一種控制大腸桿菌中質(zhì)粒復(fù)制的方法與流程

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種控制大腸桿菌中質(zhì)粒復(fù)制的方法。

技術(shù)背景

質(zhì)粒是細(xì)胞中染色體以外，能夠獨(dú)立自主復(fù)制的較小的dna分子。其長度從數(shù)千乃至幾百萬堿基不等。其拷貝數(shù)也能從幾個(gè)到上千個(gè)不等。天然存在的質(zhì)粒分子，通常對(duì)宿主細(xì)胞的生存沒有決定性的作用，但是能夠攜帶一些特殊的基因，比如抗生素抗性基因，致病調(diào)控基因等，增加宿主細(xì)胞的遺傳與生理多樣性。鑒于這些特點(diǎn)，在20世紀(jì)70年代前后，質(zhì)粒dna被開發(fā)成為有效的基因工程載體，用以攜帶外源基因到特定的宿主，進(jìn)行基因克隆以及外源蛋白表達(dá)。

大腸桿菌(escherichiacoli)是一種革蘭氏陰性短桿菌，是人和動(dòng)物腸道中最主要的棲居菌之一。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的大腸桿菌通常30min能夠復(fù)制一代。其基因組長度為～4.7mb,包含大約4000個(gè)基因。由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單，生長迅速，遺傳背景清晰，目前已經(jīng)作為模式微生物，被廣泛的應(yīng)用于基因工程，分子生物學(xué)，代謝工程以及合成生物學(xué)相關(guān)的研究以及工業(yè)應(yīng)用中。

目前，實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)應(yīng)用構(gòu)建的～90％以上的質(zhì)粒是在大腸桿菌中進(jìn)行克隆復(fù)制或者生產(chǎn)的。這其中包括用于表達(dá)抗原分子的dna疫苗；用于微生物，植物，動(dòng)物蛋白表達(dá)和功能研究的質(zhì)粒；用于微生物，植物，動(dòng)物基因編輯以及轉(zhuǎn)錄控制的質(zhì)粒以及用于自然界生物基因庫保存的質(zhì)粒等。質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制狀態(tài)以及拷貝數(shù)等對(duì)于利用質(zhì)粒進(jìn)行功能研究以及工業(yè)應(yīng)用具有重要的意義。比如，通過控制質(zhì)粒的復(fù)制，調(diào)控質(zhì)粒上基因的表達(dá)，對(duì)于研究質(zhì)粒上單基因或多基因的表達(dá)，利用質(zhì)粒進(jìn)行合成生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究具有重要價(jià)值。同時(shí)，控制質(zhì)粒的復(fù)制能夠有效的解決毒性基因克隆或表達(dá)困難的問題。一些dna序列，其在大腸桿菌中隨機(jī)或者定向轉(zhuǎn)錄出來的mrna或者翻譯出來的蛋白質(zhì)能夠?qū)Υ竽c桿菌的生長造成很大的干擾。這類基因被稱為毒性基因。這些毒性基因在克隆進(jìn)一些特定的載體比如哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcdna3.1以及大腸桿菌克隆載體puc57的時(shí)候，由于這些載體的拷貝數(shù)比較高，使得這些外源基因的mrna轉(zhuǎn)錄物以及蛋白表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌生長干擾極大的增強(qiáng)，造成大腸桿菌死亡或者生長停滯?？刂瀑|(zhì)粒的復(fù)制，使得質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制的時(shí)候能夠維持在一個(gè)較低的水平，是在構(gòu)建毒性基因克隆表達(dá)質(zhì)粒過程中常用的一種策略。

目前，基因工程和工業(yè)應(yīng)用的，絕大多數(shù)構(gòu)建的質(zhì)粒為colei類型的質(zhì)粒；代表性的cole1質(zhì)粒,比如puc，pet，p15a以及pmb1系列質(zhì)粒。colei類型的質(zhì)粒的復(fù)制依賴于復(fù)制區(qū)轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)小rna，rnai以及rnaii。rnaii全長555bp。在質(zhì)粒復(fù)制開始的時(shí)候，它首先被宿主的rna聚合酶從其啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄出來，并與質(zhì)粒dna模板形成復(fù)合物。接下來，其被宿主體內(nèi)的rnaaseh切割，產(chǎn)生游離的3’羥基端，并作為引物被dna聚合酶i識(shí)別，引導(dǎo)質(zhì)粒的復(fù)制。rnai全長108bp，在colei的復(fù)制中起著負(fù)調(diào)控的作用。它從復(fù)制起點(diǎn)上游的455bp處(rnaii的中間)，以rnaii相反的方向轉(zhuǎn)錄，一直延伸到rnaii的5’轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。它通過與rnaii的結(jié)合，阻止rnaii和dna復(fù)制起始復(fù)合物的形成來抑制質(zhì)粒的復(fù)制。rnaii對(duì)復(fù)制起始的正向作用和rnai對(duì)復(fù)制起始的負(fù)向作用的平衡決定了質(zhì)粒復(fù)制的拷貝數(shù)(solaretal.1998microbiolmolbiolrev；tomizawaj.1984cell；campsm.2010,recentpatdnageneseq)。

專利us7,794,971b1在大腸桿菌中利用誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子表達(dá)了一個(gè)聚合酶基因pcnb的突變體，通過影響rnai的多腺苷酸化，從而影響質(zhì)粒的復(fù)制。pcnb聚合酶能夠決定rnai的多腺苷酸化，從而影響rnai的降解以及與rnaii的復(fù)合物形成。pcnb突變體，能夠大量積累rnai的半衰產(chǎn)物。這些產(chǎn)物與rnaii的結(jié)合，從而抑制質(zhì)粒的復(fù)制。該專利所述的菌株，同時(shí)被epicentre公司(usa)開發(fā)成了商業(yè)化的感受態(tài)，對(duì)外售賣。據(jù)報(bào)道，在不誘導(dǎo)的情況下，其能針對(duì)性的降低core1類型的質(zhì)粒，比如pet28a，puc57等拷貝數(shù)4～20倍。同時(shí)，專利us20110269184a1利用一個(gè)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子在基因組上轉(zhuǎn)錄rnai或rnaii，來實(shí)現(xiàn)core1類型質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控的目的。據(jù)其專利所述，其能夠?qū)uc19質(zhì)粒在細(xì)胞中的量降低10％，能夠?qū)⑷コ齬nai序列的puc19在細(xì)胞中的產(chǎn)量降低3倍左右。

然而由于專利限制以及實(shí)際使用效果一般的原因，這兩種方法都無法被很好的應(yīng)用。另外，由于這兩種方法都是通過調(diào)控colei復(fù)制子起始復(fù)制的小rna的功能，來達(dá)到調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制的目的，調(diào)控模式單一，這些方法很難用于對(duì)質(zhì)粒復(fù)制的動(dòng)態(tài)調(diào)控或者不同能力的調(diào)控。鑒于質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控對(duì)于調(diào)控質(zhì)?；虮磉_(dá)，研究質(zhì)?；蚬δ芤约斑M(jìn)行毒性基因克隆上的用途，開發(fā)出更加有效的，能夠進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控的質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)顯得尤為必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控大腸桿菌中質(zhì)粒復(fù)制的方法

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種控制大腸桿菌中質(zhì)粒復(fù)制的方法，包括如下步驟：

步驟1：在被調(diào)控質(zhì)粒r的復(fù)制起始區(qū)，選擇一段20bp的靶序列n20，其中靶序列的3’端相鄰的序列為ngg；

步驟2：在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一個(gè)cas9蛋白的失活突變體dcas9蛋白(cas9蛋白的h840-a及d10-a雙突變體)以及轉(zhuǎn)錄出針對(duì)被調(diào)控質(zhì)粒r復(fù)制起始區(qū)靶序列n20的grna。

進(jìn)一步的其中步驟1中靶序列的選擇在質(zhì)粒r復(fù)制區(qū)的正鏈或負(fù)鏈上，該靶序列具有與大腸桿菌基因組上的序列不同源的特點(diǎn)。

進(jìn)一步的其中步驟2中g(shù)rna的基因序列為：n20(步驟1涉及的靶序列)+gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttt(grnascaffold+terminationsequence)。

進(jìn)一步的其中步驟2中dcas9蛋白可以通過插入染色體上的dcas9基因來表達(dá)或通過帶有不同于待調(diào)控的r質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒來表達(dá)。

進(jìn)一步的其中步驟2中dcas9蛋白為cas9蛋白的第10位天冬氨酸以及第840位的組氨酸突變?yōu)楸彼岬耐蛔凅w(dcas9序列參考文獻(xiàn)jineketal.2012,science.所述；序列見seqidno:1；突變位點(diǎn)以下劃線標(biāo)注)。所述的dcas9蛋白可以通過插入染色體上的dcas9基因來表達(dá)或通過帶有不同于待調(diào)控的r質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒來表達(dá)。

進(jìn)一步的其中步驟2中g(shù)rna的表達(dá)可以通過插入染色體上的grna的靶基因來轉(zhuǎn)錄或通過帶有不同于待調(diào)控的r質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)錄。

進(jìn)一步的其中步驟1，2中，為了能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)質(zhì)粒復(fù)制能力的不同程度的調(diào)控，可以選擇多個(gè)針對(duì)復(fù)制起始區(qū)不同的靶序列位點(diǎn)設(shè)計(jì)多個(gè)grna表達(dá)序列。利用表達(dá)出的dcas9蛋白和轉(zhuǎn)錄出的不同的grna實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒復(fù)制不同程度的調(diào)控。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明利用crispr/cas9系統(tǒng)開發(fā)出一套調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制的方法。crispr/cas9系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于微生物細(xì)胞中，是細(xì)菌和古細(xì)菌在進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源dna。最近一些年，科學(xué)家們利用該系統(tǒng)的dna編輯能力，開發(fā)出了一系列針對(duì)哺乳動(dòng)物，植物，微生物的基因組編輯(基因敲除/基因敲入)，基因表達(dá)調(diào)控以及染色體復(fù)制調(diào)控的工具。然而，利用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控尚未見報(bào)道。本發(fā)明利用表達(dá)的dcas9蛋白以及轉(zhuǎn)錄的針對(duì)于質(zhì)粒復(fù)制區(qū)靶序列的grna，有效的實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控抑制，是一種全新的方法。該方法中使用的針對(duì)復(fù)制區(qū)的靶序列，可以有多種選擇，保證了利用不同的dcas9/grna對(duì)，實(shí)現(xiàn)不同程度的質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控的目的(如圖1為利用crispr/cas9系統(tǒng)調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制原理示意圖)。本發(fā)明提供的方法比專利us7,794,971b1及us20110269184a1涉及的系統(tǒng)，其能夠更加靈活的實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒復(fù)制不同程度的調(diào)控。其能夠有效的降低同等條件下復(fù)制的質(zhì)粒產(chǎn)量2-34倍，這比已存在的專利us7,794,971b1及us20110269184a1涉及的系統(tǒng)調(diào)控范圍更廣，調(diào)控能力更強(qiáng)?？傊?，該方法具有設(shè)計(jì)新穎，適用性廣的特點(diǎn)，能夠有效實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒復(fù)制不同程度的調(diào)控。

附圖說明：

圖1利用crispr/cas9系統(tǒng)調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制原理示意圖。

其中，a,染色體上或者擁有不同于r質(zhì)粒復(fù)制子類型的質(zhì)粒上的dcas9表達(dá)以及grna轉(zhuǎn)錄；b,dcas9和grna形成復(fù)合物共同調(diào)控質(zhì)粒r的復(fù)制。

圖2針對(duì)質(zhì)粒r復(fù)制子colei隨機(jī)選擇的3個(gè)靶序列g(shù)-01，g-02,g-03序列及位置圖譜。

圖3表達(dá)dcas9和grna的ptd-1/2/3質(zhì)粒圖譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：利用crispr/cas9系統(tǒng)調(diào)控?cái)y帶cole1類型復(fù)制子高拷貝質(zhì)粒的復(fù)制

本實(shí)施例的目的是構(gòu)建一套crispr/cas9系統(tǒng)調(diào)控?cái)y帶colei類型復(fù)制子高拷貝質(zhì)粒的復(fù)制。其步驟如下：

1.針對(duì)于colei類型復(fù)制子區(qū)，設(shè)計(jì)3條不同的grna靶序列，命名為g-01(accagcggtggtttgtttgc),g-02(tcgccactggcagcagccac),g-03(ctttctcccttcgggaagcg)(見附圖2),其中靶序列的3’端相鄰的序列為ngg。其中g(shù)-01位于復(fù)制區(qū)dna的正鏈上，g-02，g-03位于復(fù)制區(qū)dna的負(fù)鏈上。

2.針對(duì)于colei類型復(fù)制子高拷貝質(zhì)粒，設(shè)計(jì)一個(gè)表達(dá)crispr/cas9調(diào)控系統(tǒng)的質(zhì)粒，其帶有如下特點(diǎn)：a.1個(gè)psc101類型的溫敏型復(fù)制子,保證該質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制；b.1個(gè)dcas9蛋白的表達(dá)框，保證dcas9的表達(dá)；c.1個(gè)grna轉(zhuǎn)錄框，其中編碼grna的基因是在lac啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)錄；lac啟動(dòng)子的活力受質(zhì)粒上的laci蛋白負(fù)調(diào)控；d.1個(gè)卡拉霉素抗性基因表達(dá)框(表達(dá)卡拉霉素抗性基因)。在genscript公司合成攜帶編碼grna-1(g-01+gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttt)；grna-2(g-02+gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttt)；grna-3(g-03+gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttt)編碼基因的質(zhì)粒ptd-1,ptd-2和ptd-3(質(zhì)粒圖譜示意圖見附圖2；質(zhì)粒序列見seqidno:2,其中g(shù)-01，g-02和g-03的序列以nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn表示)。

3.測(cè)試質(zhì)粒表達(dá)的crispr/cas9系統(tǒng)對(duì)colei類型質(zhì)粒的調(diào)控。

a.取colei類型質(zhì)粒puc57和3個(gè)dcas9和grna表達(dá)質(zhì)粒，ptd-1,ptd-2和ptd-3；以puc57/ptd-1，puc57/ptd-2和puc57/ptd-3的雙質(zhì)粒組合轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10菌株(neb,uk)，分別涂布于卡拉霉素和氨芐青霉素雙抗平板，過夜培養(yǎng)。同時(shí)將puc57單獨(dú)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌top10菌株(neb,uk)中，涂布于氨芐青霉素的抗性平白上，過夜培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

b.從各平板上挑取單菌落，接種于lb液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。

c.按照1/500的接種量，轉(zhuǎn)接到lb液體培養(yǎng)基中。

d.當(dāng)菌株生長至od600～1，取12ml培養(yǎng)物中，分3份，利用axygen(usa)質(zhì)粒小抽試劑盒抽提質(zhì)粒。

e.取等量抽提的質(zhì)粒用kpni酶切，采用10ul的反應(yīng)體系，37℃反應(yīng)1h(選擇kpni的原因是它在puc57，ptd-1,ptd-2和ptd-3質(zhì)粒上均為單酶切位點(diǎn))。利用agilent2100bioanalyzer檢測(cè)儀(usa)，檢測(cè)puc57的產(chǎn)量，并換算出12ml菌液抽提的puc57的總量。

4.如下表1結(jié)果，轉(zhuǎn)化有ptd-1,ptd-2,ptd-3的菌株，其puc57的產(chǎn)量分別降低了1.95倍，33.7倍和18.6倍。這表明選用不同的grna能夠不同程度的降低puc57質(zhì)粒的拷貝數(shù)，證實(shí)了我們?cè)O(shè)計(jì)的crispr/cas9系統(tǒng)能夠有效的實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒復(fù)制不同程度的調(diào)控。相比目前已存在的專利us7,794,971b1及us20110269184a1涉及的系統(tǒng)，其能夠更加靈活的實(shí)現(xiàn)對(duì)puc57質(zhì)粒復(fù)制不同程度的調(diào)控。同時(shí)，ptd-2顯示能夠使得puc57產(chǎn)量降低最多33.7倍，這比已存在的系統(tǒng)所揭示的能實(shí)現(xiàn)的最大程度(20倍)的調(diào)控要強(qiáng)得多。

表1攜帶ptd-1,ptd-2,ptd-3質(zhì)粒的菌株中抽提的puc57總量差異

*降低的倍數(shù)＝top10菌株中puc57的產(chǎn)量/攜帶ptd-1,ptd-2,ptd-3質(zhì)粒top10菌株中puc57的產(chǎn)量。

sequencelisting

<110>南京金斯瑞生物科技有限公司

<120>一種控制大腸桿菌中質(zhì)粒復(fù)制的方法

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>4107

<212>dna

<213>人工序列

<221>dcas9蛋白編碼基因

<400>1

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