聚酰胺?胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉(zhuǎn)染的應用方法與流程

本發(fā)明涉及一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉(zhuǎn)染的應用方法，特別涉及一種聚乙二醇和葉酸修飾的聚酰胺-胺樹狀大分子包裹納米金顆粒作為非病毒載體進行基因轉(zhuǎn)染及免疫安全性研究的應用方法，屬于功能化高分子納米材料基因轉(zhuǎn)染載體技術領域。

背景技術：

基因治療是指通過基因水平的操作而達到治療或預防疾病的方法。目前，基因治療主要是針對嚴重威脅人類健康的疾病進行治療，癌癥是其主要應用領域。基因治療技術如今發(fā)展迅速，部分基因治療方案已經(jīng)進入臨床試驗階段。在臨床試驗時，發(fā)現(xiàn)了很多安全隱患，比如其安全性、靶向性、轉(zhuǎn)移效率較低等問題尚未解決。

目前，在基因載體系統(tǒng)中主要分為兩部分，病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體由于其高效的轉(zhuǎn)染效率從而應用于臨床上的基因治療。但是由于其體積小，所以運載基因的數(shù)量有限，而且容易產(chǎn)生基因突變和免疫原性。然而，非病毒載體的生物安全性好，免疫原性低。其與脂質(zhì)體、多聚物和dna復合物等產(chǎn)品的相繼出現(xiàn)，促使非病毒載體在基因治療中的廣泛應用。

非病毒載體系統(tǒng)中，樹狀大分子能作為一種理想的納米材料應用于基因傳遞系統(tǒng)。其區(qū)別于傳統(tǒng)的線性聚合物類納米材料，具有獨特的高度支化三維立體結(jié)構，有良好的單分散性。樹狀大分子經(jīng)過各種表面化修飾，如聚乙二醇化、乙?；屯榛龋a(chǎn)生了不同的理化性質(zhì)。研究表明，第五代樹狀大分子有一定的細胞毒性，但是與納米金顆粒形成復合物[shany.，luot.，pengc.，etal.，genedeliveryusingdendrimer-entrappedgoldnanoparticlesasnonviralvectors[j].biomaterials，2012，33(10)：p.3025-3035.]會降低載體的毒性。xiao等[xiaot.，houw.，caox.，etal.，dendrimer-entrappedgoldnanoparticlesmodifiedwithfolicacidfortargetedgenedeliveryapplications.biomaterialsscience，2013，1(11)：p.1172.]將葉酸修飾到第五代樹狀大分子(pamam)表面，與基因在特定比例下產(chǎn)生了更高的基因轉(zhuǎn)染效率。

從分子生物學角度分析基因轉(zhuǎn)染的免疫安全性，其中實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr技術是基因轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因表達量的重要檢測手段，在生物醫(yī)學領域應用廣泛。實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr技術一般采用2^-△△ct法，計算實驗組與對照組中基因的相對表達量。公式是△△ct＝(ct目的基因-ct對照基因)實驗組-(ct目的基因-ct對照基因)對照組，ct值是熒光信號達到閾值時的體系循環(huán)數(shù)目。

檢索國內(nèi)外相關文獻和專利結(jié)果表明：聚乙二醇和葉酸共同修飾聚酰胺-胺樹狀大分子包裹納米金顆粒作為基因載體進行基因轉(zhuǎn)染，運用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr技術對基因轉(zhuǎn)染后的免疫安全性檢測尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉(zhuǎn)染的應用方法，得到的復合物能具有良好生物相容性、細胞免疫安全性以及高效基因轉(zhuǎn)染效率，在惡性腫瘤的基因治療等方面有較好的應用前景。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物作為非病毒載體進行基因轉(zhuǎn)染的應用方法，其特征在于，所述樹狀大分子的表面是氨基末端，對其進行化學修飾可降低其毒性并提高轉(zhuǎn)染效率；其末端連接靶向基團包括葉酸，rgd，透明質(zhì)酸，能高效地進行基因傳遞。

優(yōu)選地，所述化學修飾的方法為修飾聚乙二醇、修飾環(huán)糊精、乙?；屯榛姆椒ㄖ械娜我庖环N或幾種。

優(yōu)選地，所述復合物中au與g5.nh2摩爾比為25∶1及以上。

更優(yōu)選地，所述復合物中au與g5.nh2摩爾比為25∶1、50∶1、75∶1或100∶1。

優(yōu)選地，所述復合物在基因轉(zhuǎn)染體系中的濃度為1.0～2.0mg/ml。

優(yōu)選地，所述基因傳遞的傳遞外源治療基因包括pdna，cpgdna，反義核苷酸，sirna及ssdna中的任意一種或幾種。

更優(yōu)選地，所述基因傳遞的外源治療基因的目標細胞包括癌細胞及體細胞。

更優(yōu)選地，所述癌細胞包括hela，u87及a549；所述體細胞包括巨噬細胞，t淋巴細胞，b淋巴細胞，樹突狀細胞。

更優(yōu)選地，所述復合物與dna的n/p比為0.5∶1及以上。

更優(yōu)選地，所述復合物與dna的n/p比為0.5∶1、1∶1、2.5∶1、5∶1或7∶1。

更優(yōu)選地，所述pdna是從大腸桿菌(e.colidh5α菌株)中提取的，質(zhì)粒為攜帶卡那霉素抗性基因并帶有綠色熒光蛋白報告基因的質(zhì)粒；所述cpgdna是由人工合成，序列為5’-tccatgacgttcctgatgct-3’。

優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染時間為4～12h。

優(yōu)選地，所述聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物的制備方法包括以下具體步驟：

步驟1)：{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}的合成：將mpeg(相對分子質(zhì)量為2000)溶解于dmso中，edc與mpeg按照摩爾比10∶1的比例均勻混合，反應30-40min，再加入與edc等比例的nhs反應3-4h；將活化好的mpeg與g5.nh2的dmso溶液按照摩爾比10∶1的比例混合72-84h；在上述反應的產(chǎn)物中按照樹狀大分子與金摩爾比為1∶50的量加入氯金酸haucl4反應30min；然后加入nabh4使其還原，攪拌條件下反應3-4h；將反應液透析3-4天，最后經(jīng)冷凍干燥得到樣品{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}，記作s1；

步驟2)：{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}的合成：將fa和edc按照摩爾比1∶0.9比例均勻混合，反應30-40min，再加入與edc等比例的nhs反應3-4h；將peg與活化好的fa按照摩爾比1∶2比例加入到g5.nh2中，避光攪拌72-84h；再按照樹狀大分子與金摩爾比為1∶50加入haucl4反應30min，再迅速加入5倍量的nabh4使其還原，避光條件下攪拌3-4h；將反應液透析3-4天，最后經(jīng)過冷凍干燥得到樣品2{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}，記作s2；其中haucl4溶液的濃度為30.15mg/ml；nabh4溶液的濃度為10mg/ml；edc濃度為9.7mg/ml；nhs濃度為5.05mg/ml；mpeg的濃度為4mg/ml；g5.nh2溶液的濃度為0.44μmol/ml，fa濃度為2mg/ml。

更優(yōu)選地，所述步驟1)與步驟2)合成的兩種樣品作為載體應用于hela的基因轉(zhuǎn)染的方法是按照聚酰胺-胺樹狀大分子與納米金顆粒的復合物與pdna按照不同的n/p(樹狀大分子的伯氨基與pdna分子中的磷酸基團摩爾比)分別為1∶1、2.5∶1、5∶1制備載體與pdna的復合物；在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)hela細胞，再加入前述三種n/p比的復合物/pdna復合體在細胞中基因轉(zhuǎn)染4h。

優(yōu)選地，采用實時熒光定量pcr儀或酶聯(lián)免疫吸附法測定基因轉(zhuǎn)染后的復合物或復合物與dna刺激免疫細胞分泌細胞因子的相對表達量。

更優(yōu)選地，所述實時熒光定量pcr儀中pcr擴增的細胞因子為ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-1β、il-6、il-10、tnf-α和il-12中的任意一種或幾種細胞因子。

更優(yōu)選地，所述復合物在raw264.7(巨噬細胞)中基因轉(zhuǎn)染4h后進行細胞因子il-6和tnf-α細胞因子檢測，步驟1)與步驟2)制備的兩種樣品分別與pdna和cpgdna復合物進行基因轉(zhuǎn)染，運用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄pcr檢測raw264.7的細胞因子tnf-α和il-6的基因表達水平，用以檢測基因轉(zhuǎn)染是否引起細胞免疫反應。

更優(yōu)選地，所述檢測基因轉(zhuǎn)染是否引起細胞免疫反應的具體步驟如下：

步驟a)：巨噬細胞總核酸的提?。阂悦?×10⁶個巨噬細胞種到6孔板中，向每孔加入復合物或復合物/dna復合體轉(zhuǎn)染4h后，分別加入totalrnaextractor1ml；裂解的樣品在室溫下放置5-10min，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩后放置3min，然后在12000rpm條件下離心10min；取上層水相至離心管，加入等體積異丙醇，混勻放置20min；在12000rpm條件下離心10min，移除上清液；再加入1ml75％的乙醇洗滌沉淀，在12000rpm離心3min，移除上清液；最后加30～50μlrnase-freeddh2o充分溶解rna，得到rna溶液；

步驟b)：制備反轉(zhuǎn)錄樣品：參照市售反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將以下試劑加入冰浴的pcr管：1μlrna模板，1μl引物，1μldntp(0.5mm)，rnase-freeddh2o10μl，輕輕混勻后離心5s；反應混合物在65℃溫浴5min后，冰浴2min，然后離心3～5s；將pcr管冰浴，再加入試劑4μl的5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.5μl核糖核酸酶抑制劑和1μl逆轉(zhuǎn)錄酶；再輕輕混勻后離心3～5s；在pcr儀上進行反轉(zhuǎn)錄反應：25℃孵育10min，50℃反應30min進行cdna合成，85℃反應5min進行終止反應，得到反轉(zhuǎn)錄樣品；

步驟c)：pcr擴增：在冰浴條件下加入如下反應混合物，10μl2×superrealpremixplus，0.6μl上游引物(10μm)，0.6μl下游引物(10μm)，2.5μlcdna模板(稀釋至10pm)，0.4μl50×rox，rnase-freeddh2o加至20μl；在95℃預變性15min，95℃變性10s，62℃退火及延伸32s，反應40個循環(huán)；最后儀器分析出擴增產(chǎn)物的標準動力學曲線和溶解曲線。

本發(fā)明以兩種聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米金顆粒復合物為載體，攜帶質(zhì)粒dna對hela細胞進行基因轉(zhuǎn)染。通過核磁、紫外吸收測定、透射電子顯微鏡對復合物的物理化學特征進行表征；利用末端氨基定量試劑盒測定載體的末端氨基數(shù)目；cck-8檢測載體與pdna復合物的細胞毒性；瓊脂糖凝膠電泳技術確定載體完全結(jié)合基因的氮磷比；通過表面電勢與水動力學粒徑對載體與pdna復合物的電勢和粒徑進行了分析；綠色熒光蛋白的表達用來研究載體傳遞質(zhì)粒dna的效率；流式細胞技術及激光共聚焦顯微鏡技術用來研究載體與基因復合物的細胞內(nèi)吞效率和細胞定位；利用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應方法檢測載體與基因復合物的免疫原性。本發(fā)明將mpeg與g5pamam表面氨基基團共價結(jié)合，可以通過中和其部分表面氨基以降低復合物的細胞毒性，并提高復合物的生物相容性。通過連接上葉酸，可以使復合物具有靶向性，提高了基因轉(zhuǎn)染效率。

本發(fā)明制備的聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米金顆粒復合物具有良好的基因轉(zhuǎn)染效果；轉(zhuǎn)染過程易于操作，生物相容性好，免疫原性低，為非病毒基因載體在基因傳遞上的應用提供參考。

附圖說明

圖1為實施例2中的復合物的核磁圖譜；

圖2為實施例3中的復合物的紫外吸收圖譜；

圖3為實施例4中的復合物的透射電子顯微鏡圖及平均粒徑尺寸圖。3a為復合物s1(左上)和s2(左下)的透射電子顯微鏡圖片；3b為復合物s1(右上)和s2(右下)的平均粒徑尺寸圖；

圖4為實施例6中的復合物/pdna復合體的hela細胞毒性檢測圖；

圖5為實施例7中的復合物/pdna復合體的瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

圖6為實施例8中的復合物/pdna復合體的表面電勢圖；

圖7為實施例8中的復合物/pdna復合體的水動力學粒徑圖；

圖8為實施例9中的復合物/pdna復合體對hela細胞的綠色熒光蛋白表達檢測圖；

圖9為實施例10中的復合物/pdna復合體對hela細胞的細胞吞噬效率圖；

圖10為實施例11中的復合物/pdna復合體對hela細胞的胞內(nèi)定位結(jié)果圖；

圖11為實施例12中的復合物/pdna復合體對raw264.7細胞毒性檢測圖；

圖12為實施例13中的復合物/pdna復合體對raw264.7免疫原性檢測標準動力學曲線；

圖13為實施例13中的復合物/pdna復合體對raw264.7免疫原性檢測溶解曲線；

圖14為實施例13中的復合物對raw264.7細胞對raw264.7的免疫原性檢測圖；

圖15為實施例13中的復合物和復合物/pdna復合體對raw264.7細胞的免疫原性檢測圖；

圖16為實施例13中的復合物和復合物/cpgdna復合體對raw264.7細胞的免疫原性檢測圖；

圖17為實施例1中的復合物合成步驟示意圖，a為復合物s1的合成步驟，b為復合物s2的合成步驟。

具體實施方式

為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。

實施例1

稱取20.25mg的mpeg(分子量為2000)溶解于dmso中，9.59mgedc與mpeg溶液按照摩爾比10∶1的比例均勻混合，再加入5.25mgnhs反應3h。將47.34mg的g5.nh2溶解于dmso溶液按照摩爾比10∶1的比例充分混合，反應72h。在上述反應的產(chǎn)物中按照樹狀大分子與金摩爾比為1∶50的量加入41.39mghaucl4反應30min，再加入18.9mgnabh4攪拌條件下反應3h。透析3天后經(jīng)冷凍干燥得到{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}，記錄為s1(如圖17a)。稱取11.26mg的fa，4.4mg的edc和2.64mg的nhs按照1∶0.9∶0.9比例均勻混合。將20.25mg的peg與活化好的fa按照摩爾比1∶2比例加入到47.34mg的g5.nh2中，避光攪拌72h。再加入haucl4反應30min，迅速加入5倍量的nabh4使其還原，避光條件下攪拌3h。將反應液透析3天，最后經(jīng)冷凍干燥得到{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}，記錄為s2(如圖17b)。

實施例2

分別稱取5mg的s1和s2分別溶于700ml的d2o中，對兩種溶液進行超聲，然后使用核磁共振波譜儀測定兩種復合物的核磁氫譜。核磁結(jié)果如圖1所示，¹hnmr圖譜用于表征接到g5.nh2上的碳鏈的個數(shù)，g5.nh2特征基團的質(zhì)子峰在化學位移2.0-3.5ppm之間，在3.4-3.6ppm之間出現(xiàn)的質(zhì)子吸收峰，說明mpeg被成功的連接到g5.nh2上，在6.6-8.5ppm之間出現(xiàn)的質(zhì)子吸收峰說明了fa被成功接到g5.nh2上。利用origin軟件計算出質(zhì)子峰的積分面積，得到平均每個g5.nh2表面連接大約10個mpeg，大約3.2個fa。結(jié)果表明按照預設的目標合成了{(au⁰)50-g5.nh2-mpeg10}和{(au⁰)50-g5.nh2-peg10-fa5}。

實施例3

將材料s1和材料s2分別溶解于超純水中，配制成濃度為200μg/ml溶液，利用紫外-可見分光光度計檢測在300nm-800nm波段范圍內(nèi)的紫外吸收值。紫外-可見分光光度檢測結(jié)果如圖2所示，復合物中g5.nh2在520nm處左右均有吸收峰，說明納米金顆粒被成功包裹。在280nm處有吸收峰說明fa成功接到了g5.nh2上。

實施例4

將配制好的s1和s2水溶液(1mg/ml)滴到有碳膜的銅網(wǎng)表面，置于室溫下干燥，制得樣品。然后采用jem-2010f型透射電子顯微鏡在200kv下檢測樣品(圖3a)。采用imagej軟件進行測量并計算出樣品尺寸，s1的平均尺寸(圖3b)約2.9nm和s2的平均尺寸(圖3b)約3.1nm。圖中可看出制備的復合物呈球形，分散性較好。

實施例5

以宮頸癌細胞(hela)為模式細胞，實施例1制備得到的兩種復合物末端氨基定氮檢測。將s1和s2分別溶解于水中配制成2mg/ml的溶液，再根據(jù)初級氨基檢測試劑盒(panopa)的實驗方法測定復合物的表面氨基數(shù)目。實驗步驟為：從試劑1中取一粒片狀藥品，用3ml超純水溶解，配成溶液1。對照組中取50μl超純水加入溶液1充分混勻，實驗組中取待測復合物s1或s250μl加入溶液1充分混勻，反應3min后在吸光度為340nm處測量，分別記錄吸光度a0和a1；再分別加入100μl溶液2充分混勻并反應15min，在吸光度為340nm處記錄數(shù)據(jù)a2和a3。根據(jù)公式計算出樣品中末端氨基氮的濃度(mg/l)。結(jié)果顯示，經(jīng)mpeg修飾后，末端氨基的數(shù)目為29.9。而在修飾mpeg再連接fa之后，末端氨基的數(shù)目為21.6，這可能是由于fa與氨基共價連接，從而減少pamam表面氨基的數(shù)目，以降低復合物的毒性。

實施例6

以宮頸癌細胞(hela)為模式細胞，實施例1制備得到的兩種復合物/pdna復合體的細胞毒性檢測。培養(yǎng)瓶中處于指數(shù)生長期的hela細胞用胰酶消化后收集，以6×10³細胞每孔的密度將hela細胞種于96孔板中。在含有10％fbs的200μldmem培養(yǎng)基中在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h，換成含有50nm，100nm，500nm，1000nm，2000nm，3000nm不同濃度復合物的培養(yǎng)基，再加入1μgpdna復合物繼續(xù)培養(yǎng)4h。將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μlcck-8(5.0mg/ml)溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測量450nm波長處各孔的吸光度。圖4結(jié)果顯示，隨著復合物的濃度增加，細胞活力逐漸降低。但是載體與pdna復合物在hela細胞內(nèi)的細胞存活率均在75％以上，表明兩種復合物/pdna復合體的細胞毒性很低，有利于后續(xù)實驗。

實施例7

以宮頸癌細胞(hela)為模式細胞，實施例1制備得到的復合物與質(zhì)粒dna的結(jié)合能力一般采用瓊脂糖凝膠電泳實驗進行測定。按照氮磷比為0.25，0.5，1，2.5，5，7制備載體與pdna復合物，單獨的pdna作為對照。稱取0.5g瓊脂糖加入至50mltris-硼酸電泳緩沖液(0.5×tbe)中混合。在微波爐中反復加熱三次，每次約1min，直至瓊脂糖溶解，且瓶中無氣泡。待瓶中溫度降低至50-60℃，往膠中加入4μl濃度為1mg/ml的溴化乙錠(eb)染料，搖勻倒入擺好梳子的膠槽內(nèi)，等待約15min后拔掉梳子，準備上樣。將載體與pdna復合物與上樣緩沖液(6×loadingbuffer)混勻后分別加到瓊脂糖凝膠的孔中，電壓80v，時間30min。跑膠結(jié)束后用凝膠成像儀分析pdna在凝膠中的遷移情況。在不同n/p條件下，每個泳道中條帶的分離狀況表示不同濃度的復合物包裹基因的能力，圖5是載體與pdna復合物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中顯示復合物/pdna復合體在n/p為2.5時觀察不到明顯的dna條帶，說明復合物/dna復合體沒有向正極移動，具有較強的包裹能力，能壓縮質(zhì)粒dna。

實施例8

以宮頸癌細胞(hela)為模式細胞，將質(zhì)粒dna與實施例1的方法制備的復合物按照三種氮磷比為1∶1，2.5∶1，5∶1，分別與1μgpdna共孵育得到載體與pdna復合物。復合物s1和s2與pdna復合體作為實驗組，復合物s1和s2作為對照組。在室溫條件下孵育30min后加入1毫升pbs緩沖液，然后采用激光粒度儀(malvern，uk)測定復合物的水動力學粒徑和表面電勢。測試是以he-ne為激光源，激光波長是633nm，入射角為90°，測量溫度為25℃為實驗條件，對復合物進行表征。結(jié)果顯示，載體與pdna復合物的表面電勢(圖6)均為正，pdna的負電荷中和了復合物正電荷，正如圖中兩種載體與dna復合物的電勢分別小于兩種載體的電勢。隨著氮磷比的增加，復合物的表面電勢也有增加的趨勢，電勢范圍均在正常范圍內(nèi)，有利于復合物和細胞間相互作用，便于載體對目的基因的傳遞。載體與pdna復合物隨著氮磷比增加，相互作用增強，粒徑依次減小(圖7)。當?shù)妆葹?.5時，粒徑范圍處于200nm與300nm之間，此時復合物容易進入細胞，利于細胞內(nèi)基因傳遞。

實施例9

以宮頸癌細胞(hela)為模式細胞，實施例1制備得到的復合物傳遞含有egfp(增強型綠色熒光蛋白)基因的質(zhì)粒dna的效率檢測，熒光強度的大小反映出egfp基因的轉(zhuǎn)染效率。

在24孔板上種密度為3.5×10⁴hela細胞每孔，在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h，棄去舊培養(yǎng)基，加入新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。質(zhì)粒和復合物按照n/p為1，2.5，5條件下混合，室溫下避光放置20min，再加入孔板中進行基因轉(zhuǎn)染4h。用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達。圖8是復合物與pdna復合體在hela細胞中的綠色熒光蛋白表達檢測圖。結(jié)果顯示，s2在上述三種n/p條件下，綠色熒光蛋白的表達量都比s1多。說明連接葉酸的靶向機制能有效的提高復合物的基因轉(zhuǎn)染能力。在n/p為2.5時比n/p為5時細胞轉(zhuǎn)染效率高，可能是由于n/p增大時，復合物與pdna的相互作用增大，從而導致pdna在細胞內(nèi)難從復合物中釋放出來，無法表達出相應的蛋白產(chǎn)物。當連接fa時，綠色熒光蛋白表達量增多，可以初步推測是fa靶向作用的結(jié)果。

實施例10

以宮頸癌細胞(hela)為模式細胞，實施例1的方法制備得到的復合物傳遞pdna的細胞內(nèi)吞效率。以5×10⁴hela細胞每孔的密度種于24孔板中，在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h。在實施例8上述三個n/p條件下，按照每孔加1gcy3標記的pdna和復合物進行混合，室溫下避光放置20min，再加入孔板中進行基因轉(zhuǎn)染4h，使載體與cy3-pdna復合物充分進入細胞。然后，用1ml滅菌的pbs重新懸浮細胞，并將待檢測樣品放在冰上。每組設定三個平行實驗，用流式細胞儀對每個樣品進行檢測。每次測定細胞數(shù)量為1×10⁴每管，檢測細胞釋放的紅色熒光，設定fsh-h/ssc-h為細胞門，設定fl2-h為cy3熒光通道，每組樣品重復測定三次。圖9是復合物與cy3標記pdna復合體在hela細胞中的細胞內(nèi)吞實驗，結(jié)果顯示在n/p為2.5條件下，cy3激發(fā)的紅色熒光信號強度最強。表明s1，s2在n/p為2.5時，顯示出良好的細胞內(nèi)吞效率。

實施例11

以宮頸癌細胞(hela)為模式細胞，實施例1的方法制備得到復合物s1，s2。通過胞內(nèi)的共定位實驗可以對audenps在作為基因轉(zhuǎn)染載體時在胞內(nèi)的傳遞途徑與胞內(nèi)定位情況進行研究，用cy3染料特異性標記pdna，與復合物形成復合體來轉(zhuǎn)染hela細胞，從而可以確定他們是否具有相同的胞內(nèi)傳遞途徑以及進入細胞內(nèi)以后的去向。以1×10⁵細胞每個孔的密度種在12孔板上，在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)24h。換成無血清培養(yǎng)基，加入復合物與pdna復合體，孵化4h。孵化后，將復合物與pdna復合體吸出，用無菌pbs洗2遍，加入2.5％的戊二醛，在4℃下固定30min，dapi染料標記細胞核7min。然后用pbs清洗細胞三遍后，用激光共聚焦顯微鏡來觀察和記錄實驗結(jié)果。圖10是各復合物與cy3-pdna復合體在hela細胞中的細胞定位圖。結(jié)果顯示復合物與細胞經(jīng)過4h的基因轉(zhuǎn)染后，通過胞內(nèi)傳遞途徑將基因傳遞到細胞核周圍，尤其是在n/p條件為2.5條件下，s2與cy3標記的pdna復合體大量集中在細胞質(zhì)的細胞核周圍，表明修飾了peg和fa沒有影響復合物的生物學功能，還提高了基因轉(zhuǎn)染效率。整體上，s2比s1的細胞內(nèi)吞效率略高，與實施例10的結(jié)果一致。

實施例12

以巨噬細胞(raw264.7)為模式細胞，檢測實施例1制備得到的復合物與pdna形成的復合體的細胞毒性。以6×10³細胞每孔的密度將raw264.7細胞種于96孔板中，在含有10％fbs的200μldmem培養(yǎng)基中在37℃和5％co2條件下培養(yǎng)12h，換成含有50nm，100nm，500nm，1000nm，2000nm，3000nm不同濃度梯度復合物的新鮮培養(yǎng)基，再加入1μgpdna復合物繼續(xù)培養(yǎng)4h，每個梯度設定3個復孔。將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10μlcck-8(5.0mg/ml)溶液，并在培養(yǎng)箱中孵育4h。孵育結(jié)束后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測量450nm波長處各孔的吸光度。圖11結(jié)果顯示，隨著復合物的濃度增加，細胞活力逐漸降低。整體上，復合物與pdna復合體在巨噬細胞內(nèi)的細胞存活率均在75％以上，表明復合物與pdna復合體的細胞毒性很低，有利于后續(xù)實驗。

實施例13

巨噬細胞培養(yǎng)到指數(shù)生長期，用胰酶消化后收集，計數(shù)器計數(shù)后以6×10⁵細胞個/孔的密度種到6孔板中，加入培養(yǎng)基dmem約2ml；按照預設的n/p值為2.5配制兩種復合物和dna的復合體。脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基的細胞作為陽性對照組。實驗步驟主要分為總rna提取、反轉(zhuǎn)錄、兩步法pcr擴增反應。具體包括：

(1)巨噬細胞總核酸的提取：以每1×10⁶個巨噬細胞種到6孔板中，向每孔加入復合物或復合物/dna復合體轉(zhuǎn)染4h后，分別加入totalrnaextractor1ml。裂解的樣品在室溫下放置5-10min，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩后放置3min，然后在12000rpm條件下離心10min。取上層水相至離心管，加入等體積異丙醇，混勻放置20min。在12000rpm條件下離心10min，移除上清液。再加入1ml75％的乙醇洗滌沉淀，在12000rpm離心3min，移除上清液。最后加30～50μlrnase-freeddh2o充分溶解rna，得到rna溶液。

(2)制備反轉(zhuǎn)錄樣品：將冰浴的pcr管中加入以下試劑：提取的rna，1μl引物，1μldntp(0.5mm)，rnase-freeddh2o約10μl，輕輕混勻后離心5s。反應混合物在65℃溫浴5min后，冰浴2min，然后離心3～5s。將pcr管冰浴，再加入試劑4μl的5倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.5μl核糖核酸酶抑制劑和1μl逆轉(zhuǎn)錄酶。再輕輕混勻后離心3～5s。在pcr儀上進行反轉(zhuǎn)錄反應：25℃孵育10min，50℃反應30min進行cdna合成，85℃反應5min進行終止反應，得到反轉(zhuǎn)錄樣品。

(3)pcr擴增：在冰浴條件下加入如下反應混合物，10μl2×superrealpremixplus，0.6μl上游引物(10μm)，0.6μl下游引物(10μm)，2.5μlcdna模板(稀釋至10pm)，0.4μl50×rox，rnase-freeddh2o加至20μl。在95℃預變性15min，95℃變性10s，62℃退火及延伸32s，反應40個循環(huán)。最后用abi7500儀器對產(chǎn)物進行分析，系統(tǒng)根據(jù)熒光值的變化規(guī)律生成標準動力學曲線(圖12)和溶解曲線(圖13)。其中標準曲線呈現(xiàn)規(guī)則的s型。三組溶解曲線分別檢測內(nèi)參gapdh，細胞因子il-6和tnf-α，每個溶解曲線呈現(xiàn)出一個峰且無雜峰，表明擴增產(chǎn)物均一。結(jié)果采用△△ct法計算出實驗組與對照組的相對熒光強度。圖14是用qrt-pcr檢測復合物作用于免疫細胞中細胞因子mrna表達量。未作處理的正常細胞作為對照組。兩種復合物與巨噬細胞共培養(yǎng)，再用反轉(zhuǎn)錄實時定量pcr試劑盒采用兩步法反應程序擴增出pcr產(chǎn)物。圖中結(jié)果表明單獨復合物不會引起免疫細胞分泌出以上兩種細胞因子，說明制備的復合物不會引起相應的免疫應答，免疫安全性高。圖15是qrt-pcr檢測復合物與pdna復合體作用于巨噬細胞中細胞因子mrna表達量。巨噬細胞中加入pdna作為陰性對照組。在n/p為2.5條件下，復合物和pdna孵育4h進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束后再用反轉(zhuǎn)錄實時定量pcr擴增出pcr產(chǎn)物，計算出相對熒光強度。結(jié)果表明經(jīng)過質(zhì)粒dna基因轉(zhuǎn)染后，巨噬細胞也沒有產(chǎn)生細胞因子，說明復合物與pdna復合體的基因轉(zhuǎn)染過程免疫安全性高，免疫原性好。圖16是qrt-pcr檢測復合物與cpgdna復合體作用于巨噬細胞中細胞因子mrna表達量。巨噬細胞中加入cpgdna作為陰性對照組。復合物和cpgdna孵育4h進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束后再用反轉(zhuǎn)錄實時定量pcr擴增出pcr產(chǎn)物。因為cpgdna是強免疫激活劑，所以與上述兩組實驗相比，相對熒光表達量高，進一步說明復合物與pdna復合體基因轉(zhuǎn)染過程的免疫原性低，生物安全性高。