利用pH響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的方法與流程

本發(fā)明涉及木質(zhì)纖維素酶解技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的方法。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素生物煉制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技術(shù)之一。在這一煉制過(guò)程中，纖維素酶能否高效水解木質(zhì)纖維素底物是關(guān)鍵的技術(shù)瓶頸。同時(shí)，纖維素酶因其具有活力低、耗量大和價(jià)格貴等特點(diǎn)，直接阻礙了纖維素乙醇的工業(yè)化。實(shí)現(xiàn)纖維素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途徑。目前，纖維素酶回收利用技術(shù)主要有超濾膜回收、纖維素酶的固定化回收和新鮮底物重吸附法回收。

超濾膜回收可以同時(shí)回收纖維素酶中的內(nèi)切酶，外切酶和β-葡萄糖苷酶，且可以得到較高纖維素酶回收效率，但是超濾膜回收存在著設(shè)備貴、超濾膜易堵塞、操作費(fèi)時(shí)、成本高等問(wèn)題。纖維素酶的固定化可以保持纖維素酶的穩(wěn)定且利于纖維素酶的回收利用，但是固定化酶與纖維素固體顆粒之間存在很大的傳質(zhì)障礙，且固定化過(guò)程會(huì)嚴(yán)重影響酶活，因此在木質(zhì)纖維素酶解體系中目前僅限于纖維二糖酶的固定化回收再用。纖維素酶具有高穩(wěn)定性和對(duì)纖維素的強(qiáng)吸附的特性，使得酶通過(guò)新鮮底物吸附回收成為降低纖維素酶成本比例的潛在途徑，但是添加新鮮底物回收纖維素酶效率較低，同時(shí)也會(huì)造成酶解體系中木質(zhì)素富集，對(duì)纖維素的酶解糖化起到消極作用，且該方法無(wú)法回收纖維二糖酶。

木質(zhì)素是自然界中在數(shù)量上僅次于纖維素的第二大天然高分子材料，制漿造紙工業(yè)每年都會(huì)得到5000萬(wàn)噸左右的木質(zhì)素副產(chǎn)品，但超過(guò)95％的木質(zhì)素仍然主要作為工業(yè)制漿的廢棄物，造紙黑液的排放不僅造成資源的浪費(fèi)，同時(shí)又污染環(huán)境，對(duì)其進(jìn)行綜合開(kāi)發(fā)利用對(duì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和環(huán)境保護(hù)都具有現(xiàn)實(shí)意義。纖維素乙醇工業(yè)本身也會(huì)產(chǎn)生大量的酶解木質(zhì)素，若能將其應(yīng)用于降低生物乙醇的生產(chǎn)成本方面將會(huì)有巨大的意義。

lou等發(fā)現(xiàn)低分子量高磺化度的木質(zhì)素可以有效地促進(jìn)純纖維素的酶解，高分子量低磺化度的木質(zhì)素會(huì)抑制纖維素的酶解。提出了木質(zhì)素磺酸鹽可以與纖維素酶形成復(fù)合物來(lái)穩(wěn)定纖維素酶，并通過(guò)改變纖維素的酶解條件得到了驗(yàn)證(cellulose,2014.21:1351-1359.)。

wang等發(fā)現(xiàn)纖維素酶與磺化木質(zhì)素結(jié)合后，纖維素酶與木質(zhì)纖維素底物中的木質(zhì)素之間的靜電排斥作用增加了，纖維素酶在木質(zhì)素上的無(wú)效吸附減小了，更多的纖維素酶可以參與到纖維素的水解中，實(shí)驗(yàn)觀察到添加磺化木質(zhì)素可使預(yù)處理后的白楊樹(shù)和美國(guó)黑松的葡萄糖產(chǎn)率分別提高了25.9％和31.8％(biotechnologyforbiofuels,2013.6:1-10.)。

lin等將一種由酶解木質(zhì)素和聚乙二醇通過(guò)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)合成的水溶性的木質(zhì)素聚氧乙烯醚(ehl-peg)用于促進(jìn)玉米秸稈的酶解糖化。在ehl-peg作用下，玉米秸稈的72h酶解效率從16.7％提高到70.1％，而peg4600為52.3％。當(dāng)木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素含量越高，ehl-peg強(qiáng)化酶解的效果比peg4600越顯著(bioresourcetechnology,2015,185:165-170.)。

但是這些研究只是將木質(zhì)素改性后應(yīng)用于促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶解，并沒(méi)有在酶解結(jié)束后將仍然具有活性的纖維素酶加以回收利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服木質(zhì)纖維素酶解工藝現(xiàn)有技術(shù)所存在的酶解效率低和纖維素酶用量大等缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種不僅可以有效地提高木質(zhì)纖維素的酶解效率，回收纖維素酶，而且擴(kuò)大了工業(yè)木質(zhì)素的應(yīng)用，不需要額外的設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，綠色環(huán)保的利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解并回收纖維素酶的方法。

本發(fā)明方法首次提出了利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶解并通過(guò)簡(jiǎn)單的調(diào)節(jié)ph回收纖維素酶的方法。本發(fā)明以制漿造紙副產(chǎn)物木質(zhì)素或酶解木質(zhì)素為原料，經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)改性成ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑，將其用于強(qiáng)化木質(zhì)纖維素的酶解和纖維素酶的回收。本發(fā)明木質(zhì)素兩性表面活性劑不僅能回收纖維素酶，而且其自身也可以回收后循環(huán)利用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)：

利用ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的方法，包括以下步驟：將木質(zhì)纖維素加入緩沖溶液中，再加入ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑和纖維素酶，控制混合溶液的ph為4.0～6.2，加熱至40～60℃溫度下反應(yīng)24～96h，得到木質(zhì)纖維素的糖化水解液，通過(guò)固液分離后得到酶解液體，再調(diào)節(jié)酶解液體ph使ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑和纖維素酶沉淀出來(lái)，循環(huán)利用。

為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑為工業(yè)木質(zhì)素或木質(zhì)素的衍生物為原料經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)引入陽(yáng)離子基團(tuán)和/或陰離子基團(tuán)得到的具有ph響應(yīng)的木質(zhì)素兩性表面活性劑，其中陰離子基團(tuán)為羧基、磺酸基或磷酸基；所述陽(yáng)離子基團(tuán)為季銨基或胺基。

優(yōu)選地，所述工業(yè)木質(zhì)素為堿木質(zhì)素、有機(jī)溶劑木質(zhì)素或生物質(zhì)煉制木質(zhì)素，木質(zhì)素的衍生物為木質(zhì)素磺酸鹽、木質(zhì)素羧酸鹽、木質(zhì)素磷酸鹽、木質(zhì)素季銨鹽或木質(zhì)素胺鹽。

優(yōu)選地，所述ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑為磺化季銨化木質(zhì)素、磺化胺化木質(zhì)素、硫酸化季銨化木質(zhì)素、硫酸化胺化木質(zhì)素、磷酸化季銨化木質(zhì)素、磷酸化胺化木質(zhì)素、羧化季銨化木質(zhì)素或羧化胺化木質(zhì)素。

優(yōu)選地，所述ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑中陰離子或陽(yáng)離子基團(tuán)的含量均大于0.3mmol/g木質(zhì)素。ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑中不同陰陽(yáng)離子基團(tuán)的含量為0.3～3mmol/g木質(zhì)素可保證木質(zhì)素兩性表面活性劑ph響應(yīng)的靈敏性。

優(yōu)選地，所述再調(diào)節(jié)酶解液體ph使ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑和纖維素酶沉淀出來(lái)的ph值取值為2.5-10.0。

優(yōu)選地，酶解結(jié)束后通過(guò)固液分離得到酶解液體的方法為自然沉降法、傾析法、過(guò)濾法、其特征在于，所述離心法或這些方法的聯(lián)合使用。

優(yōu)選地，所述木質(zhì)纖維素為松木、桉木、楊木、水曲柳、沙棘、伯樹(shù)、杉木、樺木、玉米芯、玉米秸稈、麥稈、甘蔗渣、稻草、稻殼、食用菌基質(zhì)和花生殼中的至少一種。

優(yōu)選地，所述緩沖液的量為木質(zhì)纖維素質(zhì)量的5～50倍，ph響應(yīng)型兩性表面活性劑與木質(zhì)纖維素的質(zhì)量比為2～40：100。本發(fā)明緩沖溶液為常規(guī)纖維素酶適用緩沖溶液系統(tǒng)即可，如ph＝4.5～6.2，離子強(qiáng)度為5～200mmol/l的緩沖液。優(yōu)選為醋酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或磷酸鹽緩沖液。

優(yōu)選地，所述纖維素酶的用量以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計(jì)為3～30fpu/g。

本發(fā)明ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑在酶解的ph范圍內(nèi)(4.0～6.2)完全溶解在緩沖液中，酶解結(jié)束后，通過(guò)調(diào)高或調(diào)低酶解液體的ph(ph>6.2或ph<4.0)可以方便地從溶液中沉淀出來(lái)。調(diào)節(jié)酶解液體的ph值最低不超過(guò)2.5，最高不超過(guò)10.0。過(guò)高和過(guò)低的ph值都會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的失活。所述的調(diào)節(jié)酶解液體中可能用到的酸為有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸(如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸、馬來(lái)酸等)；可能用到的堿為常規(guī)的堿(如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氧化鈣，氫氧化鈣等)。

本發(fā)明的機(jī)理為：由于ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑的溶解度可以隨ph調(diào)節(jié)，當(dāng)ph在4.0～6.2時(shí)，ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑完全溶解于緩沖液中，減少纖維素酶在木質(zhì)素上的無(wú)效吸附，促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶解；當(dāng)ph>6.2或ph<4.0時(shí)，ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑析出，由于其與纖維素酶存在一定的相互作用(靜電作用、疏水作用、氫鍵作用)，所以在ph響應(yīng)型兩性表面活性劑析出時(shí)會(huì)將溶液中的纖維素酶一起沉淀下來(lái)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)本發(fā)明以ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑作為酶解助劑，對(duì)純纖維素的酶解沒(méi)有抑制作用，可使木質(zhì)纖維素的酶解糖化得率提高16.9～78.7％。

(2)本發(fā)明中回收纖維素酶的操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、不需要額外的設(shè)備，只需要簡(jiǎn)單的調(diào)節(jié)ph就可以快速地回收纖維素酶。

(3)本發(fā)明以工業(yè)木質(zhì)素和木質(zhì)素衍生物為原料，將其應(yīng)用于強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解和纖維素酶的回收，避免了環(huán)境污染，有利于生物質(zhì)資源的綜合利用。

(4)本發(fā)明與目前普遍研究的將纖維素酶固定在溫度響應(yīng)或ph響應(yīng)聚合物上來(lái)回收纖維素酶相比可以避免纖維素酶在固定反應(yīng)過(guò)程中的失活。

附圖說(shuō)明

圖1是tcsl-n28在純水中的ph響應(yīng)性情況圖；

圖2是ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。下列實(shí)施例中所用試劑均可從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)得到。實(shí)施例中的微晶纖維素型號(hào)為ph101(購(gòu)自西格瑪奧德里奇)，纖維素酶是目前被廣泛使用的cellicctec2，底物包含有稀酸預(yù)處理的桉木(桉木-da)和酸性亞硫酸法處理過(guò)的松木(松木-sporl)。實(shí)施例水解液中葡萄糖濃度是通過(guò)生物傳感分析儀(sba-40e，山東省生物科學(xué)研究院)測(cè)定的。

實(shí)施例涉及到三種ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑，一種是由磺化木質(zhì)素(tcsl，湖南通道神華林木有限公司生產(chǎn))季銨化得到，等電點(diǎn)小于4.0；一種是由堿木質(zhì)素(kl，湖南湘江紙業(yè)有限公司生產(chǎn))季銨化得到，等電點(diǎn)大于7.0。一種是由木質(zhì)素磺酸鈉(sl，來(lái)源于楊木酸性亞硫酸鈉造紙廢液，由吉林石峴紙業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))胺化得到，等電點(diǎn)小于4.0。三種ph響應(yīng)型木質(zhì)素兩性表面活性劑的具體合成方法如下：

季銨化磺化木質(zhì)素(tcsl-nx)：配制ph＝12的350gtcsl水溶液(tcsl占溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，用水浴鍋將溫度升到80℃后，用蠕動(dòng)泵將1.0769xg質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時(shí)加入0.3721xg質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的naoh水溶液，再繼續(xù)滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液后，在80℃下反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，將得到的反應(yīng)液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝3，使產(chǎn)品析出；x為(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨占tcsl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，x的取值范圍為10～80。

季銨化堿木質(zhì)素(kl-n40)：配制ph＝12的350gkl水溶液(kl占溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，用水浴鍋將溫度升到80℃后，用蠕動(dòng)泵將43.08g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時(shí)加入22.91g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的naoh水溶液，再繼續(xù)滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液后，在80℃下反應(yīng)3個(gè)小時(shí)，將得到的反應(yīng)液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝7，使產(chǎn)品析出。

胺化木質(zhì)素磺酸鈉(asl)：配制ph＝12的50gsl水溶液(sl占溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％)，倒入100ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，設(shè)定水浴鍋的溫度為80℃，當(dāng)溫度升到50℃-55℃，加入1.5g甲醛溶液(甲醛沸點(diǎn)低，溫度低加入)，待溫度上升到80℃后，加入對(duì)應(yīng)的3.657g二乙胺，在80℃下反應(yīng)4h，將得到的反應(yīng)液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝3，使產(chǎn)品析出。

實(shí)施例1

取100質(zhì)量份微晶纖維素，加入到5000質(zhì)量份ph為4.8，離子強(qiáng)度為50mmol/l的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份tcsl-n25，再加入10fpu/g以微晶纖維素質(zhì)量計(jì)的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離獲得酶解液，將酶解液體的ph調(diào)至2.8，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進(jìn)行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解24h(不補(bǔ)充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過(guò)生物傳感分析儀測(cè)定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

實(shí)施例2

取100質(zhì)量份桉木-da，加入到5000質(zhì)量份ph為4.8，離子強(qiáng)度為25mmol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入25質(zhì)量份tcsl-n28，再加入20fpu/g以底物中葡聚糖計(jì)的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進(jìn)行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補(bǔ)充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過(guò)生物傳感分析儀測(cè)定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

實(shí)施例3

取500質(zhì)量份松木-sporl，加入到5000質(zhì)量份ph為5.5，離子強(qiáng)度為5mmol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，加入10質(zhì)量份tcsl-n30，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖計(jì)的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進(jìn)行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解72h(不補(bǔ)充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過(guò)生物傳感分析儀測(cè)定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

實(shí)施例4

取100質(zhì)量份桉木-da，加入到5000質(zhì)量份ph為4.0，離子強(qiáng)度為5mmol/l的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入10質(zhì)量份kl-n40，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖計(jì)的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至7.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進(jìn)行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補(bǔ)充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過(guò)生物傳感分析儀測(cè)定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

實(shí)施例5

取100質(zhì)量份微晶纖維素，加入到5000質(zhì)量份ph為4.8，離子強(qiáng)度為5mmol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入25質(zhì)量份tcsl-n28，再加入20fpu/g以微晶纖維素質(zhì)量計(jì)的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進(jìn)行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補(bǔ)充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過(guò)生物傳感分析儀測(cè)定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

實(shí)施例6

取250質(zhì)量份桉木-da，加入到5000質(zhì)量份ph為6.0，離子強(qiáng)度為5mmol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，加入15質(zhì)量份asl，再加入20fpu/g以底物中葡聚糖計(jì)的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)48h，反應(yīng)結(jié)束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.2，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進(jìn)行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補(bǔ)充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過(guò)生物傳感分析儀測(cè)定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的情況

根據(jù)表1中可以看出，木質(zhì)素兩性表面活性劑可以有效地促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶解，并且可以回收一定的纖維素酶，同時(shí)木質(zhì)素兩性表面活性劑也可以在過(guò)程中得到循環(huán)利用。

圖1是tcsl-n28在純水中的ph響應(yīng)性情況圖，說(shuō)明了tcsl-n28具有靈敏的ph響應(yīng)性，在ph>4.0時(shí)溶解，在ph<4.0時(shí)沉淀。

圖2是木質(zhì)素兩性表面活性劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解和通過(guò)調(diào)節(jié)ph來(lái)回收纖維素酶的工藝流程圖，過(guò)程中沒(méi)有涉及到復(fù)雜的工藝，不需要額外的設(shè)備，能耗低，綠色環(huán)保。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。