一種棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縋CR引物、探針、試劑盒和檢測(cè)方法與流程

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縫cr引物、探針、試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
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近年來在醫(yī)院臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)非哺乳期乳腺炎發(fā)病率逐漸增高，甚至超過哺乳期乳腺炎。肉芽腫性乳腺炎是一種重要的非哺乳期乳腺炎癥疾病，臨床表現(xiàn)為乳腺腫塊、膿腫竇道或潰瘍，病變遷延不愈，反復(fù)發(fā)作，容易誤診誤治。肉芽腫性乳腺炎病因復(fù)雜，涉及局部創(chuàng)傷、自身免疫、細(xì)菌感染等因素。近年來國內(nèi)、外越來越多的研究表明棒狀桿菌屬細(xì)菌感染在肉芽腫性乳腺炎病變發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。最近，本團(tuán)隊(duì)通過高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌宏基因組測(cè)序，明確了棒狀桿菌是我國肉芽腫性乳腺炎發(fā)病的主要致病菌。

棒狀桿菌為一種革蘭氏染色陽性桿菌，因菌體的一端或兩端膨大呈棒狀而得名。胞壁多糖主要是阿拉伯糖和半乳糖。與分枝桿菌屬和放線菌屬相似，有交叉反應(yīng)，其歸類于放線菌目棒狀桿菌科。近年研究顯示，該菌屬的多數(shù)菌種可作為條件致病菌在宿主抵抗力降低時(shí)引起各類感染?？耸习魻顥U菌是一種革蘭陽性短小棒狀桿菌。在普通培養(yǎng)基上難以生長，而在含tween80的血平板中生長良好。由于其親脂生長的特點(diǎn)，又因女性乳腺組織中脂肪含量較高，故與臨床上女性感染性乳腺炎有關(guān)。該菌不含分枝菌酸、無芽孢，過氧化氫酶和七葉甙反應(yīng)陽性，對(duì)利福平和萬古霉素敏感。

分離培養(yǎng)法是臨床上最常用的細(xì)菌鑒定技術(shù)，一般將分離物無菌劃盤接種于5％綿羊血瓊脂平板，于35℃培養(yǎng)24-96小時(shí)。根據(jù)不同的培養(yǎng)特性，細(xì)菌/菌落的形態(tài)、革蘭氏染色情況及生化特性(如借助美國remel公司的rapidcbplussystem)等進(jìn)行鑒別確認(rèn)。由于棒狀桿菌屬細(xì)菌及克氏棒狀桿菌屬于難培養(yǎng)細(xì)菌，存在耗時(shí)長，準(zhǔn)確性差，陽性率低的問題，無法滿足臨床診治的需求。

熒光定量pcr是一種核酸分析技術(shù)，因其具有操作簡(jiǎn)單、快捷方便，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前使用最廣泛。設(shè)計(jì)特異性引物和探針可對(duì)靶標(biāo)序列雙重識(shí)別，特異性好、假陽性低。此外，該技術(shù)綜合了pcr擴(kuò)增技術(shù)、熒光標(biāo)記及信號(hào)獲取技術(shù)，具有很高的靈敏度，可檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝。通過熒光信號(hào)的采集可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量，線性關(guān)系好、線性范圍寬。由于擴(kuò)增和檢測(cè)在同一管內(nèi)完成，無需開蓋，不存在污染的問題。因此通過熒光定量pcr來檢測(cè)棒狀桿菌，具有準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，將為肉芽腫性乳腺炎的有效防治提供重要的技術(shù)支撐手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)引物、探針、試劑盒和檢測(cè)方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：為了鑒別棒狀桿菌屬細(xì)菌，針對(duì)靶基因23srrna基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針；為了鑒別克氏棒狀桿菌種，針對(duì)靶基因16srrna基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針。

通過查找美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館生物信息技術(shù)中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(ncbi)網(wǎng)站上23srrna和16srrna基因的序列，并結(jié)合文獻(xiàn)，分別設(shè)計(jì)棒狀桿菌屬細(xì)菌及克氏棒狀桿菌的特異性引物和探針。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)引物如下所示：

針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌：23srrna-f：5’-tgatagctggttctccccgaa-3’(其核苷酸序列如seqidno.1所示)，23srrna-r：5’-cgatctgggctgtttccct-3’(其核苷酸序列如seqidno.2所示)；

針對(duì)克氏棒狀桿菌：16srrna-f：5’-agaaccttacctgggcttga-3’(其核苷酸序列如seqidno.3所示)，16srrna-r：5’-cgctcgttgcgggactta-3’(其核苷酸序列如seqidno.4所示)。

用上述檢測(cè)引物對(duì)克氏棒狀桿菌的基因組dna進(jìn)行多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增，能夠同時(shí)擴(kuò)增出上述2個(gè)基因序列的片段。設(shè)計(jì)這類引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的，優(yōu)選的，特異性引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解的。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)探針，其特征在于，所述的檢測(cè)探針如下所示：

針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌：5’-gtcccgctmaaccawccagt-3’(其核苷酸序列如seqidno.5所示)，m代表a或c堿基，w代表a或t堿基；

針對(duì)克氏棒狀桿菌：5’-actggatgcggccaga-3’(其核苷酸序列如seqidno.6所示)；

探針的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，兩探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。

優(yōu)選，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)為vic、hex或fam，所述的熒光淬滅基團(tuán)為bhq1或mgb。

所設(shè)計(jì)的特異性探針可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解的。

所述的檢測(cè)引物或檢測(cè)探針，用于taqman熒光定量pcr技術(shù)檢測(cè)棒狀桿菌屬細(xì)菌及克氏棒狀桿菌。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括2×prmixextaq、上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：提取樣品的基因組dna作為模板，使用上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針進(jìn)行多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)探針標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)，讀取并記錄樣品的pcr擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)ct，根據(jù)各樣品的ct值，按照建立的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷樣品中是否含有棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌。

所述的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選為：20μl；模板dna1μl，2×prmixextaq10μl，終濃度均為200nmol/l的上述的各檢測(cè)引物，終濃度均為400nmol/l的上述的各檢測(cè)探針，余量為ddh2o。

所述的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增程序優(yōu)選為：60℃1分鐘并收集熒光信號(hào)，95℃5分鐘；95℃15秒，56℃20秒，65℃50秒并收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)；最后60℃1分鐘并收集熒光信號(hào)。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針在檢測(cè)棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌中的應(yīng)用。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：如果針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌探針的熒光報(bào)告基團(tuán)通道的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增曲線曲線上升且ct值小于40，則判斷為棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性，如果40<ct<42，判斷為可疑，可以加大模板量，重復(fù)擴(kuò)增，如果得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，則判斷為棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性，否則為陰性，如果無ct值或ct>40，則判斷為陰性。如果針對(duì)克氏棒狀桿菌探針的熒光報(bào)告基團(tuán)通道的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增曲線曲線上升且ct值小于40，則判斷為克氏棒狀桿菌陽性，如果40<ct<42，判斷為可疑，可以加大模板量，重復(fù)擴(kuò)增，如果得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，則判斷為克氏棒狀桿菌陽性，否則為陰性，如果無ct值或ct>40，則判斷為陰性。

如果只有棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性，克氏棒狀桿菌陰性，則表明樣品中含有棒狀桿菌屬細(xì)菌，但不是克氏棒狀桿菌。如果棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌均為陽性，則表明樣品中含有棒狀桿菌屬細(xì)菌，至少一種棒狀桿菌屬細(xì)菌為克氏棒狀桿菌。如果棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌均為陰性，則表明樣品中不含有棒狀桿菌屬細(xì)菌。

本發(fā)明針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌23srrna基因及克氏棒狀桿菌16srrna基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，利用多重?zé)晒舛縫cr，鑒定生物樣本中是否存在棒狀桿菌屬細(xì)菌及克氏棒狀桿菌感染，對(duì)臨床的針對(duì)性選擇抗生素使用具有重要指導(dǎo)作用，合理的抗生素使用可有效縮短肉芽腫性乳腺炎的病程、避免手術(shù)切除乳腺組織，極大減輕患者生理和心理創(chuàng)傷，對(duì)肉芽腫性乳腺炎的臨床診治提供病因?qū)W依據(jù)。

本發(fā)明的有益效果是：(1)陽性檢測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)100％，重復(fù)性好，沒有假陽性；(2)通量高，一次可以對(duì)96個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)；(3)靈敏度高，每次檢測(cè)的dna用量僅需20ng；(4)檢測(cè)所需時(shí)間短，從樣本dna提取到檢測(cè)結(jié)果出來最快只需要4個(gè)小時(shí)；(5)價(jià)格優(yōu)惠。

附圖說明：

圖1是克氏棒狀桿菌和棒狀桿菌屬細(xì)菌雙陽性的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增曲線圖。

圖2是克氏棒狀桿菌陰性和棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增曲線圖。

圖3是陰性對(duì)照的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增曲線圖。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

1、基因組dna提?。?/p>

1.1試劑、耗材和儀器

1.1.1試劑和耗材：基因組dna提取試劑盒(tianampgenomicdnakit,dp304-02；天根公司)含：緩沖液ga；裂解液gb；緩沖液gd；漂洗液pw；洗脫緩沖液te；蛋白酶k(20mg/ml)；吸附住；收集管(2ml)；1.5ml無菌收集管，無水乙醇。

1.1.2儀器：eppendorf5430r離心機(jī)，恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環(huán)宇科技儀器)，振蕩儀(大龍興創(chuàng)公司)，nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)(美國thermo公司)。

1.2待測(cè)人乳房膿液總dna模板的準(zhǔn)備

1.2.1用一次性拭子或一次性注射器采取患者乳房中膿液，使用天根公司的血液基因組dna提取試劑盒(主要成分為：緩沖液ga；裂解液gb；緩沖液gd；漂洗液pw；洗脫緩沖液te；蛋白酶k；吸附柱cb3；收集管；1.5ml無菌收集管)提取人乳房膿液總dna為待測(cè)dna模板，具體步驟如下：

①將200μl膿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，加入20μl蛋白酶k溶液，混勻；

②加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃恒溫加熱10分鐘，裂解細(xì)胞；

③加200μl無水乙醇，充分混勻15秒，簡(jiǎn)短離心，去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

④將所得混合溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱cb3中，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管；

⑤向吸附柱cb3內(nèi)加500μl已經(jīng)加入適量無水乙醇的緩沖液gd，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管；

⑥向吸附柱cb3內(nèi)加600μl已經(jīng)加入適量無水乙醇的漂洗液pw，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管；

⑦重復(fù)⑥；

⑧繼續(xù)12000rpm離心2分鐘，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管，徹底晾干吸附材料中的漂洗液；

⑨將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管，向吸附膜中間懸空滴加50μl的洗脫緩沖液te，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將dna溶液收集到離心管中。

1.2.2取2μl的dna溶液，采用nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)(美國thermo公司)對(duì)提取的dna濃度質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，將提取的基因組dna模板稀釋到20ng/μl。

2、熒光定量pcr：

熒光定量pcr反應(yīng)包括pcr體系配制，擴(kuò)增循環(huán)及信號(hào)收集3個(gè)步驟。

2.1儀器和耗材：熒光定量pcr儀(美國abi公司，appliedbiosystems)，96孔板(香港帝恩公司)，粘性封口膜(美國thermo公司)，prmixextaq(probeqpcr)(大連takara公司)。

2.2序列查找和引物探針設(shè)計(jì)：

通過查找美國國立衛(wèi)生研究院國立醫(yī)學(xué)圖書館生物信息技術(shù)中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(ncbi)網(wǎng)站上棒狀桿菌屬細(xì)菌23srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.8所示)和克氏棒狀桿菌16srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.7所示)的序列，分別設(shè)計(jì)棒狀桿菌屬細(xì)菌及克氏棒狀桿菌的引物和探針。

針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針：

檢測(cè)引物：23srrna-f：5’-tgatagctggttctccccgaa-3’(其核苷酸序列如seqidno.1所示)，23srrna-r：5’-cgatctgggctgtttccct-3’(其核苷酸序列如seqidno.2所示)；檢測(cè)探針：5’-vic-gtcccgctmaaccawccagt-bhq1-3’(其核苷酸序列如seqidno.5所示)，m代表a或c堿基，w代表a或t堿基。

針對(duì)克氏棒狀桿菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針：

檢測(cè)引物：16srrna-f：5’-agaaccttacctgggcttga-3’(其核苷酸序列如seqidno.3所示)，16srrna-r：5’-cgctcgttgcgggactta-3’(其核苷酸序列如seqidno.4所示)；檢測(cè)探針：5’-fam-actggatgcggccaga-mgb-3’(其核苷酸序列如seqidno.6所示)。

2.3熒光定量pcr反應(yīng)體系的配制：

2.3.1pcr反應(yīng)體系配制，總體積20μl，2×prmixextaq(probeqpcr)(cat.rr390a，大連寶生公司)10μl，基因組dna1μl(總量20ng)，終濃度均為200nmol/l的引物23srrna-f/r和16srrna-f/r(四條引物)，終濃度均為400nmol/l的步驟2.2的探針(兩條探針)，補(bǔ)水至20μl；將配制好的反應(yīng)體系加入到96孔板中；

2.3.2將一張新的粘性封口膜蓋住96孔板，用軟膠板從中間向四周輕刮封口膜，確保膜封蓋住每一個(gè)pcr反應(yīng)孔；

2.3.3將密封好的96孔板置于離心機(jī)上3000rpm離心30s，使液體收集于反應(yīng)孔底部。

2.4pcr擴(kuò)增和信號(hào)收集

2.4.1pcr儀為美國abi公司7500fast。將96孔板放置在其中，打開7500softwarev2.3軟件，設(shè)置實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)類型、探針信息以及pcr反應(yīng)條件等，其擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃1分鐘并收集熒光信號(hào)；95℃5min；95℃15s，56℃20s，65℃50s并收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)；最后60℃1分鐘并收集熒光信號(hào)。

2.4.2點(diǎn)擊軟件上的run按鈕，開始pcr擴(kuò)增。taqman探針法的原理是使用5’端帶有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端帶有熒光淬滅基團(tuán)的taqman探針進(jìn)行熒光檢測(cè)的方法。當(dāng)探針完整時(shí)，5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)受到3’端熒光淬滅基團(tuán)的制約而不能發(fā)出熒光。當(dāng)taqman探針被分解后，5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)便會(huì)游離出來，發(fā)出熒光。pcr反應(yīng)過程中，taqman探針在退火時(shí)與模板dna序列結(jié)合，而在延伸時(shí)，taqdna聚合酶的5’→3’外切酶活性會(huì)水解與模板結(jié)合的taqman探針，從而發(fā)出熒光。

2.5結(jié)果分析：

7500softwarev2.3軟件展示的多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增曲線圖(如圖1所示)，表示了熒光信號(hào)強(qiáng)度與pcr擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系。fam曲線為fam探針信號(hào)曲線，該曲線上升且樣品ct值小于40表明膿液中含有克氏棒狀桿菌；vic曲線為vic探針信號(hào)曲線，該曲線上升且樣品ct值小于40表明膿液中含有棒狀桿菌屬細(xì)菌；rox曲線為參比染料rox信號(hào)，作用是減小人為誤差的影響，起校正作用。由于克氏棒狀桿菌隸屬于棒狀桿菌屬，因此若fam曲線上升，則vic曲線必然上升。圖1表示克氏棒狀桿菌陽性，棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性；圖2表示克氏棒狀菌陰性，棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性，圖3表示陰性對(duì)照。

3、棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌的靈敏度

3.1棒狀桿菌屬細(xì)菌的靈敏度：

3.1.1將谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032的23srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.8所示)克隆至pmd8-t載體上，獲得棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性質(zhì)粒。

3.1.2取1×10⁷copies/ml的棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得濃度分別為1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml、1×10²copies/ml和50copies/ml的棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性質(zhì)粒樣品dna作為模板dna，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，共18個(gè)樣本。

3.1.3以針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針為引物和探針，按照實(shí)施例1步驟2的熒光定量pcr反應(yīng)體系和熒光定量pcr擴(kuò)增程序進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增。1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml和1×10²copies/ml的擴(kuò)增反應(yīng)曲線上升且ct值都小于40，判斷為棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性。上述結(jié)果表明：本發(fā)明的棒狀桿菌屬細(xì)菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針的檢測(cè)下限為1×10²copies/ml。

3.2克氏棒狀桿菌的靈敏度：

3.2.1將克氏棒狀桿菌(corynebacteriumkroppenstedtii)dsm44385的16srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.7所示)克隆至pmd8-t載體上，獲得克氏棒狀桿菌陽性質(zhì)粒。

3.2.2取1×10⁷copies/ml的克氏棒狀桿菌陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得濃度分別為1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml、1×10²copies/ml、50copies/ml的克氏棒狀桿菌陽性質(zhì)粒樣品dna作為模板dna，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，共18個(gè)樣本。

3.2.3以針對(duì)克氏棒狀桿菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針為引物和探針，按照實(shí)施例1步驟2的熒光定量pcr反應(yīng)體系和熒光定量pcr擴(kuò)增程序進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增。1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml和1×10²copies/ml的擴(kuò)增反應(yīng)曲線上升，且ct值都小于40，判斷為克氏棒狀桿菌陽性。上述結(jié)果表明：本發(fā)明的克氏棒狀桿菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針的檢測(cè)下限為1×10²copies/ml。

4、棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌的特異性

4.1棒狀桿菌屬細(xì)菌的特異性

分別以白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結(jié)膜干燥棒狀桿菌atcc373、克氏棒狀桿菌dsm44385、牛棒狀桿菌atcc7715、鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987的基因組dna為模板，以實(shí)施例1步驟2的針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針作為引物和探針，按照實(shí)施例1步驟2的熒光定量pcr反應(yīng)體系和熒光定量pcr擴(kuò)增程序進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明，白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結(jié)膜干燥棒狀桿菌atcc373、克氏棒狀桿菌dsm44385和牛棒狀桿菌atcc7715均為棒狀桿菌屬細(xì)菌陽性；鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987均為棒狀桿菌屬細(xì)菌陰性。上述結(jié)果表明：本發(fā)明的針對(duì)棒狀桿菌屬細(xì)菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針的特異性高，與分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬和放線菌屬無交叉反應(yīng)。

4.2克氏棒狀桿菌的特異性

分別以白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結(jié)膜干燥棒狀桿菌atcc373、克氏棒狀桿菌dsm44385、牛棒狀桿菌atcc7715、鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987的基因組dna為模板，以實(shí)施例1步驟2的針對(duì)克氏棒狀桿菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針作為引物和探針，按照實(shí)施例1步驟2的熒光定量pcr反應(yīng)體系和熒光定量pcr擴(kuò)增程序進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明，白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結(jié)膜干燥棒狀桿菌atcc373和牛棒狀桿菌atcc7715均為克氏棒狀桿菌陰性；克氏棒狀桿菌dsm44385為克氏棒狀桿菌陽性；鳥分枝桿菌亞種副結(jié)核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987均為克氏棒狀桿菌陰性。上述結(jié)果表明：本發(fā)明的針對(duì)克氏棒狀桿菌的檢測(cè)引物和檢測(cè)探針的特異性高，與分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬和放線菌屬無交叉反應(yīng)。

對(duì)于提取人膿液總dna時(shí)需要膿液的量，本發(fā)明沒有特別的限制，若膿液很黏稠，則取黃豆粒大小的膿液然后加溶液ga補(bǔ)足至200μl即可，若膿液很少，則用適量無菌1×pbs溶液沖洗拭子，取200μl即可。

由于本發(fā)明使用的檢測(cè)方法可以快速檢測(cè)樣本dna中的克氏棒狀桿菌和棒狀桿菌屬細(xì)菌。

棒狀桿菌屬細(xì)菌及克氏棒狀桿菌檢測(cè)的意義在于如果確診為棒狀桿菌屬細(xì)菌或克氏棒狀桿菌感染則對(duì)臨床的針對(duì)性選擇抗生素使用具有重要指導(dǎo)作用。合理的抗生素使用可有效縮短肉芽腫性乳腺炎的病程、避免手術(shù)切除乳腺組織，極大減輕患者生理和心里創(chuàng)傷。

序列表

<110>廣東省婦幼保健院

<120>一種棒狀桿菌屬細(xì)菌和克氏棒狀桿菌多重?zé)晒舛縫cr引物、探針、試劑盒和檢測(cè)方法

<160>8

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>棒狀桿菌屬細(xì)菌

<400>1

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<210>2

<211>19

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<213>棒狀桿菌屬細(xì)菌

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<210>3

<211>20

<212>dna

<213>克氏棒狀桿菌

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<210>4

<211>18

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<213>克氏棒狀桿菌

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<213>棒狀桿菌屬細(xì)菌

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gtcccgctmaaccawccagt20

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<211>16

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<213>克氏棒狀桿菌

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<213>克氏棒狀桿菌（corynebacteriumkroppenstedtii）dsm44385

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<211>3087

<212>dna

<213>谷氨酸棒狀桿菌（corynebacteriumglutamicum）atcc13032

<400>8

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