本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp引物、試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
大豆是世界上重要經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物，大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌(phomopsislongicolla)是大豆生產(chǎn)上的一種重要病原菌，可侵染大豆的根部、莖部和豆莢，引致大豆種腐、根腐和莖枯等。莖部感病后，常在下部莖稈葉、分枝與莖連接處產(chǎn)生病斑，顏色較淡，病斑沿莖擴(kuò)展、環(huán)莖，失水褪綠、萎縮和干枯，導(dǎo)致植株上部萎蔫和枯死，葉片不脫落；病株根系完整、健康；發(fā)病較輕植株，上部葉片沿脈間褪綠。豆莢或種子感染后，發(fā)病的種子會(huì)出現(xiàn)皺縮、伸長(zhǎng)、破裂、發(fā)白，影響種子質(zhì)量，造成大豆品質(zhì)下降，并可能導(dǎo)致大豆種子不能發(fā)芽或發(fā)芽緩慢，重發(fā)時(shí)能造成90％的種子不能萌發(fā)或腐爛。目前該菌在美國(guó)、阿根廷、意大利、韓國(guó)、南斯拉夫等都有報(bào)道。我國(guó)是大豆消費(fèi)大國(guó)，也是大豆貿(mào)易大國(guó)，每年需大量進(jìn)口大豆，其中2015年進(jìn)口大豆達(dá)8169萬噸，是國(guó)內(nèi)生產(chǎn)量的6.8倍，占國(guó)內(nèi)消費(fèi)量的87％。進(jìn)口大豆多來自美國(guó)、巴西等大豆種腐病等病害發(fā)生較重的國(guó)家，而大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌常殘留在大豆種子和豆莢、豆稈等病殘?bào)w上，并通過遠(yuǎn)距離運(yùn)輸而傳播蔓延，因此，我國(guó)存在較大的擬莖點(diǎn)種腐病菌輸入風(fēng)險(xiǎn)。大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌侵染到大豆組織后具有一定的潛育期，并未顯癥或癥狀不明顯，常導(dǎo)致漏診或誤診。在這種嚴(yán)峻的形勢(shì)下，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)病原菌和診斷病害是控制病害成災(zāi)的主要措施之一。
擬莖點(diǎn)霉屬真菌檢測(cè)與鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。目前擬莖點(diǎn)霉屬傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要以形態(tài)學(xué)監(jiān)測(cè)為基礎(chǔ)，即：將待鑒定菌株接種在培養(yǎng)基上或其寄主上培養(yǎng)，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡等儀器觀察菌落特征、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子結(jié)構(gòu)等表型特征，結(jié)合寄主上的發(fā)病癥狀，對(duì)照相關(guān)資料，再確定該菌的分類地位。這種方法需要較長(zhǎng)的時(shí)間，且需大量的形態(tài)觀察，無疑加大了檢測(cè)難度。血清學(xué)檢測(cè)方法主要是elisa法，該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)中，但在真菌檢測(cè)中并不普遍，同時(shí)，由于血清制備困難、近似種特異性差及檢測(cè)成本過高，以及成品試劑盒不易獲得等原因，elisa方法在擬莖點(diǎn)霉真菌檢測(cè)上的應(yīng)用很少。用于擬莖點(diǎn)霉屬真菌分子檢測(cè)鑒定的常用方法包括pcr、多重pcr、巢式pcr、熒光pcr、rlfp、rapd、ssr等，近年來，dna指紋、基因芯片技術(shù)等亦開始起步，雖然這些分子檢測(cè)技術(shù)的效率高、靈敏度高，且能從植物組織中直接檢測(cè)到病原菌，但大部分技術(shù)又存在重復(fù)性、可操作性、多態(tài)性、成本、檢測(cè)范圍及環(huán)境因素等問題，例如巢式pcr、多重pcr需要染膠處理，實(shí)時(shí)熒光pcr因熒光染料和熒光探針的價(jià)格及儀器價(jià)格等因素使得檢測(cè)成本較高，rapd只能對(duì)室內(nèi)純培養(yǎng)的菌進(jìn)行檢測(cè)，而在自然界的發(fā)病植株中，往往會(huì)感染多種真菌，這會(huì)導(dǎo)致分子檢測(cè)結(jié)果不全面，只能檢測(cè)到某種或某幾種病原菌。因此，這些檢測(cè)技術(shù)并未能得到普遍應(yīng)用。
2000年，notomi等人研發(fā)出了一項(xiàng)全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(lamp,loop-mediatedisothermalamplification)。該技術(shù)使用四條或六條引物，以bstdna聚合酶作為擴(kuò)增酶，恒溫條件下對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增。其產(chǎn)物可以通過凝膠電泳進(jìn)行觀察，同時(shí)可以通過田間顯色反應(yīng)指示劑目測(cè)直接進(jìn)行觀察。lamp技術(shù)的發(fā)明，為病原物快速檢測(cè)建立了一個(gè)良好的平臺(tái)，該技術(shù)具有非常鮮明的特點(diǎn)，不需要模板核酸片段的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間的溫度變化循環(huán)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果不需要凝膠電泳染色后進(jìn)行紫外觀察，這就避免了普通pcr所需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器以及專業(yè)的實(shí)驗(yàn)操作場(chǎng)所，因而該技術(shù)適合在基層、進(jìn)出口檢疫部門進(jìn)行快速的病原物診斷。
發(fā)展分子檢測(cè)最重要的一點(diǎn)就是選用合適的分子檢測(cè)靶標(biāo)。鈣調(diào)素(calmodulin,cam)編碼基因在進(jìn)化較為保守，其外顯子區(qū)域在屬間具有一定的保守性，同時(shí)該基因存在序列差異較大的非編碼的內(nèi)含子區(qū)域，該區(qū)域在堿基水平上具有明顯的種間差異，因此該編碼基因可以用來作為分子檢測(cè)的靶標(biāo)而加以應(yīng)用。本發(fā)明通過序列比對(duì)分析大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌和其他擬莖點(diǎn)霉病菌及大豆常發(fā)病原菌在cam基因序列上的差異，設(shè)計(jì)了大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌特異性的lamp引物，在此基礎(chǔ)上建立了大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌lamp快速檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)擬莖點(diǎn)種腐病菌引致病害的早期準(zhǔn)確診斷，對(duì)及時(shí)采取防控措施、減少農(nóng)藥使用、保障大豆生產(chǎn)安全和質(zhì)量安全具有重要作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了鈣調(diào)素cam蛋白編碼基因序列作為靶標(biāo)在檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌中的應(yīng)用，目的是提供一種用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp引物組。
本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp引物組的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一目的是提供用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案如下：
鈣調(diào)素cam蛋白編碼基因序列作為靶標(biāo)在檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌中的應(yīng)用，其特征在于：所述的基因序列如序列表中seqidno.1所示。
用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp引物組，包括下列引物：
正向外引物f3:5’-tgctaacggaccgttttcg-3’，
反向外引物b3:5’-aagggaccgcatgactgt-3’，
正向內(nèi)引物fip(f1c+f2):
5’-tgcgtagctgagaaagaggggagcctgcaggataaggatgg-3’，
反向內(nèi)引物bip(b1c+b2):
5’-cgtgcagctactccgaccgagtgatttgtcctacacgcca-3’
所述的用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp試劑盒，包括：2.5μl10×thermopolbuffer，6mmmgso4、0.8mbetaine,1.4mmdntps,lamp所用的lamp特異性引物0.2μmf3,0.2μmb3,1.6μmfip,1.6μmbip，8ubstdnapolymerase組成的檢測(cè)溶液。
一種大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp檢測(cè)方法，取16.5μl檢測(cè)溶液，加入2μl待檢測(cè)dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑，陽(yáng)性反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，表示存在大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌，陰性反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，表示不存在大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌，或所含大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌未達(dá)到最低檢測(cè)量。
有益效果：
與傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明具有更高的準(zhǔn)確性、靈敏度和時(shí)效性。以形態(tài)特征為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、需要檢測(cè)的樣品量大，而且要求操作者具備專業(yè)的真菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)和豐富的實(shí)踐操作經(jīng)驗(yàn)，因而經(jīng)常導(dǎo)致漏檢，檢測(cè)準(zhǔn)確率較低。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在不同的大豆病害之間，大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的檢出率為100％，準(zhǔn)確性及特異性高；本發(fā)明最低可以檢測(cè)出100pgdna含量的樣品，靈敏度高；本發(fā)明的耗時(shí)只要60min，加上樣品的富集及dna的提取，一般只需要半個(gè)工作日，時(shí)效性高。
本發(fā)明在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，通過基因序列比對(duì)分析，得到的鈣調(diào)素(calmodulin,cam)編碼基因在進(jìn)化時(shí)較為保守，其外顯子區(qū)域在屬間具有高度的保守性，同時(shí)該基因存在序列差異較大的非編碼的內(nèi)含子區(qū)域，該區(qū)域在堿基水平上具有明顯的種間差異，因此該編碼基因可以用來作為分子檢測(cè)的靶標(biāo)而加以應(yīng)用。通過lamp引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出多條符合設(shè)計(jì)參數(shù)的引物，但并不是每組引物都具有較好的特異性和擴(kuò)增靈敏度，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，導(dǎo)致出現(xiàn)誤判及錯(cuò)誤的檢測(cè)結(jié)果。因此，如何將軟件設(shè)計(jì)的引物同實(shí)際應(yīng)用結(jié)合起來，顯得尤為關(guān)鍵，本發(fā)明核心正是在一定的理論基礎(chǔ)上，經(jīng)過數(shù)次實(shí)驗(yàn)篩選、驗(yàn)證和甄別出來的。
與現(xiàn)在普遍使用的普通pcr分子檢測(cè)技術(shù)相比較，本發(fā)明對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所的要求簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)操作方便、結(jié)果觀察簡(jiǎn)便直觀。普通pcr分子檢測(cè)技術(shù)需要不同的溫度變化循環(huán)，需要較為專業(yè)的pcr操作儀器，實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要凝膠電泳染色后在凝膠成像儀中進(jìn)行觀察，因此整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要專業(yè)、昂貴的實(shí)驗(yàn)操作儀器，而且操作較為繁瑣。本發(fā)明在62℃恒溫條件下對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過直接觀察反應(yīng)體系顏色的變化即可進(jìn)行判斷。因此本發(fā)明非常適合在基層及進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫部門推廣使用。
具體實(shí)施方式
一種用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp引物組，包括下列引物：
正向外引物f3：5’-tgctaacggaccgttttcg-3’，
反向外引物b3：5’-aagggaccgcatgactgt-3’，
正向內(nèi)引物fip：
5’-tgcgtagctgagaaagaggggagcctgcaggataaggatgg-3’
反向內(nèi)引物bip：
5’-cgtgcagctactccgaccgagtgatttgtcctacacgcca-3’。
實(shí)施列1
用于檢測(cè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌的lamp試劑盒，包括：2.5μl10×thermopolbuffer，6mmmgso4、0.8mbetaine,1.4mmdntps,lamp所用的lamp特異性引物0.2μmf3,0.2μmb3,1.6μmfip,1.6μmbip，8ubstdnapolymerase組成的檢測(cè)溶液。各組分的濃度表示其在檢測(cè)溶液中的終濃度。
實(shí)施列2大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌lamp引物的特異性試驗(yàn)
為驗(yàn)證大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌lamp引物的特異性，選擇了4個(gè)大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌、14個(gè)其它病原菌(1-4：phomopsislongicolla，5:diaportheactinidiae，6：diaporthemelonis，7：colletotrichumtruncatum，8:c.scovillei，9：c.spaethianum，10：fusariumoxysporum，11：f.equiseti，12:f.graminerum，13：f.solani，14：f.proliferatum，15：f.culmorum，16：phytophthorasojae，17:alternariatenussima，18：nigreosporasphaerica)的dna作為模版，取16.5μl實(shí)施列1所述的檢測(cè)溶液，加入2μl待檢測(cè)dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑。含有大豆擬莖點(diǎn)種腐的樣品(1-4號(hào))反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性。而其它病原菌為模版的反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，反應(yīng)結(jié)果為陰性，表示不存在大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌。該結(jié)果表示，利用大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌lamp引物及其反應(yīng)溶液，恒溫?cái)U(kuò)增后添加sybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑可以特異性的檢測(cè)出含有大豆擬莖點(diǎn)種腐病原菌的存在，且具有省時(shí)、省錢、省力、可操作性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施列3大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌lamp特異性引物的靈敏度試驗(yàn)
為驗(yàn)證大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌lamp特異性引物的靈敏度，將提取的大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌菌株dna進(jìn)行10倍遞度稀釋后(從1μg/μl到1fg/μl)，取16.5μl實(shí)施列1所述的檢測(cè)溶液，加入2μl系列稀釋的dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑進(jìn)行結(jié)果觀察，模版濃度較高時(shí)，發(fā)生lamp擴(kuò)增時(shí)，陽(yáng)性反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，在含量較低的模版中，反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，反應(yīng)結(jié)果為陰性。在25μl的反應(yīng)體系中，lamp體系所能檢測(cè)的最低靈敏度為100pg/μl。
實(shí)施列4感病大豆植株lamp檢測(cè)試驗(yàn)
取9株接種大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌7天后的大豆莖基部組織1-2cm，使用堿裂解法快速提取dna，每毫克組織加入10μl0.5mnaoh，充分研磨后轉(zhuǎn)移至1.5ml的ep管中，12000rpm離心5min，取2μl直接用于lamp反應(yīng)。取16.5μl實(shí)施列1所述的檢測(cè)溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑進(jìn)行結(jié)果觀察，接種大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌7天后的大豆莖基部組織的dna作為模版發(fā)生lamp擴(kuò)增，反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，而以健康植株提取的dna作為模版，反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，反應(yīng)結(jié)果為陰性。
seqidno.1
tgcgcctgatgctaacggaccgttttcggcctgcaggataaggatggcgatggttagtgcggtcaccgcttcctcccctctttctcagctacgcacgcgtcatactcgatccgccgcgacggtctgcgcgtgcagctactccgaccgaccgaccatcaaatctatcacgagtagtatgctaaggctggcgtgtaggacaaatcaccaccaaggagctcggcacagtcatgcggtcccttggtcaaaacccttccgagtccgagctgcaggacatgatcaacgaggtcgacgccgacaacaacggcaccattgacttccctggtgagtctagatcctcgtacactggatattc