一種細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的方法與流程

本發(fā)明涉及一種細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的方法，用于細(xì)菌檢測(cè)的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

細(xì)菌性疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，僅細(xì)菌性食源性致病菌每年約導(dǎo)致美國(guó)360萬(wàn)人患病，3.6萬(wàn)人住院，861人死亡。中國(guó)每年細(xì)菌性食源性疾病發(fā)病人數(shù)約9411.7萬(wàn)人次，其中2475.3萬(wàn)患者就診，335.7萬(wàn)患者因病住院，8530例患者死亡。

致病菌的檢測(cè)是細(xì)菌性疾病預(yù)防控制和相關(guān)研究的基石，主要檢測(cè)對(duì)象為臨床樣本和非臨床樣本(環(huán)境、食品和媒介生物體等樣本)。分離培養(yǎng)技術(shù)是早期出現(xiàn)的致病菌檢測(cè)技術(shù)，以分離和鑒定兩個(gè)基本步驟為基礎(chǔ)，增加增菌步驟，有利于恢復(fù)受損菌體和低載量目標(biāo)菌，同時(shí)可抑制競(jìng)爭(zhēng)性雜菌生長(zhǎng)，從而提高檢測(cè)敏感性。

分離培養(yǎng)技術(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)方法已被廣泛應(yīng)用于各層級(jí)實(shí)驗(yàn)室，但其增菌、分離及鑒定的前處理步驟大多需要人工操作，程序較復(fù)雜，即使目前有自動(dòng)化的接種儀器和飛行質(zhì)譜鑒定設(shè)備以及上述兩種設(shè)備的聯(lián)用系統(tǒng)等可代替部分人力，但總體上因分離培養(yǎng)技術(shù)自身程序的復(fù)雜性和昂貴的自動(dòng)化設(shè)備普及性受限，分離培養(yǎng)技術(shù)仍需占用大量人力，耗時(shí)較長(zhǎng)。

為了克服上述不足，在增菌方面，本申請(qǐng)人首次創(chuàng)新性研制了毛細(xì)管色譜式增菌法，利用半固體凝膠的分子吸附原理將選擇性增菌劑固定于毛細(xì)管中作為固定相，以此預(yù)制毛細(xì)管為“色譜柱”，以樣本增菌液混合液為進(jìn)樣源，利用帶鞭毛目標(biāo)菌自身的動(dòng)力，在毛細(xì)管中由進(jìn)樣端向遠(yuǎn)端高效地將目標(biāo)菌從混合菌群中色譜式增菌，且同時(shí)可實(shí)現(xiàn)預(yù)增菌與增菌兩步合并進(jìn)行，可節(jié)約大量的人力和時(shí)間，已獲相關(guān)授權(quán)專利5項(xiàng)。

在分離鑒定方面，致病菌分離培養(yǎng)技術(shù)的部分步驟可以被分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)替代，以便于節(jié)約人力、加快檢測(cè)速度。增菌步驟無(wú)法由兩種技術(shù)替代，因兩種技術(shù)的靈敏性仍有一定局限性(檢出限較高)，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)不同菌屬(種)的檢出限為10¹-10³cfu/ml。

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的核心部分是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)，主要包括普通pcr、實(shí)時(shí)熒光定量pcr和以及其他基于pcr的技術(shù)。目前已有dupont公司的系列產(chǎn)品、bio-rad公司的iq-系列產(chǎn)品和thermofisherscientific公司的suretect^tm系列產(chǎn)品和cepheid公司的gene系列產(chǎn)品等實(shí)現(xiàn)了一定程度的自動(dòng)化。但是上述產(chǎn)品均未包括增菌過(guò)程，仍需要進(jìn)行一定的人工輔助操作。

綜上所述，對(duì)于致病菌檢測(cè)，毛細(xì)管色譜式增菌法一定程度簡(jiǎn)化了增菌的過(guò)程，但仍需配以后續(xù)繁雜的分離鑒定步驟。pcr技術(shù)在節(jié)約人力和降低檢測(cè)成本方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，但是仍需要輔以增菌過(guò)程，需幾步人工輔助。目前細(xì)菌的檢測(cè)仍然過(guò)程較為復(fù)雜，時(shí)間和人力成本占用較多。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了徹底替代細(xì)菌檢測(cè)過(guò)程中的人工操作，節(jié)約時(shí)間和人力成本，本發(fā)明旨在提供一種細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)菌樣本的自動(dòng)化檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

一種細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的方法，包括以下步驟：增菌過(guò)程管道化、dna提取過(guò)程管道化和pcr反應(yīng)過(guò)程管道化；

所述增菌過(guò)程管道化包括以下步驟：配制增菌基質(zhì)，然后將增菌基質(zhì)填裝入細(xì)管中；

所述dna提取過(guò)程管道化包括以下步驟：將dna提取液填裝入細(xì)管中，然后用密封膜密封細(xì)管兩端；

所述pcr反應(yīng)過(guò)程管道化包括以下步驟：將pcr反應(yīng)試劑填裝入細(xì)管中；

將增菌過(guò)程管道化中的細(xì)管一端插入樣本增菌液中進(jìn)行增菌；增菌結(jié)束后，采用傳動(dòng)裝置驅(qū)動(dòng)取菌針環(huán)，將增菌過(guò)程管道化的細(xì)管中的菌液轉(zhuǎn)移至dna提取過(guò)程管道化的細(xì)管中；所述菌液在dna提取過(guò)程管道化中的細(xì)管中進(jìn)行dna提??；提取結(jié)束后，采用注射泵將dna提取過(guò)程管道化的細(xì)管中的提取液轉(zhuǎn)移至pcr反應(yīng)過(guò)程管道化的細(xì)管中進(jìn)行pcr反應(yīng)；pcr反應(yīng)結(jié)束后，熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)或通過(guò)電泳檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物。

為了更好地應(yīng)用該方法，在該方法中使用自動(dòng)細(xì)菌微流控集成檢測(cè)裝置，該裝置包括：微型管道集成系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)和控制系統(tǒng)；

其中，所述微型管道集成系統(tǒng)包括取菌針環(huán)、增菌細(xì)管、dna提取管和pcr反應(yīng)管；沿增菌細(xì)管長(zhǎng)度方向上且在增菌細(xì)管的上部設(shè)置第一連接管，在增菌細(xì)管的下部、與第一連接管相對(duì)的位置處設(shè)置第二連接管，所述第二連接管通過(guò)dna提取管與pcr反應(yīng)管相連接；所述取菌針環(huán)位于第一連接管內(nèi)且位于增菌細(xì)管上方；

所述微流控系統(tǒng)包括傳動(dòng)裝置和注射泵；

所述控制系統(tǒng)用于控制傳動(dòng)裝置以驅(qū)動(dòng)取菌針環(huán)穿過(guò)增菌細(xì)管取菌液后達(dá)到dna提取管，所述控制系統(tǒng)還用于控制注射泵以將dna提取管中的設(shè)定量的液體轉(zhuǎn)移到pcr反應(yīng)管中。

優(yōu)選的，所述第一連接管的頂端采用密封膜密封。

優(yōu)選的，第一連接管與增菌細(xì)管的接觸部位采用密封膜密封(或隔開(kāi))，使第一連接管與增菌細(xì)管成為兩個(gè)獨(dú)立的封閉空間。

優(yōu)選的，所述增菌細(xì)管與第二連接管的接觸部位采用密封膜密封(或隔開(kāi))，使增菌細(xì)管與第二連接管成為兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的封閉空間；當(dāng)然，為了使得結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單，該密封膜結(jié)構(gòu)可省略。

優(yōu)選的，第二連接管與dna提取管的連接處采用密封膜密封，使第二連接管與dna提取管成為兩個(gè)獨(dú)立的封閉空間。

優(yōu)選的，所述取菌針環(huán)是由柄基、接種環(huán)和針狀部件依次相連構(gòu)成的。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述針狀部件為針。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述取菌針環(huán)的柄基頂端與傳動(dòng)裝置相連。

優(yōu)選的，所述增菌細(xì)管，包括細(xì)管以及用于裝填細(xì)管中的含有選擇性增菌劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的半固體凝膠；或者，所述增菌細(xì)管，包括細(xì)管以及用于裝填細(xì)管中的吸附有選擇性性增菌劑的大分子吸附材料、營(yíng)養(yǎng)液。

優(yōu)選的，所述第一連接管、增菌細(xì)管和第二連接管的集成為一體形成，或者，各個(gè)部分是可拆卸的。

進(jìn)一步優(yōu)選的，當(dāng)各個(gè)部分是可拆卸時(shí)，第一連接管和第二連接管通過(guò)四通接頭與增菌細(xì)管相連接，其中接頭將增菌細(xì)管分成兩段細(xì)管。

優(yōu)選的，所述第二連接管上設(shè)有氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔。

優(yōu)選的，所述dna提取管，包括細(xì)管、用于裝填細(xì)管中的dna提取液和用于密封細(xì)管兩端的密封膜；或者，所述dna提取管，是由兩根細(xì)管連接而成，其中一根細(xì)管裝填溶菌酶，另一根細(xì)管中裝填dna提取液。

優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)管，包括細(xì)管、用于裝填細(xì)管中的pcr反應(yīng)試劑；或者，進(jìn)一步包括裝填細(xì)管中的熒光檢測(cè)相關(guān)試劑。

優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)管末端內(nèi)部設(shè)有微孔濾芯。

優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)管通過(guò)二通閥與注射泵相連。

優(yōu)選的，所述dna提取管與pcr反應(yīng)管之間設(shè)有三通閥。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：

本發(fā)明可以代替原有細(xì)菌檢測(cè)過(guò)程中仍需要人工增菌的繁雜的操作過(guò)程，將增菌過(guò)程、dna提取過(guò)程和pcr反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行集成一體化，可節(jié)約時(shí)間和人力成本，此外自動(dòng)化操作可降低人工操作中的失誤幾率，進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。結(jié)合pcr反應(yīng)的快速檢測(cè)能力，能夠?yàn)榕R床診斷或細(xì)菌傳染源的快速鎖定提供快速的技術(shù)支持，有利于及早地循證診療，提高治療的有效性；或者及早地發(fā)現(xiàn)傳染源，避免疫情的進(jìn)一步擴(kuò)大，降低更多的高危人群的感染風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1和圖2是本發(fā)明自動(dòng)細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3是接通狀態(tài)下的三通閥的剖視側(cè)視圖。

圖4是未接通狀態(tài)下的三通閥的剖視側(cè)視圖。

圖5是三通閥的俯視圖。

圖6是接通狀態(tài)下的二通閥的剖視側(cè)視圖。

圖7是未接通狀態(tài)下的二通閥的剖視側(cè)視圖。

圖8是二通閥的俯視圖。

其中，1、取菌針環(huán)，1-1、柄基，1-2、接種環(huán)，1-3、針，2、增菌細(xì)管，3、dna提取管，4、pcr反應(yīng)管，5、第一連接管，6、接頭，7、第二連接管，8、凍干溶菌酶，9、精密傳動(dòng)裝置，10、精密注射泵，11、三通閥，11-1、第一定子，11-2、第一轉(zhuǎn)子，11-3、第一轉(zhuǎn)軸，11-4、第二孔道，11-5、第二孔道，11-6、板扣，12、二通閥，12-1、第二定子，12-2、第二轉(zhuǎn)子，12-3、第二轉(zhuǎn)軸，12-4、第三孔道，12-5、凹槽。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是示例性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)中使用術(shù)語(yǔ)“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)中所介紹的，現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)菌的檢測(cè)過(guò)程仍然較為復(fù)雜，時(shí)間和人力成本占用較多，為了解決如上的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的方法，該方法包括以下步驟：增菌過(guò)程管道化、dna提取過(guò)程管道化和pcr反應(yīng)過(guò)程管道化；

所述增菌過(guò)程管道化包括以下步驟：配制增菌基質(zhì)，然后將增菌基質(zhì)填裝入細(xì)管中；

所述dna提取過(guò)程管道化包括以下步驟：將dna提取液填裝入細(xì)管中，然后用密封膜密封細(xì)管兩端；

所述pcr反應(yīng)過(guò)程管道化包括以下步驟：將pcr反應(yīng)試劑填裝入細(xì)管中；

將增菌過(guò)程管道化中的細(xì)管一端插入樣本增菌液中進(jìn)行增菌；增菌結(jié)束后，采用傳動(dòng)裝置驅(qū)動(dòng)取菌針環(huán)，將增菌過(guò)程管道化的細(xì)管中的菌液轉(zhuǎn)移至dna提取過(guò)程管道化的細(xì)管中；所述菌液在dna提取過(guò)程管道化中的細(xì)管中進(jìn)行dna提?。惶崛〗Y(jié)束后，采用注射泵將dna提取過(guò)程管道化的細(xì)管中的提取液轉(zhuǎn)移至pcr反應(yīng)過(guò)程管道化的細(xì)管中進(jìn)行pcr反應(yīng)；pcr反應(yīng)結(jié)束后，熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)或通過(guò)電泳檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述增菌基質(zhì)為含有選擇性增菌劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的半固體凝膠，或者是，所述增菌基質(zhì)為大孔吸附材料和含有選擇性增菌劑的培養(yǎng)基。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述dna提取過(guò)程管道化包括以下步驟：將溶菌酶和dna提取液填裝入細(xì)管中，然后用密封膜密封細(xì)管兩端。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述pcr反應(yīng)過(guò)程管道化包括以下步驟：將pcr反應(yīng)試劑和熒光檢測(cè)試劑填裝入細(xì)管中。具體的技術(shù)方案是：將pcr反應(yīng)試劑或pcr反應(yīng)試劑和熒光檢測(cè)試劑溶解后，冷凍干燥包被于細(xì)管內(nèi)的表面上。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，還包括使用增菌培養(yǎng)控溫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位增菌培養(yǎng)。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，還包括使用dna提取控溫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位dna提取。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，還包括使用pcr反應(yīng)控溫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位pcr反應(yīng)。

本發(fā)明還提供上述方法使用的細(xì)菌微流控集成檢測(cè)裝置，如圖1和圖2所示，該裝置包括：微型管道集成系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)和控制系統(tǒng)。

其中，所述微型管道集成系統(tǒng)包括取菌針環(huán)1、增菌細(xì)管2、dna提取管3、pcr反應(yīng)管4、第一連接管5和第二連接管7；沿增菌細(xì)管2長(zhǎng)度方向上且在增菌細(xì)管2的上部設(shè)置第一連接管5，在增菌細(xì)管2的下部、與第一連接管5相對(duì)的位置處設(shè)置第二連接管7，所述第二連接管7通過(guò)dna提取管3與pcr反應(yīng)管4相連接；所述取菌針環(huán)1位于第一連接管5內(nèi)且位于增菌細(xì)管2上方。第一連接管5的中心線和第二連接管7的中心線所屬一條直線，保證取菌針環(huán)1能夠順利從第一連接管5中通過(guò)第二連接管7進(jìn)入dna提取管，否則，無(wú)法實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程。

其中，所述微流控系統(tǒng)包括精密傳動(dòng)裝置9和精密注射泵10。

在本發(fā)明的優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述精密傳動(dòng)裝置9可選擇為直線式驅(qū)動(dòng)馬達(dá)，該設(shè)備為現(xiàn)有技術(shù)。

其中，所述控制系統(tǒng)用于控制精密傳動(dòng)裝置9以驅(qū)動(dòng)取菌針環(huán)1穿過(guò)增菌細(xì)管2取菌液，所述控制系統(tǒng)還用于控制所述精密注射泵10以將dna提取管3中的設(shè)定量的液體轉(zhuǎn)移到pcr反應(yīng)管4中，所述精密注射泵10與pcr反應(yīng)管的末端相連接，以將dna提取管中的液體吸入到pcr反應(yīng)管中。本發(fā)明采用的精密注射泵為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的實(shí)驗(yàn)儀器，特點(diǎn)是：電機(jī)驅(qū)動(dòng)螺桿(導(dǎo)向螺桿)慢慢旋轉(zhuǎn)，將注射器的活塞推入，并且將注射液推出；當(dāng)電機(jī)反向旋轉(zhuǎn)可以回吸液體。

在本發(fā)明中，為了防止雜菌污染，部件的頂端或末端，各個(gè)部件的連接處需要進(jìn)行密封。如下所述：

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述第一連接管5的頂端采用密封膜密封，防止外界的雜菌進(jìn)入第一連接管5中污染取菌針環(huán)1。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述第一連接管5與增菌細(xì)管2的接觸部位采用密封膜密封(或隔開(kāi))，使第一連接管5與增菌細(xì)管5成為兩個(gè)獨(dú)立的封閉空間，以防止增菌細(xì)管2中的待檢測(cè)菌污染取菌針環(huán)1?；蛘?，直接在取菌針環(huán)1下部處采用密封膜密封，從而使第一連接管5中的取菌針環(huán)1與增菌細(xì)管2隔開(kāi)。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述增菌細(xì)管2與第二連接管7的接觸部位采用密封膜密封(或隔開(kāi))，使增菌細(xì)管2與第二連接管7成為兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的封閉空間；當(dāng)然，為了使得結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單，該密封膜結(jié)構(gòu)也可省略。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，第二連接管7與dna提取管3的連接處采用密封膜密封，使第二連接管7與dna提取管3成為兩個(gè)獨(dú)立的封閉空間。

在本發(fā)明中，所述取菌針環(huán)1是由柄基1-1、接種環(huán)1-2和針狀部件依次相連構(gòu)成的，該針狀部件可為帶有針狀結(jié)構(gòu)的部件，但是并沒(méi)有特別的限定，只要是能穿破第一連接管5與增菌細(xì)管2的連接處達(dá)到dna提取管3即可，針狀部件優(yōu)選為針1-3。所述取菌針環(huán)1的柄基1-1頂端與精密傳動(dòng)裝置9相連，其柄基1-1可露出第一連接管5外與精密傳動(dòng)裝置9相連，或者，柄基1-1完全在第一連接管5內(nèi)與精密傳動(dòng)裝置9相連；兩種連接方式均可。根據(jù)使用需要不同，可以有多種取量(1～10μl)的取菌針環(huán)。該取菌針環(huán)1能夠通過(guò)四通接頭6穿過(guò)增菌細(xì)管2到達(dá)dna提取管3。為了防止雜菌污染將取菌針環(huán)1設(shè)置于第一連接管5中。所述第一連接管5的頂端(是指精密傳動(dòng)裝置9的那一端)采用密封膜密封，與外界隔離。

在本發(fā)明中，所述增菌細(xì)管2，包括細(xì)管以及用于裝填細(xì)管中的含有選擇性增菌劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的半固體凝膠；或者，所述增菌細(xì)管2，包括細(xì)管以及用于裝填細(xì)管中的大孔吸附材料和含有選擇性增菌劑的培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，所述增菌細(xì)管2與第一連接管5和第二連接管7兩者的中心線所在直線的角度α為0＜α≤90°，優(yōu)選45°≤α≤90°，如圖1和2所示的角度。角度的選擇主要是考慮外置的溫度控制系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)形狀。

在本發(fā)明中，所述第一連接管5、增菌細(xì)管2和第二連接管7的集成為一體形成，或者，各個(gè)部分是可拆卸的。當(dāng)各個(gè)部分是可拆卸時(shí)，第一連接管5和第二連接管7通過(guò)接頭6(該接頭為四通接頭)與增菌細(xì)管2相連接，其中接頭6將增菌細(xì)管2分成兩段細(xì)管。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，增菌細(xì)管2與dna提取管3的第二連接管7上設(shè)有氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔，便于精密注射泵10吸液時(shí)壓力平衡。

在本發(fā)明中，所述dna提取管3，包括細(xì)管、用于裝填細(xì)管中的dna提取液和用于密封細(xì)管兩端的密封膜；或者，所述dna提取管3，是由兩根細(xì)管連接而成，其中一根細(xì)管裝填溶菌酶，另一根細(xì)管中裝填dna提取液，dna提取管3的兩端以及兩根細(xì)管的連接處均采用密封膜密封，如圖2所示。

在本發(fā)明中，所述pcr反應(yīng)管4，包括細(xì)管、用于裝填細(xì)管中的pcr反應(yīng)試劑；或者，進(jìn)一步包括裝填細(xì)管中的熒光檢測(cè)相關(guān)試劑。

在本發(fā)明中，所述的細(xì)管的內(nèi)徑均為1～8mm。在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述細(xì)管的內(nèi)徑為3～5mm。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述dna提取管3與pcr反應(yīng)管4之間設(shè)有三通閥11，三通閥11將兩管連通，在不使用該裝置時(shí)，三通閥11兩端的管道是不相連通的，只用使用時(shí)通過(guò)該三通閥11來(lái)連通。該三通閥11可采用電磁閥，通過(guò)控制系統(tǒng)來(lái)控制其關(guān)與閉，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)檢測(cè)的目的。三通閥顧名思義一共有三個(gè)口，其中兩個(gè)口與dna提取管3與pcr反應(yīng)管相連接，剩余一個(gè)口與外界空氣連通，目的是平衡精密注射泵10在吸液后的氣壓。該三通閥11可采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的三通電磁閥改進(jìn)而來(lái)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可常規(guī)改進(jìn)，只需將現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)的三通電磁閥改進(jìn)成為超小型三通電磁閥即可，三通電磁閥由控制系統(tǒng)控制開(kāi)與閉；或者由現(xiàn)有技術(shù)中高效液相色譜中使用的六通閥進(jìn)樣器改進(jìn)而來(lái)，所述三通閥11是通過(guò)中間的第一轉(zhuǎn)軸11-3將圓柱狀的第一定子11-1和圓柱狀的第一轉(zhuǎn)子11-2連接，第一轉(zhuǎn)子11-2可通過(guò)第一轉(zhuǎn)軸11-3轉(zhuǎn)動(dòng)；第一定子11-1和第一轉(zhuǎn)子11-2均設(shè)有沿長(zhǎng)度方向的第一孔道11-4，第一轉(zhuǎn)子11-2還設(shè)有連通外界大氣的第二孔道11-5。當(dāng)?shù)谝欢ㄗ?1-1和第一轉(zhuǎn)子11-2的兩第一孔道11-4在同一位置時(shí)，則連通，狀態(tài)結(jié)構(gòu)如圖3所示，兩孔道錯(cuò)開(kāi)時(shí)則關(guān)閉，狀態(tài)結(jié)構(gòu)如圖4所示。第一轉(zhuǎn)子12-2的柱體上設(shè)置凸起的板扣11-6用來(lái)旋轉(zhuǎn)第一轉(zhuǎn)子11-2，以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)，如圖5所示。

在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述pcr反應(yīng)管4末端內(nèi)部設(shè)有微孔濾芯，以緩沖外界氣體與內(nèi)部試劑的接觸。pcr反應(yīng)管4的末端通過(guò)二通閥12與精密注射泵10的吸液針相連接，不吸液時(shí)處于關(guān)閉狀態(tài)，吸液時(shí)開(kāi)通。其中所述二通閥12可采用現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的二通電磁閥改進(jìn)而來(lái)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可常規(guī)改進(jìn)，只需將現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)的二通電磁閥改進(jìn)成為超小型二通電磁閥即可，二通電磁閥由控制系統(tǒng)控制開(kāi)與閉；或者由現(xiàn)有技術(shù)中高效液相色譜中使用的六通閥進(jìn)樣器改進(jìn)而來(lái)，所述二通閥12是通過(guò)中間的第二轉(zhuǎn)軸12-3將圓柱狀的第二定子12-1和圓柱狀的第二轉(zhuǎn)子12-2連接，第二轉(zhuǎn)子12-2可通過(guò)第二轉(zhuǎn)軸12-3轉(zhuǎn)動(dòng)；第二定子12-1和第二轉(zhuǎn)子12-2均設(shè)有沿長(zhǎng)度方向的第三孔道12-4，當(dāng)?shù)诙ㄗ?2-1和第二轉(zhuǎn)子12-2的兩第三孔道12-4在同一位置時(shí)，則連通，狀態(tài)結(jié)構(gòu)如圖6所示，兩孔道錯(cuò)開(kāi)時(shí)則關(guān)閉，狀態(tài)結(jié)構(gòu)如圖7所示。第二轉(zhuǎn)子12-2的柱體上設(shè)置凹槽12-5用來(lái)旋轉(zhuǎn)第二轉(zhuǎn)子12-2，以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)，如圖8所示。二通閥12外徑與pcr反應(yīng)管等徑，在未與精密注射泵10相連接時(shí)，pcr反應(yīng)管4的末端口進(jìn)行無(wú)菌膜密封。

進(jìn)一步的，在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述自動(dòng)細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的裝置還包括精密溫度控制系統(tǒng)。所述精密溫度控制系統(tǒng)可為微型管道集成系統(tǒng)中的各個(gè)管道提供相應(yīng)的溫度，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)設(shè)置和實(shí)現(xiàn)，在此不再贅述。

進(jìn)一步的，在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述自動(dòng)細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的裝置還包括熒光檢測(cè)器，所述熒光檢測(cè)器對(duì)pcr反應(yīng)管中的反應(yīng)液進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

本發(fā)明中的自動(dòng)細(xì)菌微流控集成檢測(cè)的裝置的使用方法是：

使用時(shí)，使微型管道集成系統(tǒng)相應(yīng)的管道區(qū)域可匹配相應(yīng)的溫度，將增菌細(xì)管2的一端插入到樣本增菌液中，設(shè)定一定增菌時(shí)間，增菌時(shí)間達(dá)到預(yù)設(shè)時(shí)間后，精密傳動(dòng)裝置9驅(qū)動(dòng)取菌針環(huán)1穿過(guò)增菌細(xì)管2取一定量菌液后(取菌針環(huán)1容易穿透各個(gè)密封膜)，到達(dá)dna提取管3，dna提取管3可在設(shè)定溫度和時(shí)間條件下提取一定時(shí)間后，精密注射泵10將dna提取管3中的液體轉(zhuǎn)移一定量到pcr反應(yīng)管4中反應(yīng)，反應(yīng)后熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)或通過(guò)電泳檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的應(yīng)用實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的以上技術(shù)方案。

實(shí)施例1細(xì)菌微流控集成檢測(cè)沙門氏菌

1、增菌過(guò)程管道化：選取內(nèi)徑3mm、長(zhǎng)度10cm玻璃細(xì)管，填裝改良半固體四硫磺酸鈉煌綠培養(yǎng)基，所述改良半固體四硫磺酸鈉煌綠培養(yǎng)基是通過(guò)以下方法制備得到：取蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化鈉3.0g、碳酸鈣45.0g、瓊脂粉2.7g和蒸餾水1000ml加熱溶解后取900ml，加入100ml50％(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)硫代硫酸鈉溶液、20.0ml20％碘溶液(含25％碘化鉀)、2.0ml0.5％煌綠水溶液、50.0ml10％牛膽鹽溶液，混勻滅菌)。

2、dna提取過(guò)程管道化：選取內(nèi)徑5mm的聚丙烯管，填裝200μldna提取液(dna提取液配方：10mmol/ltri-hclph7.6，5mmol/ledta，0.5％sds)，兩端用聚乙烯膜密封。

3、pcr反應(yīng)過(guò)程管道化：選取與dna提取液兼容的50μl反應(yīng)體系的引物、dna聚合酶、脫氧核苷酸單體溶解后，冷凍干燥包被于3mm內(nèi)徑透明聚丙烯細(xì)管內(nèi)的表面上。

4、增菌過(guò)程、dna提取過(guò)程和pcr反應(yīng)過(guò)程的管道集成一體化：將5μl微型取菌針環(huán)1通過(guò)四通接頭6和第一連接管5與增菌細(xì)管2連接，取菌針環(huán)1孔的起始位置位于增菌細(xì)管2上部，環(huán)的上側(cè)能與四通接頭6的開(kāi)孔尺寸匹配，下側(cè)使用聚乙烯密封膜密封，取菌針環(huán)1的柄基1-1部用聚乙烯膜與第一連接管5頂部密封。將增菌細(xì)管2通過(guò)第二連接管7與dna提取管3連接，增菌細(xì)管2與dna提取管3的第二連接管7上留一個(gè)氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔，便于精密注射泵10吸液時(shí)壓力平衡。將dna提取管3通過(guò)三通閥11與pcr反應(yīng)管4通連接過(guò)，pcr反應(yīng)管4末端用微孔濾芯和一個(gè)凹槽式控制二通閥12，閥門外徑與pcr反應(yīng)管4等徑，末端口進(jìn)行無(wú)菌膜密封。

5、管道集成中自動(dòng)移液：直線式驅(qū)動(dòng)馬達(dá)(誤差≤0.5mm)驅(qū)動(dòng)取菌針環(huán)1穿過(guò)增菌細(xì)管2取5μl菌液后，到dna達(dá)提取管3。由精密注射泵10(移液誤差≤1μl)移取將dna提取管3中50μl的液體轉(zhuǎn)移pcr反應(yīng)管4中反應(yīng)。

6、增菌過(guò)程、dna提取過(guò)程和pcr反應(yīng)的原位執(zhí)行：集成管道的增菌細(xì)管2一頭插入到緩沖蛋白胨水增菌液中，使用培養(yǎng)控溫系統(tǒng)供溫36℃，24h對(duì)增菌管道實(shí)現(xiàn)原位增菌培養(yǎng)。使用dna提取控溫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位dna提取，95℃裂解30min后，降溫至4℃。使用pcr反應(yīng)控溫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位pcr反應(yīng)，反應(yīng)后電泳檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例2細(xì)菌微流控集成檢測(cè)金黃色葡萄球菌

1、增菌過(guò)程管道化：選取內(nèi)徑3mm、長(zhǎng)度10cm玻璃細(xì)管，依次填裝大孔吸附樹(shù)脂和7.5％氯化鈉肉湯(取蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉75g和蒸餾水1000ml加熱溶解后滅菌)。

2、dna提取過(guò)程管道化：5mg溶菌酶于冷凍干燥包被于2.5mm外徑的彈頭式轉(zhuǎn)運(yùn)架(即是子彈頭式的一個(gè)塑料支架，溶菌酶包被于其表面)表面，然后裝入3mm內(nèi)徑聚丙烯管，兩端用聚乙烯膜密封，選取內(nèi)徑5mm的聚丙烯管，填裝200μldna提取液(dna配方：10mmol/ltri-hclph7.6，5mmol/ledta，0.5％sds)，兩端用聚乙烯膜密封，并將兩個(gè)細(xì)管進(jìn)行焊接。

3、pcr反應(yīng)過(guò)程管道化：選取與dna提取液兼容的50μl反應(yīng)體系的引物、dna聚合酶、脫氧核苷酸單體和熒光檢測(cè)試劑溶解后，冷凍干燥包被于3mm內(nèi)徑透明聚丙烯細(xì)管內(nèi)的表面上。

4、增菌過(guò)程、dna提取過(guò)程和pcr反應(yīng)的管道集成一體化：將5μl微型取菌針環(huán)1通過(guò)四通接頭6和第一連接管5與增菌細(xì)管2連接，取菌針環(huán)1孔的起始位置位于增菌細(xì)管2上部，環(huán)的上側(cè)能與四通接頭6的開(kāi)孔尺寸匹配，下側(cè)使用聚乙烯密封膜密封，取菌針環(huán)1的柄基1-1部用聚乙烯膜與第一連接管5頂部密封。將增菌細(xì)管2通過(guò)第二連接管7與dna提取管3連接，增菌細(xì)管2與dna提取管3的第二連接管7上留一個(gè)氣壓平衡孔，以微孔濾膜封孔，便于精密注射泵10吸液時(shí)壓力平衡。將dna提取管3通過(guò)三通閥與pcr反應(yīng)管4通連接過(guò)，pcr管末端用微孔濾芯和一個(gè)凹槽式控制二通閥12，閥門外徑與pcr反應(yīng)管4等徑，末端口進(jìn)行無(wú)菌膜密封。

5、管道集成中自動(dòng)移液：直線式驅(qū)動(dòng)馬達(dá)(誤差≤0.5mm)驅(qū)動(dòng)取菌針環(huán)1穿過(guò)增菌細(xì)管2取5μl菌液后，到dna達(dá)提取管3(同時(shí)攜帶溶菌酶轉(zhuǎn)運(yùn)架進(jìn)入dna提取液)。由精密注射泵10(移液誤差≤1μl)移取將dna提取管3中50μl的液體轉(zhuǎn)移pcr反應(yīng)管4中反應(yīng)。

6、增菌過(guò)程、dna提取過(guò)程和pcr反應(yīng)的原位執(zhí)行：集成管道的增菌管一頭插入到7.5％氯化鈉肉湯增菌液中，使用培養(yǎng)控溫系統(tǒng)供溫36℃，18h對(duì)增菌管道實(shí)現(xiàn)原位增菌培養(yǎng)。使用dna提取控溫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位dna提取，37℃提取30min后，95℃滅活10min，降溫至4℃。使用pcr反應(yīng)控溫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)原位pcr反應(yīng)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。