檢測FBXW7基因突變的方法、寡核苷酸及其應用與流程

背景技術：

惡性腫瘤的發(fā)病是由多種外源性致癌物誘導和內(nèi)源性基因表達失控共同作用的結(jié)果，其中基因的異常表達包括多種癌基因的活化和/或多種抑癌基因的失活。fbxw7基因(f框/wd40域蛋白基因)又稱hcdc4，其表達的蛋白屬于f-box蛋白，是scf(skp1-cul1-fbox)泛素連接酶的靶蛋白識別組分，參與降解周期蛋白myc，notch1等，在人體細胞周期的進程、細胞的生長和分化中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其缺失能引起和/或加快癌細胞增殖，是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的抑癌基因。

fbxw7基因共有12個外顯子，在人類基因組中高度保守，其表達的蛋白有3個結(jié)構(gòu)域，包括f-box，wd40重復序列和d結(jié)構(gòu)域。其中n末端的wd40重復序列為底物結(jié)合域。fbxw7基因在癌癥中的整體突變率約為6％，而在急性t淋巴細胞白血病中的突變率高達31％，且43％的突變發(fā)生在兩個突變熱點：arg465和arg479，頻率約為29％和14％。fbxw7的突變將影響自身功能，進而對下游參與細胞周期的蛋白產(chǎn)生影響，使血液中的白細胞上升，導致疾病發(fā)生。akhoondi等發(fā)現(xiàn)fbxw7突變體可上調(diào)cycline的水平并且延長其半衰期。oneil等現(xiàn)fbxw7突變體和野生型共同形成的異二聚體雖然能和作為靶標的myc結(jié)合，但卻不能正常地使其降解。2013年，king等將fbxw7突變體轉(zhuǎn)入小鼠的白血病造血干細胞中，發(fā)現(xiàn)癌細胞大量擴增，說明該基因突變使得白血病干細胞更具侵染性。

目前，fbxw7突變對于預后的意義存在差異，主要原因是：不同的治療方案對預后有不同的影響；白血病的成因復雜，有其他的不良因素同時干擾等。但是檢測fbxw7的突變是否存在，對于白血病風險預測以及針對性制定治療方案無疑有積極意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供檢測fbxw7基因突變的寡核苷酸，采用pcr技術，可用于快速檢測急性t淋巴細胞白血病患者體內(nèi)的fbxw7基因外顯子突變情況。所述寡核苷酸包括至少一對擴增fbxw7基因外顯子的引物，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag；

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg；

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc；

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc；

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg；

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata；

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag；

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc；

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg；

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt；

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta；

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag；

fbxw7-7/8f:

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg；

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca；

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg；

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc；

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg；

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg；

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa；

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct；

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg；

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa。

進一步地，所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，fbxw7-1f：fbxw7-1r、fbxw7-2f：fbxw7-2r、fbxw7-3f：fbxw7-3r、fbxw7-4f：fbxw7-4r、fbxw7-5f：fbxw7-5r、fbxw7-6f：fbxw7-6r、fbxw7-7/8f：fbxw7-7/8r、fbxw7-9f：fbxw7-9r、fbxw7-10f：fbxw7-10r、fbxw7-11f：fbxw7-11r、fbxw7-12f：fbxw7-12r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，所述寡核苷酸在輔助檢測急性t淋巴細胞白血病中的應用。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測fbxw7基因突變的方法，包括以下步驟：

(1)抽提樣本中的基因組dna；

(2)利用至少一對擴增引物對(1)中的dna進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物；

(3)利用一對測序引物m13f和m13r對(2)中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增產(chǎn)物的堿基序列；

(4)將(3)中的堿基序列與fbxw7基因野生型參考序列進行比較，確定突變位點是否存在，其中，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag；

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg；

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc；

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc；

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg；

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata；

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag；

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc；

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg；；；

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt；

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta；

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag；

fbxw7-7/8f:

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg；

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca；

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg；

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc；

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg；

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg；

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa；

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct；

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg；

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa；

所示

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，fbxw7-1f：fbxw7-1r、fbxw7-2f：fbxw7-2r、fbxw7-3f：fbxw7-3r、fbxw7-4f：fbxw7-4r、fbxw7-5f：fbxw7-5r、fbxw7-6f：fbxw7-6r、fbxw7-7/8f：fbxw7-7/8r、fbxw7-9f：fbxw7-9r、fbxw7-10f：fbxw7-10r、fbxw7-11f：fbxw7-11r、fbxw7-12f：fbxw7-12r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，所述方法在輔助檢測急性t淋巴細胞白血病中的應用。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測fbxw7基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括檢測體系pcr擴增反應液、測序體系反應液，其中，檢測體系pcr擴增反應液包括至少一對擴增引物，所述測序體系反應液包括一對測序引物m13f和m13r，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag；

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg；

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc；

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc；

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg；

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata；

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag；

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc；

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg；

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt；

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta；

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag；

fbxw7-7/8f:

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg；

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca；

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg；

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc；

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg；

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg；

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa；

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct；

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg；

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa；

所述一對測序引物的堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，fbxw7-1f：fbxw7-1r、fbxw7-2f：fbxw7-2r、fbxw7-3f：fbxw7-3r、fbxw7-4f：fbxw7-4r、fbxw7-5f：fbxw7-5r、fbxw7-6f：fbxw7-6r、fbxw7-7/8f：fbxw7-7/8r、fbxw7-9f：fbxw7-9r、fbxw7-10f：fbxw7-10r、fbxw7-11f：fbxw7-11r、fbxw7-12f：fbxw7-12r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，所述檢測體系pcr擴增反應液還包括2×pcrbuffer、dntps和kodfxdnapolymerase。

進一步地，所述測序體系反應液還包括測序純化液、牛小腸堿性磷酸酶、edta、無水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

進一步地，所述測序純化液包括核酸外切酶i、牛小腸堿性磷酸酶。

進一步地，所述試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。

進一步地，所述試劑盒在輔助檢測急性t淋巴細胞白血病中的應用。

進一步地，引物序列fbxw7-1f和fbxw7-1r是擴增fbxw7基因第1號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-2f和fbxw7-2r是擴增fbxw7基因第2號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-3f和fbxw7-3r是擴增fbxw7基因第3號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-4f和fbxw7-4r是擴增fbxw7基因第4號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-5f和fbxw7-5r是擴增fbxw7基因第5號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-6f和fbxw7-6r是擴增fbxw7基因第6號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-7/8f和fbxw7-7/8r是擴增fbxw7基因第7和8號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-9f和fbxw7-9r是擴增fbxw7基因第9號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-10f和fbxw7-10r是擴增fbxw7基因第10號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-11f和fbxw7-11r是擴增fbxw7基因第11號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-12f和fbxw7-12r是擴增fbxw7基因第12號外顯子序列的引物。

有益效果：(1)本發(fā)明設計了擴增fbxw7基因全部12個外顯子序列的引物，通過加接頭，使所有11對引物的pcr產(chǎn)物均可以用一對測序引物進行測序，而現(xiàn)有的測序技術要對每種擴增產(chǎn)物設計特異性的測序引物，這就需要設計11條測序引物(單向測序)或22條測序引物(雙向測序)，因此，本發(fā)明提供的擴增引物既能將所述fbxw7全外顯子序列都擴增出來，也保證無論這些外顯子的何處位置發(fā)生突變，都不會出現(xiàn)漏檢的情況；(2)在設計引物時，通過讓fbxw7基因的第7和8號外顯子共用一對引物，讓fbxw7基因的第7和8號外顯子共用一對引物，降低擴增引物的數(shù)量，這也會降低擴增產(chǎn)物的數(shù)量，從而降低測序引物的數(shù)量，因而極大地降低檢測成本；(3)本發(fā)明采用pcr技術，通過調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳；(4)常用的熒光定量pcr法要針對fbxw7基因全部12個外顯子可能發(fā)生突變的眾多突變位點設計多個探針，因此，在12個外顯子中，假設每個外顯子存在3個突變位點，則要設計36個探針，檢測成本顯著增加，而本發(fā)明通過給設計的擴增引物添加接頭，僅需使用一對測序引物就可檢測這36個突變位點以及還未被發(fā)現(xiàn)的其他突變類型，從而使得檢測成本顯著降低。

附圖說明

圖1為fbxw7基因在染色體上的定位圖。

圖2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12為fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r的電泳圖。

圖13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23分別為樣本1的fbxw7基因第1、2、3、4、5、6、7/8、9、10、11、12號外顯子野生型測序截圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實施例1

一種檢測fbxw7基因多態(tài)突變位點的寡核苷酸，該寡核苷酸是針對fbxw7基因至少一個外顯子所設計的，包括至少一對擴增引物，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag

fbxw7-7/8f:tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa

所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

一種檢測fbxw7基因突變的試劑盒，包括檢測體系pcr擴增反應液和測序體系反應液，其中，

檢測體系pcr擴增反應液包括：2×pcrbuffer(10.0μl)；dntps(2mm)；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；fbxw7基因12個外顯子的上、下游引物fbxw7-1f(10μm)、fbxw7-1r(10μm)、fbxw7-2f(10μm)、fbxw7-2r(10μm)、fbxw7-3f(10μm)、fbxw7-3r(10μm)、fbxw7-4f(10μm)、fbxw7-4r(10μm)、fbxw7-5f(10μm)、fbxw7-5r(10μm)、fbxw7-6f(10μm)、fbxw7-6r(10μm)、fbxw7-7/8f(10μm)、fbxw7-7/8r(10μm)、fbxw7-9f(10μm)、fbxw7-9r(10μm)、fbxw7-10f(10μm)、fbxw7-10r(10μm)、fbxw7-11f(10μm)、fbxw7-11r(10μm)、fbxw7-12f(10μm)、fbxw7-12r(10μm)。

測序體系反應液包括：測序純化液(核酸外切酶i:0.6u，牛小腸堿性磷酸酶:1.2u)；edta(125mm)；無水乙醇；75％乙醇；hidi(高度去離子甲酰胺)；一對測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)；bigdyeterminatorv3.1(購買自美國appliedbiosystems公司)。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括血液dna抽提試劑。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。陽性對照品為含有人fbxw7基因外顯子dna的溶液，嚴禁反復凍融。陰性對照品為ddh2o。空白對照品為2μl生理鹽水或不加任何物質(zhì)。

實施例2血液樣本dna抽提

血液樣本dna抽提(根據(jù)天根生物血液/細胞/組織基因dna提取試劑盒說明書)：抽提人血液樣本dna，具體抽提方法如下：

(1)抽取300μl血液加入900μl紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。12000rpm離心1min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200μl緩沖液ga，振蕩至徹底混勻；

(2)加入20μl蛋白酶k溶液，混勻；

(3)加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(4)加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中；

(6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12000rpm離心30秒，倒掉廢液；

(9)將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

(10)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te，室溫放置2～5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

實施例3樣本dna擴增

按照實施例2抽提的血液樣本dna，然后利用實施例1中的擴增引物擴增人fbxw7基因外顯子，獲得擴增產(chǎn)物。擴增時在常規(guī)pcr儀上進行，可用儀器包括abiveriti(美國appliedbiosystems公司)等。詳情如下所示：

(i)按樣品數(shù)n(樣品數(shù)＝待測樣本數(shù)+陰性對照1個+陽性對照1個+空白對照1個)取測體系pcr擴增反應液，每管19μl分裝于反應管中；

(ii)將上述處理好的待測樣本和陰性對照品、陽性對照品各取1μl分別加入反應管中，混勻，低速離心數(shù)秒，進行pcr擴增，獲得擴增產(chǎn)物。測體系pcr擴增反應液配制方法如表1所示。pcr擴增擴增反應條件如表2所示。每對擴增引物的詳細信息如表3所示。

表1.測體系pcr擴增反應液配制

注：表中的primerf和primerr選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r。

表2.pcr擴增擴增反應條件

表3.每對擴增引物信息

實施例4sanger測序

取9μl實施例3中的擴增產(chǎn)物和2μl實施例1中的測序純化液按照表4中所述的程序進行純化，從而獲得純化產(chǎn)物。

表4純化程序

將1μl所獲得的純化產(chǎn)物分別與實施例1中的測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)按照表5中的體系進行混合，然后按照表6中的測序反應程序進行測序。

表5

表6.測序反應程序

沉淀環(huán)節(jié)：

向完成測序反應的產(chǎn)物中加入2μl125mm的edta，靜置5min；加入15μl無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50μl70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μlhidi后進行變性試驗。變性試驗步驟為：95℃，5min；接著在-30℃2min，然后在4℃保存。

變性程序結(jié)束后，上測序儀(abi3730)測序。

結(jié)果判斷：

分別將測序結(jié)果與fbxw7野生型參考序列(genbankaccn：nc_000004.12)進行比對，根據(jù)實際突變情況對結(jié)果進行報告。

實施例5臨床樣本檢測

取16例臨床血液樣本(樣本編號為1～16)先后按照實施例1、實施例2、實施例3和實施例4，配制試劑、抽提樣本dna、擴增(獲得擴增產(chǎn)物)和測序。每份樣本往檢測體系pcr反應液中加入1μl。

利用所獲得的擴增產(chǎn)物，開展dna電泳，電泳條件為1.5％瓊脂糖凝膠電泳，110v，25min，凝膠成像系統(tǒng)觀察。電泳結(jié)果如圖2～12所示。

圖2～12為這16例血液樣本以fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r等11對擴增引物擴增后所得擴增產(chǎn)物的電泳圖譜，m為markerdl2000，1～16為送檢的血液樣本編號1～16號。這11對引物擴增的片段長度分別為411bp、907bp、639bp、410bp、312bp、533bp、1361bp、376bp、340bp、368bp、970bp，通過電泳圖的分析表明這11對引物擴增有效，且條帶單一。

在這16例樣品中，以樣本1為例進行詳細說明。樣本1的測序結(jié)果如圖13～23所示。

圖13顯示是樣本1的fbxw7基因第1號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的1號外顯子未發(fā)生突變。

圖14顯示是樣本1的fbxw7基因第2號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的2號外顯子未發(fā)生突變。

圖15顯示是樣本1的fbxw7基因第3號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的3號外顯子未發(fā)生突變。

圖16顯示是樣本1的fbxw7基因第4號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的4號外顯子未發(fā)生突變。

圖17顯示是樣本1的fbxw7基因第5號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的5號外顯子未發(fā)生突變。

圖18顯示是樣本1的fbxw7基因第6號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的6號外顯子未發(fā)生突變。

圖19顯示是樣本1的fbxw7基因第7/8號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的7、8號外顯子未發(fā)生突變。

圖20顯示是樣本1的fbxw7基因第9號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的9號外顯子未發(fā)生突變。

圖21顯示是樣本1的fbxw7基因第10號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的10號外顯子未發(fā)生突變。

圖22顯示是樣本1的fbxw7基因第11號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的11號外顯子未發(fā)生突變。

圖23顯示是樣本1的fbxw7基因第12號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的12號外顯子未發(fā)生突變。

從檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明所述引物已經(jīng)把fbxw7基因共12個外顯子序列包括在內(nèi)了，能夠擴展出fbxw7基因全部12個外顯子，并且測序結(jié)果完全準確。由檢測結(jié)果可知，樣本1的12個外顯子均為野生型。另外，對fbxw7基因外顯子突變陽性樣本的檢測也表明本發(fā)明的寡核苷酸、方法和試劑盒能夠檢測出fbxw7基因外顯子突變的突變情況。

sequencelisting

<110>武漢艾迪康醫(yī)學檢驗所有限公司

<120>檢測fbxw7基因突變的方法、寡核苷酸及其應用

<130>

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag36

<210>2

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg34

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc40

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc36

<210>5

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg41

<210>6

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata39

<210>7

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag40

<210>8

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc37

<210>9

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg40

<210>10

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt39

<210>11

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta41

<210>12

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag39

<210>13

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg41

<210>14

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca39

<210>15

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg40

<210>16

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc38

<210>17

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg40

<210>18

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg38

<210>19

<211>40

<212>dna

<213>人共序列

<400>19

tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa40

<210>20

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct38

<210>21

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg41

<210>22

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa39

<210>23

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

tgtaaaacgacggccagt18

<210>24

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

aacagctatgaccatg16