作為土壤肥料。1880年有學者第一次報道了施用海藻提取物的對比試驗結果，清楚地說明了海藻作為肥料的優(yōu)越性。大量應用效果和研究表明，海藻提取物應用于作物生產具有很多優(yōu)點：可提高種子發(fā)芽率，促進幼苗生長，提高產量和品質，增加作物抗逆性以及促進作物收獲后土壤腐殖質的形成。這些突出的肥效依賴于海藻中天然含有的豐富的植物生長調節(jié)劑如細胞激動素、植物生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯、甜菜堿、多胺等，除此之外，海藻中還含有海洋生物所特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不飽和脂肪酸和陸生植物稀有的鋅、溴、碘等礦物元素，以及大量的非含氮有機物和一定數量的氨基酸、蛋白質及微量營養(yǎng)元素外。從上世紀90年代左右，國外海藻肥涌入國內市場并帶動了中國本土海藻在農業(yè)上的應用和發(fā)展，海藻肥在農業(yè)上的突出效果和作用一直被農業(yè)人士所認可。特別是2014年農業(yè)部提出《到2020年化肥施用量零增長行動計劃》，環(huán)保高效的海藻肥作為新型肥料的一種越來越被行業(yè)所青睞和接受。
海藻肥生產中，需要通過細胞破碎或增溶技術提取海藻細胞內含物，同時使大分子物質降解為可溶且易被吸收的小分子物質。常見方法有物理法如機械破碎、低溫爆破等，該方法環(huán)保，能最大程度保留海藻中的活性成分，但對設備要求高；化學方法如酸堿提取法是目前生產海藻酸的主要方法，但對海藻中的活性成分有一定破壞作用，高溫高壓強酸強堿工藝過程中控制不當極易出現有機物的碳化現象；生物技術如微生物發(fā)酵、酶解法等，可以在保留海藻活性成分的同時，將其大分子轉化為能被作物直接吸收的小分子，如微生物直接發(fā)酵，還能生產其他海藻原料中不合有的對作物有益的活性成分，但技術要求高，生產周期長，產品穩(wěn)定性難控制；酶解法是最高效和溫和的方法，通過專一性酶制劑降解大分子物質，破壞細胞釋放細胞內含物，溫和的條件可最大程度的保留海藻本身的活性物質。然而現有酶解技術工藝流程中，原材料海藻都需要經過復雜的前處理過程，獲得海藻的細微顆粒以利于酶解的進行。這些前處理包括海藻的浸泡、清洗、除雜、剪切、研磨等，海藻中大量的活性物質如甘露醇、碘、巖藻聚糖及其他在這些前處理工藝中流失，造成最終產品的活性降低。
因此，市場上需要一種生物酶解法處理整體海藻制備海藻植物生長調節(jié)劑的方法。
技術實現要素：
為解決現有技術中存在的上述缺陷，本發(fā)明旨在提供一種利用商品復合酶對海藻進行酶解，克服以往技術中酶解工藝前處理如海藻浸泡、清洗、除雜、剪切、研磨等的復雜性以及這些前處理帶來的活性物質流失的弊端，直接對鮮海藻或干海藻整體進行溫和高效的軟化并酶解，最大程度地保留了海藻中的活性物質，保證了海藻肥的效果和品質的生物酶解法處理整體海藻制備海藻植物生長調節(jié)劑的方法。
為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑的方法，包括以下步驟：
1)生產前準備
①準備原材料：準備完整的鮮海藻或干海藻、纖維素酶、褐藻多糖酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶；
②準備設備及工裝：準備設置有溫控裝置的酶解罐、膠體磨或均質機、超聲振蕩設備、臥式螺旋卸料沉降離心機；
③準備工藝輔材：單羥乙基胺、5％質量分數的氫氧化鉀、一氯三嗪-β-環(huán)糊精；
2)原料的預處理：
若為鮮海藻則將新鮮海藻整體浸泡于1-2倍重量的水中裝入酶解罐，其中水中含有鮮海藻重量0.3％-0.8％的無機鹽并混合均勻，在溫度40-60℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進行軟化1-3h，得到一種ph6.5-ph7.5的海藻漿液；
若為干海藻則將干海藻整體浸泡于5-10倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量3％-8％的無機鹽并混合均勻，在溫度40-60℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進行軟化1-3h，得到一種ph6.5-ph7.5的海藻漿液。
3)一級酶解
將溫度控制在35-50℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計1-4％的纖維素酶，0.1-0.3％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間6-12h，至酶解液ph5-6時結束一級酶解；
4)酶解液除雜
在一級酶解過程中，待稠厚的海藻漿液粘度顯著下降，可自由攪拌后，伴隨酶解攪拌狀態(tài)，將酶解體系在2個酶解罐間多次轉換，借助沙石沉降進行酶解體系雜質的去除；
5)酶解液均質
將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質機進行進一步細化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細化至100nm-10μm；
6)二級酶解
將步驟5)獲得的均質酶解液調節(jié)至ph6.5-ph7.5，溫度調節(jié)至50-60℃，加入海藻干重0.1％-0.3％的蛋白酶，1-3％的果膠酶，0.1％-0.2％的淀粉酶，間歇式攪拌進行二級酶解，酶解時間2-4h；
7)后處理
將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進行固液分離，可獲得固形物含量在3-10％的海藻酶法提取液；
8)促生長素的分離純化
①將單羥乙基胺投入7)獲得的海藻酶法提取液中，再將混合后的濃縮液置入超聲振蕩設備，以300w-350w的功率振蕩35min-40min，獲得終末漿料；
②將終末漿料靜置至水溶液和有機溶液自然分層，分離出有機溶液和水溶液；
③采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精浸入有機溶液中，以每10s間隔攪拌10s，攪拌速率100r/min-150r/min的攪拌工藝攪拌1.5h-2h，即可吸附出所需植物生長調節(jié)劑；
④采用5％質量分數的氫氧化鉀對吸附有植物生長調節(jié)劑的一氯三嗪-β-環(huán)糊精進行凈化處理，分離雜質，即獲得被吸附的高純促生長素；
⑤采用去離子水浸泡吸附的高純植物生長調節(jié)劑進行水解離，并在水解離容器外施加強度為330v/m-350v/m的直流電場，35min-40min后取出一氯三嗪-β-環(huán)糊精，留于去離子水中的即為分離出的高純促生長素；
9)肥料終配
①將8)中步驟⑤獲得的促生長素與8)中步驟②獲得的水溶液分開保存和使用，即獲得所需整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑。
與現有技術相比較，由于采用了上述技術方案，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：采取的最主要原材料是完整的海藻，因此有效成份保有量高，環(huán)境友好，可實現更大程度上的可持續(xù)發(fā)展和資源的最優(yōu)化利用；生產過程科學而高效，先添加的纖維素酶和褐藻多糖酶在植物細胞水充盈的環(huán)境下快速、徹底地發(fā)揮其作用，破壞了植物細胞的細胞壁，釋放了植物細胞內的各種物質，后添加的蛋白酶、淀粉酶和果膠酶分別分解或裂解水化了這些物質中各種大分子物質，使所有成份分子量降低、體積減小、活性增高；合理利用水和有機溶劑可分別溶解不同極性物質的特性及水和部分不溶于水的有機溶劑自然分離的特性，分離出水溶物和有機溶物，再利用植物中植物促生長素多溶于單羥乙基胺、其它有機物少溶于單羥乙基胺的特性，實現促生長素的精準提取，采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精把分子量適配的促生長素與少量雜質吸附出來，進一步凈化了提取物，由于促生長素分子量較為均一，與一氯三嗪-β-環(huán)糊精結合較好，而雜質多通過氫鍵與一氯三嗪-β-環(huán)糊精簡單連接，通過氫氧化鉀進行斷氫鍵處理后可以獲得最高純度的促生長素，由于獲得的促生長素純度更高，促進植物生長的效果更為明顯。
具體實施方式
實施例1
一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑的方法，包括以下步驟：
1)生產前準備
①準備原材料：準備完整的干海藻、纖維素酶、褐藻多糖酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶；
②準備設備及工裝：準備設置有溫控裝置的酶解罐、膠體磨或均質機、超聲振蕩設備、臥式螺旋卸料沉降離心機；
③準備工藝輔材：單羥乙基胺、5％質量分數的氫氧化鉀、一氯三嗪-β-環(huán)糊精；
2)原料的預處理：
將干海藻整體浸泡于10倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量5％的亞硫酸鉀并混合均勻，在溫度50℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進行軟化2.5h，得到一種ph約為7的海藻漿液。
3)一級酶解
將溫度控制在38℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計2％的纖維素酶，o.1％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間9h，此時酶解液ph5.5，結束一級酶解；
4)酶解液除雜
在一級酶解過程中，待稠厚的海藻漿液粘度顯著下降，可自由攪拌后，伴隨酶解攪拌狀態(tài)，將酶解體系在2個酶解罐間多次轉換，借助沙石沉降進行酶解體系雜質的去除；
5)酶解液均質
將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質機進行進一步細化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細化至1μm；
6)二級酶解
將步驟5)獲得的均質酶解液調節(jié)至ph7，溫度調節(jié)至60℃，加入海藻干重0.1％的蛋白酶，1的果膠酶，0.1％的淀粉酶，間歇式攪拌進行二級酶解，酶解時間2h；
7)后處理
將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進行固液分離，可獲得固形物含量在7％的海藻酶法提取液；
8)促生長素的分離純化
①將單羥乙基胺投入7)獲得的海藻酶法提取液中，再將混合后的濃縮液置入超聲振蕩設備，以350w的功率振蕩40min，獲得終末漿料；
②將終末漿料靜置至水溶液和有機溶液自然分層，分離出有機溶液和水溶液；
③采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精浸入有機溶液中，以每10s間隔攪拌10s，攪拌速率100r/min的攪拌工藝攪拌1.5h，即可吸附出所需植物生長調節(jié)劑；
④采用5％質量分數的氫氧化鉀對吸附有植物生長調節(jié)劑的一氯三嗪-β-環(huán)糊精進行凈化處理，分離雜質，即獲得被吸附的高純促生長素；
⑤采用去離子水浸泡吸附的高純植物生長調節(jié)劑進行水解離，并在水解離容器外施加強度為330v/m的直流電場，35min后取出一氯三嗪-β-環(huán)糊精，留于去離子水中的即為分離出的高純促生長素；
9)肥料終配
①將8)中步驟⑤獲得的促生長素與8)中步驟②獲得的水溶液分開保存和使用，即獲得所需整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑。
根據本實施例生產的整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑，田間肥效實驗情況為：海藻植物生長調節(jié)劑在草莓上的實驗效果：
實驗地點：山東省青島市城陽區(qū)夏莊
實驗時間：2016年2月-2016年4月
實驗品種：大棚甜寶草莓
實驗設計：采用小區(qū)對比法，選擇生態(tài)環(huán)境條件良好、肥水和病蟲防治等田間管理一致的地塊。
實驗設2個處理：(1)實施例1工藝生產獲得的海藻植物生長調節(jié)劑，兩種組份分別用水稀釋1000倍，同時正反葉面噴施；(2)清水對照，對照區(qū)施用等量的清水。每個處理組3個重復，各小區(qū)隨機排列。
施肥方式：從第二茬果膨果期開始每隔7天正反葉面噴施一次，共施用4次。
實驗效果
海藻植物生長調節(jié)劑對草莓果實重量及甜度的影響
表1收獲期不同處理組的草莓果實重量和果實甜度
各實驗組依據實驗方案處理完畢后，在各實驗重復組分別隨機選取10個草莓進行稱重及糖度的測定，取平均值為各小區(qū)指標。各重復小區(qū)指標再取均值為各處理組指標。從數據中可以看到，施用酶解海藻植物生長調節(jié)劑后，草莓的果實大小明顯比清水對照組大，平均增重22.18％；草莓的甜度相比清水對照組，增加更大，平均甜度增大35.7％。
實施例2
一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑的方法，整體與實施例1一致，差異之處在于：
2)原料的預處理：
將新鮮海藻整體浸泡于2倍重量的水中裝入酶解罐，其中水中含有鮮海藻重量0.3％的無機鹽并混合均勻，在溫度40與間歇性攪拌的條件下對海藻進行軟化1h，得到一種ph6.5的海藻漿液；
3)一級酶解
將溫度控制在35℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計4％的纖維素酶，0.3％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間6h，至酶解液ph5時結束一級酶解；
5)酶解液均質
將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質機進行進一步細化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細化至100nm；
6)二級酶解
將步驟5)獲得的均質酶解液調節(jié)至ph6.5，溫度調節(jié)至50℃，加入海藻干重0.3％的蛋白酶，3％的果膠酶，0.2％的淀粉酶，間歇式攪拌進行二級酶解，酶解時間4h；
7)后處理
將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進行固液分離，可獲得固形物含量在10％的海藻酶法提取液；
8)促生長素的分離純化
①將單羥乙基胺投入7)獲得的海藻酶法提取液中，再將混合后的濃縮液置入超聲振蕩設備，以300w的功率振蕩35min，獲得終末漿料；
③采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精浸入有機溶液中，以每10s間隔攪拌10s，攪拌速率150r/min的攪拌工藝攪拌2h，即可吸附出所需植物生長調節(jié)劑；
⑤采用去離子水浸泡吸附的高純植物生長調節(jié)劑進行水解離，并在水解離容器外施加強度為350v/m的直流電場，40min后取出一氯三嗪-β-環(huán)糊精，留于去離子水中的即為分離出的高純促生長素；
根據本實施例生產的整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑，田間肥效實驗情況為：海藻植物生長調節(jié)劑在草莓上的實驗效果：草莓的果實大小明顯比清水對照組大，平均增重23.97％；草莓的甜度相比清水對照組，增加更大，平均甜度增大40.0％。
實施例3
一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑的方法，整體與實施例1一致，差異之處在于：
2)原料的預處理：
將干海藻整體浸泡于5倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量5％的亞硫酸鉀并混合均勻，在溫度60℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進行軟化3h，得到一種ph約為7的海藻漿液。
3)一級酶解
將溫度控制在50℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計1％的纖維素酶，0.3％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間6h，此時酶解液ph6.5，結束一級酶解；
5)酶解液均質
將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質機進行進一步細化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細化至10μm；
6)二級酶解
將步驟5)獲得的均質酶解液調節(jié)至ph7.5，溫度調節(jié)至50℃；
7)后處理
將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進行固液分離，可獲得固形物含量在3％的海藻酶法提取液；
根據本實施例生產的整體生物酶解法制備海藻植物生長調節(jié)劑，田間肥效實驗情況為：海藻植物生長調節(jié)劑在草莓上的實驗效果：草莓的果實大小明顯比清水對照組大，平均增重19.56％；草莓的甜度相比清水對照組，增加更大，平均甜度增大33.8％。
綜上試驗說明，采用鮮海藻獲取的海藻植物生長調節(jié)劑效果優(yōu)于干海藻，與同時申報的另一發(fā)明相比，說明高純度的促生長素相較于高活性多雜質的促生長素對植物生長的促進作用更加明顯。
對所公開的實施例的上述說明，僅為了使本領域專業(yè)技術人員能夠實現或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。