本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地，本發(fā)明涉及一株改善肝功能的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum，l.plantarum)zy001及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：新疆喀什地區(qū)具有優(yōu)越的草資源條件和種植業(yè)豐富的秸稈資源，擁有驢品種、數(shù)量資源優(yōu)勢，為驢產(chǎn)業(yè)發(fā)展創(chuàng)造了得天獨厚的條件。2008年，新疆驢被列為國家級畜禽遺傳資源保護品種。驢奶作為驢養(yǎng)殖業(yè)的主要副產(chǎn)品之一，不僅具有較高的營養(yǎng)價值，而且具有較廣泛的藥用價值。其它奶源相比，驢奶是一種低脂肪、低膽固醇、高鈣、富硒、美容、抗衰老的天然乳品，驢奶中各營養(yǎng)成分的比例最為接近人乳。驢奶中含有大量的表皮細胞生長因子(egf)，egf能增強人體的免疫力、抵抗力；可以促進上皮細胞營養(yǎng)代謝，保護皮膚及預防皮膚由于各種原因?qū)е碌膿p失，有促進皮下膠原細胞再生功能。國內(nèi)外臨床研究表明，益生乳酸菌可逆轉(zhuǎn)腸內(nèi)菌群失衡，當腸道粘膜組織受損嚴重，增加富含修復腸上皮細胞的特殊營養(yǎng)物質(zhì)，如多糖類益生元，藥食同源功能組分等，對恢復腸道功能有確切的增益作用，可減少腸源性感染和器官功能衰竭的發(fā)生率，是扭轉(zhuǎn)疾病急性轉(zhuǎn)危的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而降低病死率；同時可減少抗生素的使用與住院時間，降低醫(yī)療費用，微生態(tài)營養(yǎng)治療已為疾病治療打開一扇新窗口。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中，在食品、青貯飼料及醫(yī)療保健等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。該菌株屬于同型發(fā)酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、l-山梨糖、乳糖、纖維二糖、木糖、蜜二糖、果糖、核糖、葡萄糖酸鈉產(chǎn)酸，但發(fā)酵葡萄糖和葡萄糖酸鈉均不產(chǎn)氣。利用該菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸處理乳清中乳糖轉(zhuǎn)化時，具有其他菌種無法比擬的優(yōu)越性，它既可以高轉(zhuǎn)化率地利用乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，又可以利用乳清中殘留蛋白質(zhì)。本發(fā)明的特色是：1、菌種來源于新疆喀什地區(qū)，從新疆土法驢酸奶中分離得到的乳酸菌；2、植物乳桿菌作為人體腸道中的益生菌群，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡，提高機體免疫力和改善肝功能等多種功能；3、cn104770469a提供的產(chǎn)品方案為以純驢奶或加入其他不含酪蛋白的天然產(chǎn)物提取物水溶液的驢奶為原料發(fā)酵生產(chǎn)酸奶制品，其中由于驢奶酪蛋白含量低的原因不能實現(xiàn)酸奶的制備，可歸為乳酸飲料的一種。本發(fā)明的酸奶制備過程是以植物乳桿菌或植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以1～3∶1～2∶1配比配制發(fā)酵種子，接種至驢奶∶牛奶＝2～4∶8～6的混合乳原料中，發(fā)酵獲得凝乳型驢奶發(fā)酵乳產(chǎn)品。技術(shù)實現(xiàn)要素：[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一株改善肝功能的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum，l.plantarum)zy001。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的植物乳桿菌zy001在發(fā)酵乳中的應(yīng)用。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一株植物乳桿菌zy001，該菌株已于2016年09月02日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號分別為cgmcc13505。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的乳類發(fā)酵制品是發(fā)酵乳。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，植物乳桿菌zy001及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用制備步驟如下：(1)從新疆土法驢酸奶中分離得到乳酸菌zy001，經(jīng)鑒定是植物乳桿菌，即植物乳桿菌zy001；(2)以驢奶和牛奶混合乳為原料，接種植物乳桿菌zy001發(fā)酵獲得單菌驢奶發(fā)酵乳；(3)以單菌驢奶發(fā)酵乳灌胃酒精肝損傷sd大鼠，測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)含量，確定植物乳桿菌zy001改善肝功能的功效；(4)將植物乳桿菌zy001、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以1～3∶1～2∶1配比配制發(fā)酵種子，接種至驢奶∶牛奶＝2～4∶8～6的原料中，發(fā)酵獲得驢奶發(fā)酵乳產(chǎn)品。步驟(2)中所述的發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵終點為ph4.0，即凝乳時間；步驟(3)中所述動物模型每組10只，分別為空白組、生理鹽水對照組、植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳實驗組及混合乳組；給予方式為灌胃；以自動血液生化分析儀測定生化指標血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)的活性。本發(fā)明方案的實施，至少具有以下優(yōu)勢：根據(jù)本發(fā)明方法，發(fā)酵菌種分離于肝病發(fā)病率較低的新疆喀什地區(qū)的土菌發(fā)酵驢奶，經(jīng)動物實驗證實，該菌具有一定的改善肝功能功效。本發(fā)明的應(yīng)用主原料之一為驢奶，驢奶具有增強免疫力，美容、抗衰老的功效，經(jīng)植物乳桿菌zy001發(fā)酵后，更易被人體吸收、代謝，發(fā)酵產(chǎn)品具備驢奶和植物乳桿菌zy001的雙重功效。與cn106190930a不同的是本發(fā)明提供的菌種為自行分離的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的菌種，已進行專利保藏；與cn104770469a相比，本發(fā)明提供的產(chǎn)品為真正意義上的發(fā)酵乳品，呈凝乳狀。具體實施方式下面將結(jié)合具體實施例來進一步對本發(fā)明作詳細描述，以使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚。以下實施例僅用于舉例說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實施例1植物乳桿菌zy001是從新疆牧民家庭自然發(fā)酵酸驢奶中分離、篩選出的一株具有優(yōu)良發(fā)酵特性的植物乳桿菌。將zy001劃線接種至mrs瓊脂培養(yǎng)基，42℃培養(yǎng)24h，在該條件下進行連續(xù)傳代培養(yǎng)25代，未見顯著性變異。挑取zy001菌落，畫線接種于mrs液體培養(yǎng)基上，在溫度37℃與厭氧的條件下培養(yǎng)48h；待菌落形成后，以1％的接種量接種mrs液體培養(yǎng)基，37℃條件下擴大培養(yǎng)24h；再次畫線于mrs瓊脂培養(yǎng)基上，確認其為純培養(yǎng)物后穿刺于mrs半固體培養(yǎng)基上，4℃下保存。觀察記錄純培養(yǎng)物的菌落形態(tài)、革蘭氏染色細胞形態(tài)特征，并進行常規(guī)的接觸酶和氧化酶實驗。將革蘭氏陽性、接觸酶和氧化酶試驗陰性和細胞形態(tài)呈桿狀的菌株暫時命名為乳桿菌。該菌株在mrs培養(yǎng)基上形成淺黃色的圓形菌落凸起，表面光滑，細密，在顯微鏡下觀測的細胞多為細長桿狀。本發(fā)明使用的mrs瓊脂培養(yǎng)基由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸合硫酸鎂、20g葡萄糖、1ml吐溫80、5g蘭水合乙酸納、2g三水合磷酸氫二鉀、0.58g七水合硫酸鎂、0.25g一水合硫酸錳、6g瓊脂與1000ml蒸餾水組成，其ph6.2-6.6。本發(fā)明使用的mrs液體培養(yǎng)基是由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸氫二胺、20g葡萄糖、1ml吐溫80、5g三水合乙酸納、2g三水合磷酸氫二鉀、0.58g七水合硫酸鎂、0.25g一水合硫酸錳與1000ml蒸餾水組成，其ph6.2-6.6。以mrs液體培養(yǎng)基重量計2％的接種量，將分離純化的菌種在37℃條件下擴大培養(yǎng)，接著對菌種培養(yǎng)物進行碳水化合物產(chǎn)酸(api50ch)反應(yīng)，鑒定菌種的理化性質(zhì)。用試劑盒提取菌種dna，設(shè)計16srdna和phes基因序列的引物并進行pcr反應(yīng)及測序。經(jīng)過16srdna和phes基因序列同源性比對，所述菌株與lactobacillusplantarumwcfs1(sequenceid：nc_004567.2)有99％的同源性。經(jīng)過對多項實驗數(shù)據(jù)的綜合分析，鑒定菌株zy001為植物乳桿菌。表1為菌種zy001細胞形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果。實施例2：將活化的植物乳桿菌zy001接種于mrs液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，以4％接種量接種純牛奶，42℃靜置培養(yǎng)至凝乳，充分攪拌后，取凝乳發(fā)酵液以4％接種量接種至驢奶∶牛奶＝3∶7的混合乳中，42℃培養(yǎng)至凝乳，獲得植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳，凝乳時間為12h，凝乳時ph為4.0。獲得植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳及配置的未發(fā)酵的混合乳用于后續(xù)動物實驗。實施例3：大鼠建酒精性肝損傷模型將40只sd大鼠(雌雄各半)機分為模型組和空白組，體重180-200g，在溫度22-24℃，濕度30-40％，光照和黑暗時間為12h的環(huán)境中飼養(yǎng)，正常對照組與模型組動物一樣給予基礎(chǔ)飲食，模型組按0.2ml/100g體質(zhì)量的劑量灌胃50％的乙醇溶液12ml/kg*bw，每天1次；正常對照組給予等體積蒸餾水，持續(xù)30天后，以自動血液生化分析儀測定生化指標血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)的活性。將建模成功的sd大鼠隨機分組，每組10只，分別為空白組、生理鹽水對照組、植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳實驗組及混合乳組；給予方式為灌胃，灌胃量5ml/次，每日2次，2周后以自動血液生化分析儀測定生化指標血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)的活性，結(jié)果見表2。經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)，以單菌驢奶發(fā)酵乳灌胃乙醇肝損傷sd大鼠，可顯著改善ast和alt的表達，由此可見，植物乳桿菌zy001具備改善肝功能的功效。實施例4：驢奶發(fā)酵乳的制備以驢奶和牛奶混合乳為原料，底物配比2∶8，3∶7，4∶6。分別活化培養(yǎng)公司前期保存鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以及植物乳桿菌zy001，將三種菌于mrs培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h后，4％接種于無菌純牛奶，42℃靜置培養(yǎng)至凝乳后按植物乳桿菌zy001、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌＝1∶1∶1，1∶2∶1，2∶1∶1，2∶2∶1；3∶1∶1，3∶2∶1各種配比接種驢奶牛奶混合乳(2-4∶8-6)，42℃靜置培養(yǎng)至凝乳，獲得不同配比的驢奶發(fā)酵乳產(chǎn)品。表1菌種zy001細胞形態(tài)和理化實驗結(jié)果表注：+表示陰性反應(yīng)；-表示陰性反應(yīng)。圖1菌種zy00116srdna基因序列測序結(jié)果atacatgcagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagttatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaaggtgggacagatgattagggtgaagtcgtaacaag圖2菌種zy001phes基因序列測序結(jié)果aagacgtgctactacgcacgcagacgtctgctgatcagccgcggtcacttgaaaatcacgatttttctaaaggaccgctgaaggtcttgtcacctggccgcgtttatcggcgtgatacggatgatgcaacccattcccatcaatttcatcaaattgaagggttagtcgtggacaagcatattacgatggctgatttgaagggcaccttaattctggttgccaagactttgtttggcgatcaattcgagtttcggctacggccaagcttctttccattcacggaaccatccgtagaagctgatgtaacttgctttaattgcaatggcaagggctgtgcaatctctaagcaaacgggttggatcgaagtactgggtgccggcatggttcacccccacgtgttagaaatgtctggcattgatccagaagaatatggtggctttgctttcgggcctagg表2發(fā)酵乳對酒精性肝損傷大鼠模型的酶指標組別ast(u/l)alt(u/l)正常組19.82±4.3226.21±4.38模型組51.21±6.3846.89±6.34生理鹽水對照組50.76±4.7545.86±5.56混合乳組45.25±6.7841.77±7.18植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳實驗組36.53±6.7536.45±6.17當前第1頁12