經(jīng)干擾序列修飾的TGF?β1緘默的白血病細胞外泌體及其制備方法和應用與流程

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞外泌體及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

白血病患者治療后復發(fā)是影響患者長期生存的主要因素，其根本原因是治療后體內(nèi)殘留的白血病細胞所致。而傳統(tǒng)手段則主要依靠大劑量鞏固化療和異基因造血干細胞移植來清除緩解期患者體內(nèi)殘留的白血病細胞，其中移植物中異基因淋巴細胞的抗白血病作用至關(guān)重要，但是這種非特異性的免疫效應常常伴有嚴重移植物抗宿主病，是目前造血干細胞移植的主要死亡原因。免疫治療可特異性清除白血病患者治療后體內(nèi)殘留白血病細胞，減少和預防白血病復發(fā)，延長患者的生存期，改善白血病的預后。數(shù)個臨床研究表明抗腫瘤疫苗對白血病有一定的療效，是白血病治療的一個很有希望的發(fā)展方向。探尋更有針對性，操作簡便，適合臨床應用的白血病細胞特異性免疫治療一直是白血病等惡性血液腫瘤治療研究的熱點。

外泌體是直徑為40-100nm，由真核細胞釋放的，含有多種細胞膜分子以及相關(guān)蛋白的小囊泡。多種類型細胞尤其是造血系統(tǒng)來源的細胞均能釋放exo。其中包括抗原提呈細胞如樹突狀細胞(dendriticcells,dcs)、淋巴細胞、肥大細胞、腸上皮細胞以及多種腫瘤細胞等。近年來有研究證實腫瘤細胞來源的exo(tumorcell-derivedexosomes,tex)負載有腫瘤細胞相關(guān)抗原，可被樹突狀細胞吞噬，并能誘導腫瘤特異性的ctl反應，因為有望成為理想的抗腫瘤疫苗來源。alter等報道漿細胞瘤源性的外泌體疫苗可保護80％小鼠免受腫瘤攻擊，并可有效抑制腫瘤生長。yao等報道白血病細胞同樣可以釋放外泌體(leukemiacell-derivedexosome,lex)，且可被dc攝取.lex靶向結(jié)合的dc細胞可顯著提高荷瘤小鼠的生存率，并減緩腫瘤生長。因此以白血病源性外泌體為基礎(chǔ)的抗白血病疫苗可有望安全有效地清除白血病緩解期患者體內(nèi)殘余的微小殘留病灶。

在一項i期臨床試驗中，dai等分離患者惡性腹水的外泌體作為特異性抗腫瘤疫苗來源，單獨應用外泌體疫苗或聯(lián)合免疫佐劑gm-csf治療iii/iv期腸癌患者。結(jié)果顯示，未經(jīng)修飾的腫瘤外泌體疫苗雖表現(xiàn)出良好的安全性，并可在體外誘導dth反應。然而大部分患者卻未從治療中獲益。未經(jīng)修飾的腫瘤源性外泌體雖可誘導一定的抗原特異性免疫反應，然而其免疫原性相對較弱，臨床療效仍不樂觀。更為重要的是，有研究顯示，腫瘤細胞釋放的外泌體(tumorcell-derivedexosomes,tex)可能對宿主免疫系統(tǒng)有抑制效應，甚至有促進腫瘤細胞生長的作用。

由于未經(jīng)修飾的tex疫苗抗腫瘤效應有限，因此優(yōu)化以tex為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗，提高其免疫原性從而誘導更強大的抗腫瘤特異性免疫應當是提其臨床應用價值的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，tex中富集有諸如fas-l、tgf-β1，pd-1l等免疫抑制因子。其中tgf-β1是其中最為重要的免疫抑制因子，其可通過阻礙dc細胞成熟，抑制t細胞增殖、促進cd8⁺t細胞凋亡，誘導調(diào)節(jié)性t細胞增殖、下調(diào)t細胞和nk細胞的nkg2d受體等方式顯著削弱tex疫苗的抗腫瘤效應。因此，為了提高外泌體疫苗的免疫效力，本發(fā)明通過在白血病細胞中采用基因修飾手段緘默其tgf-β1的表達水平，從而下調(diào)白血病細胞來源的外泌體(lex)負載的tgf-β1含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞外泌體及其制備方法和應用，由該白血病源性外泌體(lextgf-β1si)致敏的dc疫苗(dclex-tgf-β1si)，其免疫原性較未經(jīng)改造的lex所致敏的dc疫苗(dclex)與lexgfp致敏的dc(dclex-gfp)疫苗明顯增強。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞外泌體，所述外泌體是由經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞分泌的，所述干擾序列為shrna1、shrna2或shrna3。

更進一步地，所述shrna1的序列如seqidno:1、seqidno:2所示，所述shrna2的序列如seqidno:3、seqidno:4所示，所述shrna3的序列如seqidno:5、seqidno:6所示。

本發(fā)明還提供所述的經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞外泌體的制備方法包括如下步驟：

步驟一，白血病細胞的培養(yǎng)；

步驟二，制備干擾序列修飾的白血病細胞；

步驟三，外泌體的抽提與純化。

步驟四，經(jīng)修飾后的白血病細胞外泌體靶向致敏的樹突狀細胞疫苗作為保護性腫瘤疫苗的抗白血病效應檢測；

步驟五，經(jīng)修飾后的白血病細胞外泌體靶向致敏的樹突狀細胞疫苗在荷瘤小鼠中的效應檢測。

更進一步地，步驟一具體為：

a)配置好含有10％胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基內(nèi)含100u/ml青霉素鈉和100ug/ml硫酸鏈霉素，將凍有l(wèi)1210細胞的凍存管從液氮罐中取出后直接投入37℃溫水中，并輕輕搖動使其盡快融化，取出凍存管，用酒精消毒后開啟，用吸管吸出細胞懸液，轉(zhuǎn)移到15ml尖底離心管，并滴加10倍以上的培養(yǎng)液，離心1200rpm×10min，棄上清，新鮮的完全培養(yǎng)液重懸后接種至培養(yǎng)瓶；

b)培養(yǎng)瓶置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，細胞呈懸浮生長，每1－2d換液或傳代。

更進一步地，步驟二為：構(gòu)建含有干擾序列基因的tgf-β1rna干擾慢病毒，用得到的慢病毒轉(zhuǎn)染白血病細胞，得到經(jīng)干擾序列修飾的白血病細胞。

更進一步地，步驟二具體步驟為：

a)根據(jù)genebank中tgf-β1核苷酸序列及sirna設計shrna1、shrna2及shrna3靶點序列，同時合成與tgf-β1基因序列無關(guān)的sirna作為陰性對照，序列經(jīng)同源分析后，合成含有干擾序列的雙鏈dnaoligo，其兩端含有酶切位點粘段，連入酶切后的phblv-u6-scramble-zsgreen表達載體上，將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5a，挑選陽性重組菌落進行pcr鑒定及測序比對后，鑒定為陽性克隆，即構(gòu)建成功tgf-β1rna干擾慢病毒載體；

b)構(gòu)建好的慢病毒穿梭質(zhì)粒與其慢病毒包裝載體質(zhì)粒(pspax2，pmd2g)分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，然后共轉(zhuǎn)染293t細胞，轉(zhuǎn)染6小時后，更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時及72小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清，對其濃縮后獲得高滴度的慢病毒濃縮液；

c)取對數(shù)期白血病細胞，接種于24孔板中，每孔細胞數(shù)10⁵個，每組設3復孔，每組以感染復數(shù)(moi)值100分別加入攜帶有shrna1、shrna2、shrna3和作為陰性對照的shrna(shrnanc)的慢病毒，每孔感染復數(shù)(moi)值均為100，加入polybrane8ug/ml充分混勻后，室溫下，2000g離心90分鐘，離心后置于5％co2，37℃細胞培養(yǎng)箱中，24小時后，更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72小時后，分選出各組中g(shù)fp陽性細胞，得到經(jīng)干擾序列修飾的白血病細胞。通過pcr技術(shù)對經(jīng)干擾序列修飾的白血病細胞的tgf-β1水平進行檢測，選擇tgf-β1緘默最顯著的細胞作為提取外泌體的來源，并將該細胞命名為l1210tgf-β1，將感染了shrnanc慢病毒的白血病細胞命名為l1210gfp。

更進一步地，步驟三具體步驟為：

1)收集對數(shù)期l1210細胞，加入pbs，吹打混勻后1200rpm離心10min，棄上清；

2)調(diào)整細胞密度為5×10⁶/ml，轉(zhuǎn)移至aim-v無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育36h，離心收集細胞培養(yǎng)上清；

3)收集無血清培養(yǎng)的l1210細胞上清液，800g低溫離心(4℃，下同)30min去除細胞取上清液；

4)10，000g低溫離心1h去除細胞碎片取上清液；

5)100，000g低溫超速離心1h棄上清液；

6)將沉淀溶于pbs中，再于4℃下100，000×g超速離心60min，沉淀用適量pbs重懸，獲得白血病細胞來源的外泌體，收集并-80℃凍存?zhèn)溆?。將將來源于l1210，l1210gfp,l1210tgf-β1si的外泌體分別命名為lex,lexgfp，lextgf-β1si。

更進一步地，步驟四具體步驟為：

1)分離小鼠骨髓單個核細胞，體外通過含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和白細胞介素4(il-4)誘導培養(yǎng)小鼠樹突狀細胞,每3天行半量換液，培養(yǎng)第六天，計數(shù)收集dc；

2)每1×10⁶個dc分別于lex(10μg),lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育過夜，以致敏dc，將由lex,lexgfp，lextgf-β1si致敏的dc分別命名為dclex,dclex-gfp，dclex-tgf-β1si。

3)將6-8周齡dba/2雌性小鼠隨機分為5組，每組10只；

4)在第0、7、14天給予dba/2小鼠在左側(cè)大腿皮下分別預防性接種pbs(100μl)、dc(1x10⁶個/只)、dclex(1x10⁶個/只)、dclex-gfp(1x10⁶個/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶個/只)；

5)第21天取對數(shù)期生長的l1210白血病細胞，800g離心5分鐘棄上清，無血清dmem培養(yǎng)基重懸細胞，800g離心5分鐘，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5x10⁶/ml，各組中每只小鼠右側(cè)大腿皮下注射細胞懸液各100μl(含有5x10⁵個細胞)；

6)接種腫瘤細胞后，觀察各組小鼠腫瘤生長情況并記錄。

更進一步地，步驟五具體步驟為：

1)將6-8周齡dba/2雌性小鼠隨機分為5組，每組10只；

2)取對數(shù)期生長的l1210白血病細胞，800g離心5分鐘棄上清，無血清dmem培養(yǎng)基重懸細胞，800g離心5分鐘，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5x10⁶/ml，各組中每只小鼠右側(cè)大腿皮下注射細胞懸液各100μl(含有5x10⁵個細胞)；

3)分離小鼠骨髓單個核細胞，體外通過含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和白細胞介素4(il-4)誘導培養(yǎng)小鼠樹突狀細胞(dendriticcells,dc)，每3天行半量換液，培養(yǎng)第六天，計數(shù)收集dc；

4)每1×10⁶個dc分別于lex(10μg)，lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育過夜，以致敏dc；

5)腫瘤接種5天后，各組小鼠左側(cè)大腿皮下分別接種pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶個/只)、dclex(1x10⁶個/只)、dclex-gfp(1x10⁶個/只)、dclex-tgf-β1s(1x10⁶個/只)；

6)每日觀察小鼠腫瘤生長情況，用游標卡尺測量小鼠荷瘤直徑，記錄小鼠生存率.

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

本發(fā)明通過攜帶shrna的慢病毒載體緘默外泌體來源細胞的tgf-β1表達，從而生產(chǎn)純化出tgf-β1含量下調(diào)的白血病細胞源性外泌體，即lextgf-β1si。將改造后的白血病細胞源性外泌體致敏樹突狀細胞dc，制備成dclex-tgf-β1si疫苗。經(jīng)改造優(yōu)化的白血病源性外泌體(lextgf-β1si)所致敏的dclex-tgf-β1si疫苗，其免疫原性較未經(jīng)改造的lex所致敏的dc疫苗(dclex)與lexgfp致敏的dc(dclex-gfp)疫苗明顯增強。dclex-tgf-β1si表面共刺激分子(cd80和cd86)及mhcii類分子表達較dclex、dclex-gfp顯著升高，同時dclex-tgf-β1si所分泌的細胞因子il-12p40和tnf-a較dclex、dclex-gfp也顯著增加。而其tgf-β1的分泌水平則較dclex、dclex-gfp顯著下降。提示lextgf-β1si所致敏的dc細胞在表型上與功能上更趨近于成熟。通過dclex-tgf-β1si疫苗效力的檢測可見，dclex-tgf-β1si疫苗可較普通lex致敏的dc疫苗更有效地誘導cd4⁺t細胞增殖反應，th1細胞因子分泌效應以及特異性ctl反應。動物實驗檢測疫苗體內(nèi)效力的結(jié)果顯示dclex-tgf-β1si作為腫瘤預防疫苗，可更為有效地保護小鼠免受腫瘤進攻。而dclex-tgf-β1si作為腫瘤治療疫苗時，其可有效抑制腫瘤生長，并延長小鼠的荷瘤生存時間?？傊?，經(jīng)優(yōu)化改造的dclex-tgf-β1si疫苗可產(chǎn)生較未經(jīng)修飾的lex所致敏的dc疫苗更為強大的特異性抗腫瘤免疫應答，其疫苗效力較前顯著提升。

附圖說明

圖1為經(jīng)改造的lex的特征圖；圖1a可見電鏡下觀察經(jīng)改造的lex，即lextgf-β1si，符合典型的外泌體形態(tài)，直徑為30—100nm,形態(tài)均一,為圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu)。通過對所提取的外泌體樣品進行westernblot蛋白分析可見，所提取的白血病細胞外泌體樣本均表達外泌體特征性蛋白cd9，cd63，hsp70(圖1b)。圖1c示l1210細胞經(jīng)過tgf-β1shrna慢病毒修飾后，其tgf-β1表達水平顯著下調(diào)。圖1d示，來源于tgf-β1緘默的l1210細胞的外泌體其tgf-β1含量顯著下調(diào)。

圖2為改造后的lex對其錨定的dc細胞特性影響，由圖可見，dclex-tgf-β1si表面的cd80，cd86和mhcii類分子較dclex與dclex-gfp明顯上調(diào)(圖2a)，此外細胞因子tnf-α,il-12p70的分泌水平較dclex與dclex-gfp顯著升高(圖2b,c)，提示lextgf-β1si錨定的dc細胞，其成熟程度及抗原遞呈功能較dclex與dclex-gfp更佳。此外dclex-tgf-β1si所分泌的免疫抑制因子tgf-β1的水平較dclex與dclex-gfp顯著降低(圖2d)，提示dclex-tgf-β1si可能具有更強的免疫原性。imdc：未成熟樹突狀細胞；dclex：lex致敏的樹突狀細胞；dclex-gfp：lexgfp致敏的樹突狀細胞。dclex-tgf-β1si：lextgf-β1si致敏的樹突狀細胞；mdc：經(jīng)lps刺激成熟的樹突狀細胞；

圖3為改造后的lex致敏dc細胞的新型疫苗可更有效地誘導特異性cd4⁺和cd8⁺t細胞反應，由圖可見，dclex-tgf-β1si可更有效地誘導抗白血病特異性cd4⁺t細胞擴增及th1細胞因子，并產(chǎn)生更為強大的ctl反應。(**)表示p<0.01，(*)表示p<0.05；p<0.05提示存在顯著性差異。

圖4為用改造后的lex致敏dc細胞的新型疫苗可有效發(fā)揮腫瘤治療效應。由圖可見，dclex-tgf-β1si疫苗用于治療荷瘤小鼠，其可顯著延長荷瘤小鼠的中位生存時間，并有效抑制腫瘤生長的影響，其效應顯著優(yōu)于dclex和dclex-gfp疫苗。pbs:pbs緩沖液；dc:未結(jié)合外泌體的樹突狀細胞；dclex：lex致敏的樹突狀細胞；dclex-gfp:lexgfp致敏的樹突狀細胞。dclex-tgf-β1si：lextgf-β1si致敏的樹突狀細胞。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。

經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞外泌體，所述外泌體是由經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞分泌的，所述干擾序列為shrna1、shrna2或shrna3。

更進一步地，所述shrna1的序列如seqidno:1、seqidno:2所示，所述shrna2的序列如seqidno:3、seqidno:4所示，所述shrna3的序列如seqidno:5、seqidno:6所示。

本發(fā)明還提供所述的經(jīng)干擾序列修飾的tgf-β1緘默的白血病細胞外泌體的制備方法包括如下步驟：

步驟一，白血病細胞的培養(yǎng)；

步驟二，制備干擾序列修飾的白血病細胞；

步驟三，外泌體的抽提與純化。

步驟四，經(jīng)修飾后的白血病細胞外泌體靶向致敏的樹突狀細胞疫苗作為保護性腫瘤疫苗的抗白血病效應檢測；

步驟五，經(jīng)修飾后的白血病細胞外泌體靶向致敏的樹突狀細胞疫苗在荷瘤小鼠中的效應檢測。

更進一步地，步驟一具體為：

a.配置好含有10％胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基內(nèi)含100u/ml青霉素鈉和100ug/ml硫酸鏈霉素，將凍有l(wèi)1210細胞的凍存管從液氮罐中取出后直接投入37℃溫水中，并輕輕搖動使其盡快融化，取出凍存管，用酒精消毒后開啟，用吸管吸出細胞懸液，轉(zhuǎn)移到15ml尖底離心管，并滴加10倍以上的培養(yǎng)液，離心1200rpm×10min，棄上清，新鮮的完全培養(yǎng)液重懸后接種至培養(yǎng)瓶；

b.培養(yǎng)瓶置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，細胞呈懸浮生長，每1－2天換液或傳代。

更進一步地，步驟二為：構(gòu)建含有靶向tgf-β1干擾序列基因的干擾慢病毒，用得到的慢病毒轉(zhuǎn)染白血病細胞，得到經(jīng)干擾序列修飾的白血病細胞。

更進一步地，步驟二具體步驟為：

a)根據(jù)genebank中tgf-β1核苷酸序列及sirna設計shrna1、shrna2及shrna3靶點序列，同時合成與tgf-β1基因序列無關(guān)的sirna作為陰性對照，序列經(jīng)同源分析后，合成含有干擾序列的雙鏈dnaoligo，其兩端含有酶切位點粘段，連入酶切后的phblv-u6-scramble-zsgreen表達載體上，將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5a，挑選陽性重組菌落進行pcr鑒定及測序比對后，鑒定為陽性克隆，即構(gòu)建成功tgf-β1rna干擾慢病毒載體；

b)構(gòu)建好的慢病毒穿梭質(zhì)粒與其慢病毒包裝載體質(zhì)粒(pspax2，pmd2g)分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，然后共轉(zhuǎn)染293t細胞，轉(zhuǎn)染6小時后，更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時及72小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清，對其濃縮后獲得高滴度的慢病毒濃縮液；

c)取對數(shù)期白血病細胞，接種于24孔板中，每孔細胞數(shù)10⁵個，每組設3復孔，每組以感染復數(shù)(moi)值100分別加入攜帶有shrna1、shrna2、shrna3和作為陰性對照的shrna(shrnanc)的慢病毒，每孔感染復數(shù)(moi)值均為100，加入polybrane8ug/ml充分混勻后，室溫下，2000g離心90分鐘，離心后置于5％co2，37℃細胞培養(yǎng)箱中，24小時后，更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72小時后，分選出各組中g(shù)fp陽性細胞，得到經(jīng)干擾序列修飾的白血病細胞。通過pcr技術(shù)對經(jīng)干擾序列修飾的白血病細胞的tgf-β1水平進行檢測，選擇tgf-β1緘默最顯著的細胞作為提取外泌體的來源，并將該細胞命名為l1210tgf-β1，將感染了shrnanc慢病毒的白血病細胞命名為l1210gfp。

更進一步地，步驟三具體步驟為：

1)收集對數(shù)期l1210細胞，加入pbs，吹打混勻后1200rpm離心10min，棄上清；

2)調(diào)整細胞密度為5×10⁶/ml，轉(zhuǎn)移至aim-v無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育36h，離心收集細胞培養(yǎng)上清；

3)收集無血清培養(yǎng)的l1210細胞上清液，800g低溫離心(4℃，下同)30min去除細胞取上清液；

4)10，000g低溫離心1h去除細胞碎片取上清液；

5)100，000g低溫超速離心1h棄上清液；

6)將沉淀溶于pbs中，再于4℃下100，000×g超速離心60min，沉淀用適量pbs重懸，獲得白血病細胞來源的外泌體，收集并-80℃凍存?zhèn)溆?。將將來源于l1210，l1210gfp,l1210tgf-β1si的外泌體分別命名為lex,lexgfp，lextgf-β1si。

更進一步地，步驟四具體步驟為：

1)分離小鼠骨髓單個核細胞，體外通過含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和白細胞介素4(il-4)誘導培養(yǎng)小鼠樹突狀細胞(dendriticcells,dc),每3天行半量換液，培養(yǎng)第六天，計數(shù)收集dc；

2)每1×10⁶個dc分別于lex(10μg),lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育過夜，以致敏dc，將由lex,lexgfp，lextgf-β1si致敏的dc分別命名為dclex,dclex-gfp，dclex-tgf-β1si。

3)將6-8周齡dba/2雌性小鼠隨機分為5組，每組10只；

4)在第0、7、14天給予dba/2小鼠在左側(cè)大腿皮下分別預防性接種pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶個/只)、dclex(1x10⁶個/只)、dclex-gfp(1x10⁶個/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶個/只)；

5)第21天取對數(shù)期生長的l1210白血病細胞，800g離心5分鐘棄上清，無血清dmem培養(yǎng)基重懸細胞，800g離心5分鐘，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5x10⁶/ml，各組中每只小鼠右側(cè)大腿皮下注射細胞懸液各100μl(含有5x10⁵個細胞)；

6)接種腫瘤細胞后，觀察各組小鼠腫瘤生長情況并記錄。

更進一步地，步驟五具體步驟為：

1)將6-8周齡dba/2雌性小鼠隨機分為5組，每組10只；

2)取對數(shù)期生長的l1210白血病細胞，800g離心5分鐘棄上清，無血清dmem培養(yǎng)基重懸細胞，800g離心5分鐘，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5x10⁶/ml，各組中每只小鼠右側(cè)大腿皮下注射細胞懸液各100μl(含有5x10⁵個細胞)；

3)分離小鼠骨髓單個核細胞，體外通過含有粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和白細胞介素4(il-4)誘導培養(yǎng)小鼠樹突狀細胞(dendriticcells,dc)，每3天行半量換液，培養(yǎng)第六天，計數(shù)收集dc；

4)每1×10⁶個dc分別于lex(10μg)，lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育過夜，以致敏dc；

5)腫瘤接種5天后，各組小鼠左側(cè)大腿皮下分別接種pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶個/只)、dclex(1x10⁶個/只)、dclex-gfp(1x10⁶個/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶個/只)；

6)每日觀察小鼠腫瘤生長情況(游標卡尺測量小鼠荷瘤直徑)，記錄小鼠生存率。

實施例1tgf-β1含量下調(diào)的l1210源性外泌體的制備

一、tgf-β1shrna慢病毒的構(gòu)建

1.tgf-β1shrna慢病毒載體制備

tgf-β1干擾慢病毒載體由上海漢恒生物科技有限公司設計合成。根據(jù)genebank中tgf-β1核苷酸序列及sirna設計出3條最佳靶點序列。分別命名為shrna1,shrna2,shrna3。序列如下表。同時合成與tgf-β1基因序列無關(guān)的sirna作為陰性對照(negativecontrol)，命名為shrnanc。序列經(jīng)同源分析后，由上海生工生物合成含有干擾序列的雙鏈dnaoligo,其兩端含有酶切位點粘段，連入酶切后的phblv-u6-scramble-zsgreen表達載體上。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌dh5a，挑選陽性重組菌落進行pcr鑒定及測序比對后，鑒定為陽性克隆即為構(gòu)建成功的tgf-β1rna干擾慢病毒載體。

2.慢病毒包裝及滴度測定

構(gòu)建好的慢病毒穿梭質(zhì)粒與其慢病毒包裝載體質(zhì)粒(pspax2，pmd2g)分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提。然后共轉(zhuǎn)染293t細胞，轉(zhuǎn)染6小時后，更換為完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時及72小時后，收集富含慢病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清，對其濃縮后獲得高滴度的慢病毒濃縮液。將慢病毒顆粒分別轉(zhuǎn)染293t細胞后根據(jù)倍比稀釋法，檢測病毒滴度，選擇最佳病毒滴度進行后續(xù)試驗。

小鼠tgf-β1引物(360bp)：

正義鏈為：5’-gcaccatccatgcaatgaac-3’；(seqidno:7)

反義鏈為5’-ttgcaggagcgcacaatgat-3’(seqidno:8)

小鼠β-actin引物(349bp)：

正義鏈為：5’-tggaatccttgtgcatccatgaaa-3’；(seqidno:9)

反義鏈：5’-taaaacgcagctcagtaacagtccg-3’(seqidno:10)

tgf-β1干擾序列設計如下：

sirna1序列：cgaagcggactactatgctaa(seqidno:11)

shrna1序列：

表1shrna1序列表

sirna2序列：gagcaacatgtggaactctaccaga(seqidno:12)

shrna2序列：

表2shrna2序列表

sirna3序列：cggagagccctggataccaactatt(seqidno:13)

shrna3序列：

表3shrna3序列表

二、慢病毒轉(zhuǎn)染l1210細胞及干擾效率測試

取對數(shù)期l1210細胞，接種于24孔板中，每孔細胞數(shù)10⁵個，每組設3復孔。每組以感染復數(shù)(moi)值100分別加入攜帶有shrna1、shrna2、shrna3和shrnanc的慢病毒，每孔感染復數(shù)(moi)值均為100，加入polybrane8ug/ml充分混勻后，室溫下，2000g離心90分鐘。離心后置于5％co2，37℃細胞培養(yǎng)箱中。24小時后，更換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染72小時后，流式細胞儀分選出各組中g(shù)fp陽性細胞。

通過trizolrna提取試劑分別提取各組細胞中總rna，并逆轉(zhuǎn)錄成cdna。以各組cdna為模板，進行real-timepcr，根據(jù)相對定量法計算目的片段的擴增比例。各樣本重復3次。pcr檢測結(jié)果如下。其中以shrna3對l1210細胞tgf-β1基因轉(zhuǎn)錄的干擾效率最為顯著。隨后通過流式細胞儀對shrna慢病毒感染的l1210細胞及未進行基因修飾的l1210細胞進行tgf-β1蛋白檢測。實驗結(jié)果顯示，tgf-β1-sh3所感染的l1210細胞表面tgf-β1表達水平顯著低于其他兩組細胞，證實通過攜帶有tgf-β1-sh3干擾序列的重組慢病毒可有效緘默l1210細胞tgf-β1基因及蛋白的表達水平(圖1c)。將感染了tgf-β1-sh3的l1210細胞，命名為l1210tgf-β1si，并將其作為分離外泌體的來源細胞之一，

三、l1210tgf-β1si來源的外泌體分離及特征鑒定

1.外泌體提取

1)收集對數(shù)期l1210細胞，加入pbs，吹打混勻后1200rpm離心10min，棄上清。

2)調(diào)整細胞密度為5×10⁶/ml，轉(zhuǎn)移至aim-v無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育36h，離心收集細胞培養(yǎng)上清。

3)收集無血清培養(yǎng)的l1210細胞上清液，800g低溫離心(4℃，下同)30min去除細胞取上清液。

4)10，000g低溫離心1h去除細胞碎片取上清液。

5)100，000g低溫超速離心1h棄上清液。

6)將沉淀溶于pbs中，再于4℃下100，000×g超速離心60min1h，沉淀用適量pbs重懸，獲得白血病細胞來源的外泌體，收集并-80℃凍存?zhèn)溆谩碓从趌1210，l1210gfp，l1210tgf-β1si的外泌體分別命名為lex,lexgfp，lextgf-β1si。

2.lex的蛋白定量測定(bca法)

1)取0.8ml蛋白標準配制液加入到一管蛋白標準(20mgbsa)中，充分溶解后配制成25mg/l的蛋白標準溶液，取20ul稀釋至終濃度為0.5ml/ml，其余-20度長期保存。

2)根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積bca試劑a加1體積bca試劑b(50：1)配制適量bca工作液，充分混勻。

3)將標準品按0，1，2，3，4，8，12，16，20ul加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20ul。

4)加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液到20ul。

5)各孔加入200ulbca工作液，37℃放置20～30分鐘。

6)測定a562，根據(jù)標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。

3.外泌體特征鑒定

投射電鏡觀察外泌體樣本形態(tài)特征：

1)用parafilm膜平整黏貼于玻璃表面

2)將50微升外泌體樣本滴于膜上

3)將帶有formvar支持膜的銅網(wǎng)覆蓋在樣品滴上，使其漂浮(有支持膜的那面朝下)3-10分鐘，使樣本吸附到支持膜上。

4)將50微升2％的磷鎢酸染液滴于parafilm膜上。

5)將銅網(wǎng)移離樣品液滴，用小片濾紙置于銅網(wǎng)邊緣以吸去銅網(wǎng)上液體，再將此吸附有樣品的銅網(wǎng)覆蓋到2％的磷鎢酸染液液滴上漂浮3分鐘，濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干，白熾燈下干燥10分鐘。

6)投射電鏡(phillipcm120)下觀察。

如圖1a所示，電鏡下觀察課件lextgf-β1si為直徑在40-100nm的盤狀囊泡，符合典型外泌體的形態(tài)特征。

westernblot檢測所分離的外泌體中hsp70，cd9，cd63表達情況：

1)將裂解液和酶抑制劑以體積比50：1混合，取適量的裂解液混合物加入到外泌體樣品沉淀中。

2)冰上放置20分鐘后，4℃，12000g離心20分鐘。

3)收集上清，bradford法蛋白質(zhì)濃度測定。

4)在冰上配制sds聚丙烯酰胺凝膠(分離膠與濃縮膠)

5)將冰上配置好的分離膠混勻后緩慢注入兩玻璃板之間，異丙醇液封，室溫靜止30分鐘至膠凝固，小心棄去異丙醇并用蒸餾水清洗，吸干殘留。

6)注入sds-page濃縮膠玻，小心插入齒梳，排凈氣泡，室溫靜置直到膠完全凝固。

7)將玻璃板放進電泳槽，用1×電泳緩沖液加滿電泳槽，輕輕拔出梳子，每個樣品按30μg上樣，空置孔加入15μl加樣緩沖液。

8)接通電源，調(diào)節(jié)電壓80v，電泳約40分鐘后，當溴酚藍染料從濃縮膠進入分離膠，調(diào)節(jié)電壓至120v，電泳至溴酚藍到達凝膠底部停止。

9)剝膠板小心撬開玻板，將膠浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘。依據(jù)膠的大小裁剪pvdf膜，放入甲醇中浸泡10分鐘后置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡2-3分鐘；

10)以轉(zhuǎn)膜架子黑色面為底，依次放置氈墊、3層濾紙、膠、pvdf膜、3層濾紙、氈墊，驅(qū)趕干凈氣泡，夾緊架子，放入電轉(zhuǎn)儀中；

11)加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，放入冰盒，冰浴下恒流200ma，轉(zhuǎn)膜60分鐘，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出雜交膜。

12)將完成蛋白轉(zhuǎn)膜的pvdf膜置于5％tbs配置的脫脂牛奶中于室溫搖床上封閉2小時。

13)根據(jù)抗體說明書，一抗稀釋液均按照1:1000稀釋一抗(抗hsp70，抗cd63，抗cd9)；

14)孵育過夜

15)1×tbst室溫洗3次，每次10分鐘；

16)按照一定比例稀釋二抗(1:1000)室溫孵育1小時；

17)1×tbst室溫洗3次，每次10分鐘；

18)配制ecl發(fā)光顯色液，向膜上滴加適量進行化學發(fā)光，用bio-redchemidoc^tmxrs+化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測圖像；

19)定量使用imagelab軟件測定灰度值。

如圖1b所示：在lex,lexgfp，lextgf-β1si中均能檢測出cd9，cd63與hsp70這些外泌體標志性蛋白，證實我們所獲得的外泌體樣本為典型白血病細胞來源的外泌體

elisa檢測lex中tgf-β1含量：

1)生物素標記抗小鼠tgf-β1抗體工作液的準備：按1μl生物素標記抗人tgf-β1加抗體稀釋液99μl的比例配制成工作液。

2)根據(jù)每孔需要0.1ml計算總的用量。按1μl親和素-過氧化物酶復合物(abc)加abc稀釋液99μl的比例配制工作液。輕輕混勻。

3)將10,000pg/ml，5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312pg/ml，156pg/ml的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。

4)酶標板加上蓋，37℃反應90分鐘。

5)反應后吸去酶標板內(nèi)的液體。將準備好的生物素抗小鼠tgf-β1抗體工作液按每孔0.1ml依次加入，tmb空白顯色孔除外。37℃反應60分鐘

6)用0.01mtbs或0.01mpbs洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。

7)將準備好的abc工作液按每孔0.1ml依次加入，tmb空白顯色孔除外。

37℃反應30分鐘。

8)0.01mtbs或0.01mpbs洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。

9)按每孔90μl依次加入已在37℃平衡30分鐘的tmb顯色液，37℃避光反應5-20分鐘。

10)按每孔0.1ml依次加入tmb終止液。

11)用酶標儀在450nm測定od值。從而得出待測樣品的最終濃度。

elisa檢測結(jié)果顯示，來源于tgf-β1緘默的l1210細胞的外泌體，其每100μg中tgf-β1蛋白的含量僅為5.8±0.7pg/10μg，顯著低于未經(jīng)修飾及轉(zhuǎn)入對照慢病毒的l1210細胞16.9±2.1pg/10μg，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例2tgf-β1含量下調(diào)的l1210源性外泌體靶向致敏的樹突狀細胞疫苗(dclex-tgf-β1si)

誘導生成樹突狀細胞(dendriticcells,dcs)

小鼠骨髓dc的分離和培養(yǎng)：

1)取三只6～8周小鼠，處死，75％酒精浸泡1分鐘。

2)剪開小鼠背部皮膚，將皮膚拉至膝關(guān)節(jié)以下，剪斷膝關(guān)節(jié)和髂關(guān)節(jié)處，放入pbs中。

3)準備2個10cm培養(yǎng)皿，將組織置入培養(yǎng)皿中，修剪組織，以方便暴露骨端。

4)將處理后的組織放入另一10cm培養(yǎng)皿，加入1640培養(yǎng)基。

5)準備10ml針筒，注滿1640培養(yǎng)基剪開股骨兩端，用1ml針筒沖洗骨髓腔，可見長條骨髓或者紅色液體流出。

6)收集沖洗液入50ml離心管，沖洗培養(yǎng)皿，離心，4度、1200rpm，5min

7)棄上清，加入3ml紅細胞裂解液，裂解4分鐘，加入pbs或1640培養(yǎng)液終止。4度、1200rpm離心5min。

8)棄上清，加入1640洗滌一次，離心，4度、1200rpm，10min，棄上清。

9)配制10％fbs培養(yǎng)液50ml，加入1支gm-csf(20ng/l)，1支il-4(20ng/l)。取18ml重懸細胞。接種于6孔板中，每孔3ml，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

10)培養(yǎng)液變黃，換液：將6孔板稍傾斜，每孔去除2ml液體，加入完全培養(yǎng)液(每孔2ml)，補足細胞因子。

11)培養(yǎng)第六天，輕輕并計數(shù)收集dc

12)第6天輕輕吹打收集dc，計數(shù)，每1×10⁶個dc分別于10ug的白血病源性外泌體共孵育過夜。

13)收集致敏的dc細胞，備用。

dclex-tgf-β1si免疫小鼠對腫瘤的預防作用：

1)將6-8周齡dba/2雌性小鼠隨機分為5組，每組10只；

2)在第0、7、14天給予dba/2小鼠在左側(cè)大腿皮下分別預防性接種pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶個/只)、dclex(1x10⁶個/只)、dclex-gfp(1x10⁶個/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶個/只)；

3)第21天取對數(shù)期生長的l1210白血病細胞，800g離心5分鐘棄上清，無血清dmem培養(yǎng)基重懸細胞，800g離心5分鐘，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5x10⁶/ml。各組中每只小鼠右側(cè)大腿皮下注射細胞懸液各100μl(含有5x10⁵個細胞)。

4)接種腫瘤細胞后，觀察各組小鼠腫瘤生長情況并記錄。

6.dclex-tgf-β1si疫苗小鼠對腫瘤的治療作用

1)將6-8周齡dba/2雌性小鼠隨機分為5組，每組10只。

2)取對數(shù)期生長的l1210白血病細胞，800g離心5分鐘棄上清，無血清dmem培養(yǎng)基重懸細胞，800g離心5分鐘，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5x10⁶/ml。各組中每只小鼠右側(cè)大腿皮下注射細胞懸液各100μl(含有5x10⁵個細胞)。

3)5天后，各組小鼠左側(cè)大腿皮下分別接種pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶個/只)、dclex(1x10⁶個/只)、dclex-gfp(1x10⁶個/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶個/只)。

4)每日觀察小鼠腫瘤生長情況(游標卡尺測量小鼠荷瘤直徑)，記錄小鼠生存率。

表4dclex-tgf-β1si疫苗的保護性免疫效應

表4中，pbs:pbs緩沖液；dc:未結(jié)合外泌體的樹突狀細胞；dclex：lex致敏的樹突狀細胞；dclex-gfp:lexgfp致敏的樹突狀細胞。dclex-tgf-β1si：lextgf-β1si致敏的樹突狀細胞。

由表4可見，經(jīng)dclex-tgf-β1si疫苗免疫的小鼠，接種腫瘤后，其腫瘤發(fā)生率較dclex和dclex-gfp疫苗免疫組顯著降低。

本發(fā)明中涉及的序列如下表5所示：

表5本發(fā)明中涉及的序列

本行業(yè)的技術(shù)人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

gatccgcgaagcggactactatgctaattcaagagattagcatagtagtccgcttcgttttttc

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