細(xì)菌纖維素的制作方法

本申請(qǐng)是原申請(qǐng)、申請(qǐng)日為2013年12月27日，申請(qǐng)?zhí)枮?01380068766.7，發(fā)明名稱為“細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌，尤其涉及在液體中分散性優(yōu)異的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌纖維素通常由寬度為約50nm的微細(xì)纖維(納米纖維)構(gòu)成，具有高機(jī)械強(qiáng)度、生物適合性、生物降解性等特性，因此作為能夠用于各種產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的材料而受到關(guān)注。細(xì)菌纖維素通常通過(guò)對(duì)醋酸菌等細(xì)菌進(jìn)行靜置培養(yǎng)而在培養(yǎng)基表面以包含凝膠狀物質(zhì)的膜(以下稱為“凝膠狀膜”。)的形式而獲得，但該凝膠狀膜在作為材料應(yīng)用時(shí)缺乏成形性、與其它物質(zhì)的混合性，此外由于生產(chǎn)效率低而使成本變高，因此存在作為實(shí)用材料的應(yīng)用性匱乏這樣的問(wèn)題。對(duì)于這樣的問(wèn)題，期待一種非凝膠狀膜、作為材料的應(yīng)用性優(yōu)異的、分散在液體中的細(xì)菌纖維素。例如，非專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了一種通過(guò)對(duì)木醋桿菌sucrofermentans亞種(acetbacterxylinumsubsp.sucrofermentans)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素，此外，非專利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了一種在添加了羧甲基纖維素(cmc)的培養(yǎng)基中對(duì)木葡糖酸醋桿菌(gluconacetobacterxylinum)jcm10150株進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：吉永等、化學(xué)和生物、vol.35、no.11、第7～14頁(yè)、1997年非專利文獻(xiàn)2：s.warashina等、纖維素學(xué)會(huì)第17次大會(huì)2010celluloser&d講演要旨集、第98頁(yè)、2010年技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的課題但是，從并非使用添加了具有細(xì)菌纖維素的分散性提高效果的cmc的培養(yǎng)基而生產(chǎn)、以及在水中分散為“小的粒狀或纖維狀”(同一文獻(xiàn)；第9頁(yè)右欄)的記載可知，非專利文獻(xiàn)1所述的細(xì)菌纖維素在水中的分散性并不高。因此，在用于實(shí)用化的成形性、與其它物質(zhì)的混合性方面并不充分。此外，非專利文獻(xiàn)2所述的細(xì)菌纖維素在向cmc培養(yǎng)基的添加量為0.5％、1％、2％時(shí)，任一情況下，含有該細(xì)菌纖維素的水均是下部的白濁性高于上部、觀察到沉淀，并且纖維素粒子為能夠目視辨認(rèn)的程度的大小(同一文獻(xiàn)；fig.1)，因此在水中的分散性不高。因此，在實(shí)用化中所必須的成形性、與其它物質(zhì)的混合性方面并不充分。因此，非專利文獻(xiàn)1及非專利文獻(xiàn)2任一文獻(xiàn)中所述的細(xì)菌纖維素作為材料的成形性、與其它材料的混合性均不充分，在材料的生產(chǎn)效率方面也缺乏實(shí)用性。本發(fā)明是為了解決這樣的問(wèn)題而做出的發(fā)明，其目的在于提供一種在液體中的分散性高、實(shí)用化中的成形性和與其它材料的混合性均良好、作為實(shí)用材料的應(yīng)用性優(yōu)異的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌。用于解決課題的手段本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如下獲得的細(xì)菌纖維素在水中具有高分散性，由此完成了下述各發(fā)明：所述細(xì)菌纖維素通過(guò)將作為新的菌株的siid9587株(保藏號(hào)nitebp-01495)(以下，有時(shí)稱為“nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)”。)在含cmc的培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)而獲得，所述siid9587株以由植物油制造生物柴油燃料時(shí)產(chǎn)生的含甘油的副產(chǎn)物(biodieselfuelby-product；bdf-b、廢甘油)、試劑甘油或糖蜜為碳源的中間葡糖醋桿菌。(1)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素具有如下物性：含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率為35％以上。(2)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素進(jìn)而具有如下物性：在下述i)～vi)的條件下進(jìn)行的凝膠滲透色譜的色譜圖的峰頂(ピ一クトツプ)的保留體積為2.5ml以上且小于3.0ml。i)柱：填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內(nèi)徑為6.0mm及長(zhǎng)度為15cm的柱、ii)保護(hù)柱：內(nèi)徑為4.6mm、長(zhǎng)度為3.5cm、iii)柱溫度：35℃、iv)送液速度：0.07ml/分鐘、v)洗脫液：40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液、vi)洗脫液中的細(xì)菌纖維素的終濃度：0.2％(w/w)。(3)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素，優(yōu)選將bdf-b同化而生產(chǎn)。(4)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素，優(yōu)選將選自砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物及它們的水解物、以及異構(gòu)化糖中的1或2種以上同化而生產(chǎn)。(5)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素是將制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物同化而生產(chǎn)的情況下，前述副產(chǎn)物優(yōu)選為糖蜜。(6)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素也可以利用中間葡糖醋桿菌(gluconacetobacterintermedius)而生產(chǎn)。(7)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素也可以利用中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號(hào)nitebp-01495)而生產(chǎn)。(8)本發(fā)明的細(xì)菌的特征在于，生產(chǎn)前述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌纖維素。(9)本發(fā)明的細(xì)菌也可以是生產(chǎn)前述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌纖維素的中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號(hào)nitebp-01495)。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素，可以獲得幾乎均一分散在水等液體中的細(xì)菌纖維素，該細(xì)菌纖維素由于成形性、與其它物質(zhì)的混合性優(yōu)異，因此可以有助于最終制品的品質(zhì)、生產(chǎn)效率的提高或生產(chǎn)成本的降低。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以獲得無(wú)需利用混合器進(jìn)行微細(xì)化等工序而通過(guò)溫和條件下的精制即可幾乎均一地分散在液體中的細(xì)菌纖維素，可以獲得具有較大的平均分子量的細(xì)菌纖維素。進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)利用bdf-b、糖蜜等制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物作為碳源，有助于資源的有效利用且可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素的低價(jià)格化。此外，根據(jù)本發(fā)明還使用中間葡糖醋桿菌或中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)進(jìn)行生產(chǎn)，由此可以高效率地獲得大量的細(xì)菌纖維素。附圖說(shuō)明圖1是表示分離將bdf-b同化而生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌的步驟的圖。圖中，細(xì)菌纖維素簡(jiǎn)記為bc。圖2-1是示出siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株的16srdna堿基序列的一致點(diǎn)及不同點(diǎn)的圖。圖中，堿基序列的一致點(diǎn)用*標(biāo)記來(lái)表示，不同點(diǎn)用方框圍住來(lái)表示。此外，圖中，g.intermedius表示中間葡糖醋桿菌tf2株。圖2-2為示出siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株的16srdna堿基序列的一致點(diǎn)及不同點(diǎn)的圖。圖中，堿基序列的一致點(diǎn)用*標(biāo)記來(lái)表示，不同點(diǎn)用方框圍住來(lái)表示。此外，圖中，g.intermedius表示中間葡糖醋桿菌tf2株。圖3是示出siid9587株的細(xì)菌學(xué)性狀的圖。圖4是示出對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(上段圖)、以及將bdf-b及試劑甘油作為碳源進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的生產(chǎn)物(中段圖及下段圖)的ir譜圖的圖。圖5是示出分別包含對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)及進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(左圖及中央圖)、以及來(lái)自紙漿的細(xì)菌纖維素納米纖維(右圖)的水的外觀的圖。圖6是示出含有分別將糖蜜及試劑甘油作為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率以及細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)量(bc生產(chǎn)量)及生產(chǎn)速度(bc生產(chǎn)速度)的圖。圖7是示出含有對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的漢森葡糖醋桿菌(g.hansenii)atcc23769株、木葡糖醋桿菌(g.xylinus)atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率、以及bc生產(chǎn)量、bc生產(chǎn)速度及bc生產(chǎn)速度的比率的圖。圖8是示出將bdf-b作為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的而獲得的細(xì)菌纖維素(樣品b)、來(lái)自紙漿的纖維素納米纖維(來(lái)自紙漿的cnf液)及普魯蘭多糖的凝膠滲透色譜的色譜圖的圖。圖9是示出對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)(攪拌培養(yǎng)bc液)及靜置培養(yǎng)(混合器處理靜置培養(yǎng)bc液)而獲得的細(xì)菌纖維素的纖維寬度及利用透射型電子顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖10為示出對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(攪拌培養(yǎng)bc液)及來(lái)自紙漿的纖維素納米纖維(來(lái)自紙漿的cnf液)的利用透射型電子顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖11為示出對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素(攪拌培養(yǎng)bc液)及來(lái)自紙漿的纖維素納米纖維(來(lái)自紙漿的cnf液)的利用偏光顯微鏡獲得的觀察圖像的圖。圖12為示出將試劑甘油或bdf-b作為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的重量的圖。圖13為示出將試劑甘油或bdf-b作為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的atcc53582株及atcc23769株進(jìn)行振蕩培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的重量的圖。具體實(shí)施方式以下，對(duì)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明中的細(xì)菌纖維素是指利用細(xì)菌生產(chǎn)的纖維素。本發(fā)明中，細(xì)菌纖維素“分散”在水等液體中是指，細(xì)菌纖維素漂浮或懸浮在液體中。此外，分散性高是指，作為分散介質(zhì)的細(xì)菌纖維素在液體中的粒徑、纖維寬度較小、作為分散介質(zhì)的細(xì)菌纖維素較均一地漂浮或懸浮在液體中等。本發(fā)明的細(xì)菌纖維素具有幾乎均一地分散在液體中的程度的高分散性。這里，使細(xì)菌纖維素分散的液體可以使用有機(jī)溶劑及水系溶劑中的任一種，優(yōu)選水系溶劑。細(xì)菌纖維素的分散性的高低例如可以測(cè)定光透過(guò)率作為指標(biāo)，存在光透過(guò)率越大則分散性越高、光透過(guò)率越小則分散性越低這樣的關(guān)系。光透過(guò)率可以通過(guò)將含有規(guī)定濃度的細(xì)菌纖維素的水供于分光光度計(jì)并照射規(guī)定波長(zhǎng)的光、對(duì)透過(guò)的光的量進(jìn)行測(cè)定而求出。本發(fā)明的細(xì)菌纖維素具有如下性質(zhì)：含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率為35％以上。這里，作為本發(fā)明中的含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率，除了為35％以上，還可以列舉例如36％以上、37％以上、38％以上、39％以上、40％以上、35％以上且99％以下，36％以上且99％以下，37％以上且99％以下，38％以上且99％以下，40％以上且99％以下，35％以上且95％以下，36％以上且95％以下，37％以上且95％以下，38％以上且95％以下，40％以上且95％以下，35％以上且90％以下，36％以上且90％以下，37％以上且90％以下，38％以上且90％以下，40％以上且90％以下，35％以上且85％以下，36％以上且85％以下，37％以上且85％以下，38％以上且85％以下，40％以上且85％以下，35％以上且80％以下，36％以上且80％以下，37％以上且80％以下，38％以上且80％以下，40％以上且80％以下等。此外，本發(fā)明的細(xì)菌纖維素可以具有與來(lái)自紙漿的纖維素納米纖維等來(lái)自植物的纖維素相比大的平均分子量。纖維素的平均分子量可以例如測(cè)定凝膠滲透色譜的色譜圖作為指標(biāo)，存在所述色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積越大則平均分子量越小、保留體積越小則平均分子量越大這樣的關(guān)系。即，本發(fā)明的細(xì)菌纖維素還可以具有如下物性：在下述i)～vi)的條件下進(jìn)行的凝膠滲透色譜的色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積為2.5ml以上且小于3.0ml。i)柱為填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內(nèi)徑為6.0mm及長(zhǎng)度為15cm的柱、ii)保護(hù)柱的內(nèi)徑為4.6mm、長(zhǎng)度為3.5cm、iii)柱溫度為35℃、iv)送液速度為0.07ml/分鐘、v)洗脫液為40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液、vi)洗脫液中的細(xì)菌纖維素的終濃度為0.2％(w/w)。此外，本發(fā)明的細(xì)菌纖維素例如可以通過(guò)在含有適當(dāng)碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌使其生產(chǎn)細(xì)菌纖維素而制造。這里，作為碳源，可以列舉例如葡萄糖、果糖等單糖，蔗糖、麥芽糖、乳糖等二糖，低聚糖、砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物、它們的水解物、異構(gòu)化糖、淀粉水解物等糖類以及甘露糖醇、乙醇、乙酸、檸檬酸、甘油、bdf-b等，可以根據(jù)細(xì)菌的種類、培養(yǎng)條件、制造成本等適當(dāng)設(shè)定。予以說(shuō)明的是，bdf-b的常規(guī)組成是甘油41.5％、脂肪酸21.4％、甲醇12.4％、強(qiáng)熱殘留成分6.3％、其它18.4％(財(cái)團(tuán)法人日本食品分析中心)，是大量地含有能夠用作細(xì)菌的碳源的甘油的組合物。這里，砂糖是指以蔗糖為主成分的甘味料(廣辭苑第6版)，在本發(fā)明中既可以是化學(xué)合成品，也可以是以甘蔗、甜菜(糖蘿卜)、糖槭、桄榔(sugarpalm)、高粱(sweetsorghum)等天然物質(zhì)為原料而制造的砂糖。作為本發(fā)明中的砂糖，可以列舉例如紅糖、白糖、粗糖(cassonade)(紅糖)、和三盆、楓糖等未分蜜糖以及粗糖、精制糖等分蜜糖。作為精制糖，可以列舉例如白雙糖(shirozarasugar)、粗晶軟糖(coarsecrystalmediumsoftsugar)、細(xì)白砂糖(castersugar)等砂糖，上白糖、幼砂糖等綿白糖(softsugar)，方糖、冰糖、粉砂糖、顆粒糖等加工糖以及液體糖等。此外，制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物是指，在砂糖的制造工序中產(chǎn)生的副產(chǎn)物中的含有蔗糖的副產(chǎn)物，具體而言，可以列舉例如上述的甘蔗、甜菜等天然原料的榨渣、糖蜜、利用過(guò)濾和/或離子交換樹脂進(jìn)行的精制工序中產(chǎn)生的殘?jiān)４送?，二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物的水解物是指，在酸性溶液中對(duì)二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖時(shí)產(chǎn)生的含有蔗糖的副產(chǎn)物進(jìn)行加熱等水解處理而獲得的物質(zhì)。碳源以外的培養(yǎng)基成分可以使用與細(xì)菌培養(yǎng)中使用的公知的培養(yǎng)基同樣的成分，優(yōu)選含有cmc。具體而言，可以列舉例如含有cmc、氮源、無(wú)機(jī)鹽類、以及根據(jù)需要而含有的氨基酸、維生素等有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)素的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，作為氮源，可以列舉硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽，硝酸鹽、尿素、蛋白胨等有機(jī)或無(wú)機(jī)的氮源。此外，作為無(wú)機(jī)鹽類，可以列舉磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等，作為有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)素，可以列舉氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸、以及包含這些營(yíng)養(yǎng)素的蛋白胨、水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物等，在使用生育中需要氨基酸的營(yíng)養(yǎng)要求性變異株時(shí)，還可以進(jìn)一步補(bǔ)充所要求的營(yíng)養(yǎng)素。此外，作為細(xì)菌，只要是能生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌則沒(méi)有特別限定，優(yōu)選可以通過(guò)攪拌培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌，更優(yōu)選同化bdf-b的細(xì)菌。具體而言，可以列舉例如醋桿菌屬細(xì)菌、葡糖醋桿菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌、土壤桿菌屬細(xì)菌、根瘤菌屬細(xì)菌、腸桿菌屬細(xì)菌等，更具體而言，可以列舉中間葡糖醋桿菌、漢森葡糖醋桿菌、斯氏葡糖醋桿菌(gluconacetobacterswingsii)、巴氏醋桿菌(acetobacterpasteurianus)、醋化醋桿菌(acetobacteraceti)、木醋桿菌(acetobacterxylinum)、木醋桿菌sucrofermentans亞種(acetbacterxylinumsubsp.sucrofermentans)、木醋桿菌nonacetoxidans亞種(acetbacterxylinumsubsp.nonacetoxidans)、惡臭醋桿菌(acetobacterransens)、胃八疊球菌(sarcinaventriculi)、bacteriumxyloides、腸桿菌等，這些之中，優(yōu)選中間葡糖醋桿菌。進(jìn)而，更具體而言，可以列舉中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號(hào)nitebp-01495)、木葡糖醋桿菌atcc53582株、漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、斯氏葡糖醋桿菌bpr3001e株、木醋桿菌jcm10150株、腸桿菌cjf-002株等，這些之中，優(yōu)選中間葡糖醋桿菌siid9587株(nedo-01株)(保藏號(hào)nitebp-01495)。作為培養(yǎng)方法，可以列舉例如攪拌培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)等。作為攪拌培養(yǎng)，具體而言，可以列舉使用了發(fā)酵罐的不進(jìn)行通氣的培養(yǎng)(無(wú)通氣攪拌培養(yǎng))、使用了發(fā)酵罐的進(jìn)行通氣的培養(yǎng)(通氣攪拌培養(yǎng))、使用了帶槳葉的燒瓶的左右搖動(dòng)的培養(yǎng)(振蕩培養(yǎng))、使用了帶槳葉的燒瓶的旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)(旋轉(zhuǎn)培養(yǎng))等。此外，培養(yǎng)條件可以設(shè)定為上述細(xì)菌的培養(yǎng)中所使用的公知的培養(yǎng)條件，可以列舉例如通氣量為1～10l/分鐘、轉(zhuǎn)速為100～800rpm、溫度為20～40℃、培養(yǎng)期為1天～7天的培養(yǎng)條件。此外，在本發(fā)明的細(xì)菌纖維素的制造中，可以根據(jù)需要進(jìn)行碳源的前處理工序、前前培養(yǎng)工序、前培養(yǎng)工序、細(xì)菌纖維素的精制、干燥、懸浮工序等。本發(fā)明的細(xì)菌纖維素例如可以作為紙力增強(qiáng)劑、食品的增稠劑、懸浮穩(wěn)定化劑等添加劑而使用。其次，本發(fā)明的細(xì)菌是生產(chǎn)前述細(xì)菌纖維素的細(xì)菌。對(duì)于在生產(chǎn)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素的細(xì)菌中，與上述的本發(fā)明的細(xì)菌纖維素相同或相當(dāng)?shù)臉?gòu)成將省略重復(fù)說(shuō)明。以下，對(duì)本發(fā)明的細(xì)菌纖維素及生產(chǎn)該細(xì)菌纖維素的細(xì)菌的各實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。予以說(shuō)明的是，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例所示特征的限定。實(shí)施例<實(shí)施例1>細(xì)菌的分離及鑒定(1)細(xì)菌的分離對(duì)同化了bdf-b而生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的細(xì)菌進(jìn)行了分離。具體而言，按照?qǐng)D1所示的步驟，首先，以蘋果及西梅為分離源，使用在hestrin-schramm標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(組成：細(xì)菌蛋白胨0.5％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、na2hpo40.27％(w/v)、檸檬酸0.115％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)；hs培養(yǎng)基)中含有2％(w/v)的試劑甘油(試劑特級(jí)、和光純藥株式會(huì)社)來(lái)代替葡萄糖的培養(yǎng)基(hs/甘油培養(yǎng)基)進(jìn)行富集培養(yǎng)。將其接種在含有纖維素染色試劑的hs/甘油培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行平板培養(yǎng)，選擇出15種生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株。然后，將這些菌株接種到含有2％(w/v)的試劑甘油(試劑特級(jí)、和光純藥株式會(huì)社)的lb培養(yǎng)基(組成；胰蛋白胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、氯化鈉0.5％(w/v))中，在30℃下靜置培養(yǎng)，使其生成凝膠狀膜。測(cè)定凝膠狀膜的干燥重量(以下稱為“干燥膜重量”。)，選擇出8種干燥膜重量大的菌株，作為同化甘油且細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力高的菌。然后，接種到含有bdf-b的lb培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行平板培養(yǎng)，進(jìn)而，接種到hs培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行靜置培養(yǎng)，從而使其生成凝膠狀膜。選擇其中干燥膜重量大的菌株，用含有甘油的lb培養(yǎng)基或hs/甘油培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)后，用hs培養(yǎng)基反復(fù)進(jìn)行靜置培養(yǎng)操作，選定一種具有bdf-b同化性、且細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力高的菌株，將其作為siid9587株。(2)細(xì)菌的鑒定按照常規(guī)方法對(duì)本實(shí)施例1(1)的siid9587株進(jìn)行測(cè)序，確定了全長(zhǎng)16srdna的堿基序列(1367bp、序列號(hào)1)。然后，在technosurugalaboratoryco.，ltd中進(jìn)行了16srdna堿基序列解析及細(xì)菌學(xué)性狀試驗(yàn)。[2-1]16srdna堿基序列解析16srdna堿基序列解析試驗(yàn)使用apollo2.0(technosurugalaboratory社)作為軟件、使用apollodb-ba6.0(technosurugalaboratory社)及國(guó)際堿基序列數(shù)據(jù)庫(kù)(genbank/ddbj/embl)作為數(shù)據(jù)庫(kù)而進(jìn)行。相對(duì)于apollodb-ba6.0的同源性檢索的結(jié)果，siid9587株的16srdna堿基序列(序列號(hào)1)相對(duì)于葡糖醋桿菌屬的16srdna堿基序列顯示高同源性，相對(duì)于中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號(hào)y14694)的16srdna堿基序列顯示最高同源性，同源率為99.8％。此外，在相對(duì)于genbank/ddbj/embl的同源性檢索的結(jié)果中，siid9587株的16srdna堿基序列(序列號(hào)1)也相對(duì)于葡糖醋桿菌屬的16srdna堿基序列顯示出高同源性，相對(duì)于基準(zhǔn)株的中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號(hào)nr_026435)的16srdna堿基序列顯示高同源性，同源率為99.8％。予以說(shuō)明的是，登錄號(hào)y14694的序列和登錄號(hào)nr_026435的序列相同。siid9587株和中間葡糖醋桿菌tf2株(登錄號(hào)y14694、nr_026435)的16srdna堿基序列較結(jié)果如圖2-1及圖2-2所示。如圖2-1及圖2-2所示，兩者間有4個(gè)堿基不同。此外，在相對(duì)于apollodb-ba6.0的同源性檢索中，在基于同源性高的排在前面的15株的16srdna堿基序列的簡(jiǎn)易分子系統(tǒng)解析的結(jié)果中，siid9587株包含在由葡糖醋桿菌屬中的種形成的簇內(nèi)。[2-2]細(xì)菌學(xué)性狀試驗(yàn)細(xì)菌學(xué)性狀試驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，siid9587株在含5％乙酸的培養(yǎng)基中不生育，這一點(diǎn)與已知的中間葡糖醋桿菌的性狀不同，其它性狀一致(brenner等、bergey’smanualofsystematicbacteriology.vol.two.theproteobacteria，partcthealpha-，beta-，delta-，andepsilonproteobacteria.2005.springer.p72-77)。從以上的本實(shí)施例1(2)[2-1]及[2-2]的結(jié)果可知，siid9587株屬于中間葡糖醋桿菌。另一方面，如上所述，siid9587株和作為中間葡糖醋桿菌的基準(zhǔn)株的中間葡糖醋桿菌tf2株之間，16srdna堿基序列及細(xì)菌學(xué)性狀方面存在不同點(diǎn)，因此可知，siid9587株是中間葡糖醋桿菌的新菌株。因此，將該菌株于平成24年(2012年)12月21日保藏在獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心(nite-ipod；日本國(guó)千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8122號(hào)室)，保藏號(hào)為nitebp-01495。以下，將該中間葡糖醋桿菌siid9587株(保藏號(hào)nitebp-01495)稱為nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)。(3)生產(chǎn)物的確認(rèn)進(jìn)行nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)的前培養(yǎng)，使菌體增殖。然后，將進(jìn)行前培養(yǎng)而獲得的培養(yǎng)液(前培養(yǎng)液)加入到hs培養(yǎng)基(碳源：葡萄糖)中，在30℃下進(jìn)行約8天靜置培養(yǎng)，由此進(jìn)行主培養(yǎng)，使其在培養(yǎng)基表面生成凝膠狀膜。對(duì)凝膠狀膜，按照常規(guī)方法得到紅外分光法(ir)的譜圖及x射線衍射圖并進(jìn)行解析。由其結(jié)果可知，凝膠狀膜為具有i型晶體結(jié)構(gòu)的纖維素。此外，按照常規(guī)方法得到掃描型電子顯微鏡圖像并進(jìn)行了解析，結(jié)果表明，凝膠狀膜中，納米級(jí)的寬度的纖維素纖維(纖維素納米纖維)形成了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由這些結(jié)果可確認(rèn)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)生產(chǎn)纖維素。<實(shí)施例2>通氣攪拌培養(yǎng)所產(chǎn)生的生產(chǎn)物的評(píng)價(jià)(1)通氣攪拌培養(yǎng)所產(chǎn)生的生產(chǎn)物的調(diào)制對(duì)bdf-b進(jìn)行中和處理，進(jìn)而進(jìn)行高壓釜處理，由此獲得經(jīng)過(guò)了前處理的bdf-b。調(diào)制了在含2％(w/v)的cmc(化學(xué)用、和光純藥株式會(huì)社)的hs培養(yǎng)基中添加試劑甘油(試劑特級(jí)、和光純藥株式會(huì)社)代替葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基、及在其中添加濃度為2％(w/v)的經(jīng)過(guò)了前處理的bdf-b代替葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基，分別作為甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基。然后，首先進(jìn)行nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)的前培養(yǎng)，使菌體增殖。然后，將前培養(yǎng)液分別接種到5l的甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用發(fā)酵罐在通氣量為7～10l/分鐘、轉(zhuǎn)速為200～800rpm、溫度為30℃的條件下進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)4天，由此進(jìn)行主培養(yǎng)。在進(jìn)行主培養(yǎng)而獲得的培養(yǎng)液(主培養(yǎng)液)中加入1％(w/v)naoh水溶液，在60℃、80rpm下振蕩4～5小時(shí)，由此溶解菌體。將其供于離心分離后，除去上清，回收沉淀物，由此除去水溶性的菌體成分。在其中加入超純水進(jìn)行離心分離后除去上清，將該操作反復(fù)進(jìn)行至濕潤(rùn)狀態(tài)下沉淀物的ph達(dá)到7以下，由此對(duì)生產(chǎn)物進(jìn)行精制，將其作為攪拌培養(yǎng)bc液。(2)利用靜置培養(yǎng)調(diào)制細(xì)菌纖維素通過(guò)實(shí)施例1(3)所述的方法獲得凝膠狀膜，裁切為約1cm×1cm的大小。然后，加入1％(w/v)naoh水溶液，在60℃、80strokes/分鐘下振蕩4～5小時(shí)后，在20℃下振蕩一晚。使用金屬網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，由此除去液體而回收凝膠狀膜。在其中加入超純水并在20℃下振蕩一晚，將該操作反復(fù)進(jìn)行至ph達(dá)到7以下，由此進(jìn)行精制后，使用混合器進(jìn)行數(shù)分鐘的懸浮處理，將其作為混合器處理靜置培養(yǎng)bc液。(3)解析將本實(shí)施例2(1)的攪拌培養(yǎng)bc液及本實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液分別滴加到硅板上并干燥后，將其供于紅外分光光度計(jì)(ft/ir-4200、日本分光株式會(huì)社)，在累計(jì)次數(shù)32次、分辨率2cm-1或4cm-1下進(jìn)行測(cè)定，獲得ir譜圖。其結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，使用bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基及甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基而獲得的攪拌培養(yǎng)bc液的ir譜圖與混合器處理靜置培養(yǎng)bc液的ir譜圖為同樣形狀。由該結(jié)果可確認(rèn)，以bdf-b、試劑甘油為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的生產(chǎn)物為纖維素。<實(shí)施例3>細(xì)菌纖維素在水中的分散性(1)含細(xì)菌纖維素的水的外觀準(zhǔn)備使用了實(shí)施例2(1)的bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液及實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液。此外，將市售的來(lái)自紙漿的纖維素納米纖維添加到水中并使其分散，將其作為來(lái)自紙漿的cnf液。將攪拌培養(yǎng)bc液、混合器處理靜置培養(yǎng)bc液及來(lái)自紙漿的cnf液靜置1天后觀察外觀。其結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，來(lái)自紙漿的cnf液觀察到了纖維素的沉淀。此外，混合器處理靜置培養(yǎng)bc液觀察到了塊狀的細(xì)菌纖維素，細(xì)菌纖維素的分散狀態(tài)不均一。與此相對(duì)地，攪拌培養(yǎng)bc液未觀察到沉淀、塊狀的細(xì)菌纖維素，觀察到細(xì)菌纖維素均一地分散的樣子。由這些結(jié)果可知，對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素與來(lái)自紙漿的纖維素納米纖維、對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行靜置培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素相比分散性高，在水等液體中均一地分散。(2)含細(xì)菌纖維素的水的光透過(guò)率[2-1]靜置培養(yǎng)的細(xì)菌纖維素及來(lái)自紙漿的纖維素的比較在實(shí)施例2(1)所述的方法中，在主培養(yǎng)中，使用帶槳葉的燒瓶代替發(fā)酵罐，在150rpm、溫度為30℃的條件下進(jìn)行3天旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，調(diào)制攪拌培養(yǎng)bc液，將其作為樣品a(使用了甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基)及樣品b(使用了bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基)。此外，將使用了實(shí)施例2(1)的bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液作為樣品c、將使用了甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液作為樣品d。此外，分別準(zhǔn)備了實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液及實(shí)施例3(1)的來(lái)自紙漿的cnf液。將它們的纖維素終濃度調(diào)制為0.1±0.006％(w/w)后，在比色皿中分別加入1ml，供于分光光度計(jì)(u-2001型雙光束分光光度計(jì)、株式會(huì)社日立制作所)，測(cè)定波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率。比色皿使用聚苯乙烯制一次性比色皿(半微量、光路長(zhǎng)10mm、光路寬度4mm)，參比使用超純水。其結(jié)果如表1所示。[表1]如表1所示，樣品a、b、c及d的透過(guò)率分別為74.75％、70.53％、63.82％及49.66％，與混合器處理靜置培養(yǎng)bc液的19.19％及來(lái)自紙漿的cnf液的12.72％相比顯著大，在大約40％以上且80％以下的范圍。[2-2]培養(yǎng)基中有無(wú)cmc的比較在實(shí)施例2(1)所述的方法中，分別使用含2％(w/v)cmc的hs培養(yǎng)基和不含cmc的hs培養(yǎng)基獲得攪拌培養(yǎng)bc液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖來(lái)作為碳源。此外，使用糖蜜作為碳源時(shí)，在主培養(yǎng)第3天，培養(yǎng)基中的碳源幾乎變沒(méi)，因此將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為3天，來(lái)代替4天。然后，根據(jù)本實(shí)施例3(2)[2-1]所述的方法測(cè)定了含細(xì)菌纖維素的水的光透過(guò)率。其結(jié)果如下述表2所示。[表2]培養(yǎng)基中的cmc培養(yǎng)方法碳源透過(guò)率(％)含攪拌培養(yǎng)糖蜜57不含攪拌培養(yǎng)糖蜜18如表2所示，使用含cmc的hs培養(yǎng)基時(shí)的透過(guò)率為57％，與此相對(duì)，使用不含cmc的hs培養(yǎng)基時(shí)的透過(guò)率為18％。由以上的本實(shí)施例3(2)[2-1]及[2-2]的結(jié)果可知，含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的、用含cmc的培養(yǎng)基對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率為40％以上且80％以下。由此可知，通過(guò)用含cmc的培養(yǎng)基對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，從而獲得了在液體中的分散性顯著高、在液體中均一地分散的細(xì)菌纖維素。<實(shí)施例4>碳源不同的情況下的透過(guò)率及細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)速度的比較利用實(shí)施例2(1)所述的方法獲得攪拌培養(yǎng)bc液。其中，使用糖蜜及試劑甘油代替葡萄糖來(lái)作為碳源。此外，使用糖蜜作為碳源時(shí)，將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為3天，來(lái)代替4天。然后，利用實(shí)施例3(2)[2-1]所述的方法測(cè)定含細(xì)菌纖維素的水的光透過(guò)率。此外，將攪拌培養(yǎng)bc液干燥，測(cè)定細(xì)菌纖維素的絕干重量，基于測(cè)定結(jié)果算出每1l培養(yǎng)基的細(xì)菌纖維素的濃度，將其作為細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)量(bc生產(chǎn)量、g/l)。此外，算出將bc生產(chǎn)量除以主培養(yǎng)的天數(shù)而得的值，將其作為細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)速度(bc生產(chǎn)速度、g/l/天)。其結(jié)果如圖6所示。如圖6的表及左側(cè)的棒圖所示，使用糖蜜作為碳源時(shí)的透過(guò)率為57％，與使用試劑甘油作為碳源時(shí)的57％為相同的值。由該結(jié)果可知，通過(guò)以糖蜜作為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，與以試劑甘油作為碳源時(shí)同樣地獲得了含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率顯著高的細(xì)菌纖維素。由此表明，通過(guò)將糖蜜作為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可獲得分散性高、在液體中均一地分散的細(xì)菌纖維素。此外，如圖6的表及右側(cè)的棒圖所示，將糖蜜作為碳源時(shí)，bc生產(chǎn)速度為1.48g/l/天，比以試劑甘油為碳源時(shí)的0.95g/l/天大約1.5倍。由該結(jié)果可知，通過(guò)將糖蜜作為碳源對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可在短時(shí)間內(nèi)大量獲得分散性高的細(xì)菌纖維素。<實(shí)施例5>細(xì)菌不同的情況下的透過(guò)率及細(xì)菌纖維素生產(chǎn)速度的比較利用實(shí)施例2(1)所述的方法獲得攪拌培養(yǎng)bc液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖來(lái)作為碳源。此外，作為細(xì)菌，分別使用了nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以及作為已知的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株。此外，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)，在主培養(yǎng)的第3天，培養(yǎng)基中的碳源幾乎變沒(méi)，因此將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為3天，來(lái)代替4天。另一方面，使用dsm11804株時(shí)，在主培養(yǎng)的第4天，培養(yǎng)基中的碳源的減少程度還很小，因此將主培養(yǎng)的天數(shù)設(shè)為5天，來(lái)代替4天。然后，利用實(shí)施例3(2)[2-1]所述的方法測(cè)定含細(xì)菌纖維素的水的光透過(guò)率。此外，利用實(shí)施例4所述的方法算出bc生產(chǎn)量(g/l)及bc生產(chǎn)速度(g/l/天)，對(duì)于透過(guò)率及bc生產(chǎn)速度其數(shù)值示于棒圖中。其結(jié)果如圖7所示。如圖7的表及左側(cè)的棒圖所示，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)的透過(guò)率為57％，與此相對(duì)地，使用漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株時(shí)的透過(guò)率分別為20％、33％、29％、27％、9％及13％。由該結(jié)果可知，含有終濃度為0.1±0.006％(w/w)的、培養(yǎng)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)而獲得的細(xì)菌纖維素的水的波長(zhǎng)500nm的光透過(guò)率比培養(yǎng)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以外的菌株而獲得的含細(xì)菌纖維素的水的該透過(guò)率顯著大，為35％以上。由此可知，通過(guò)對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以獲得分散性高、在液體中均一地分散的細(xì)菌纖維素。此外，如圖6的表及右側(cè)的棒圖所示，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)的bc生產(chǎn)速度為1.48g/l/天，與此相對(duì)地，使用漢森葡糖醋桿菌atcc23769株、木葡糖醋桿菌atcc53582株、木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株、木葡糖醋桿菌jcm10150株、中間葡糖醋桿菌dsm11804株及木葡糖醋桿菌kccm40274株時(shí)的bc生產(chǎn)速度分別為1.05g/l/天、1.03g/l/天、1.11g/l/天、1.10g/l/天、0.42g/l/天及0.43g/l/天。即，使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)時(shí)的bc生產(chǎn)速度顯著大于使用nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)以外的菌株時(shí)的bc生產(chǎn)速度。該結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以在短時(shí)間內(nèi)大量獲得分散性高的細(xì)菌纖維素。<實(shí)施例6>細(xì)菌纖維素的分子量準(zhǔn)備實(shí)施例3(2)的樣品a、b、c及d以及來(lái)自紙漿的cnf液作為試樣。將這些試樣冷凍干燥，加入57～59％四丁基氫氧化磷水溶液，在35℃下靜置溶解，然后加入水，使四丁基氫氧化磷的濃度為40～42％(w/w)、試樣的濃度為0.2％(w/w)。然后進(jìn)行離心分離而使雜質(zhì)沉淀，回收上清。將該上清在下述條件下供于凝膠滲透色譜，測(cè)定色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積。同一上清在同一條件下測(cè)定3次。其結(jié)果如表3所示，且隨機(jī)選擇的色譜圖如圖8所示。凝膠滲透色譜的條件機(jī)器：高效液相色譜(株式會(huì)社島津制作所)柱：填充有粒徑為9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的內(nèi)徑為6.0mm及長(zhǎng)度為15cm的柱(tskgelsuperawm-h：東曹公司)保護(hù)柱：內(nèi)徑為4.6mm、長(zhǎng)度為3.5cm(tskguardcolumsuperaw-h：東曹公司)柱溫度：35℃送液速度：0.07ml/分鐘樣品注入量：10μl洗脫液：40～42％(w/w)四丁基氫氧化磷水溶液洗脫液中的細(xì)菌纖維素的終濃度：0.2％(w/w)對(duì)照樣品：分子量為85.3×104的普魯蘭多糖(shodexstandardp-82)[表3]如表3及圖8所示，樣品a、b、c及d的峰頂?shù)谋Ａ趔w積以平均計(jì)分別為2.79ml、2.81ml、2.82ml及2.76ml，小于來(lái)自紙漿的cnf液的3.04ml及普魯蘭多糖的3.24ml。該結(jié)果表明，對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素的平均分子量大于來(lái)自紙漿的纖維素，以普魯蘭多糖換算大于85.3×104。此外，如表3所示，樣品a、b、c及d的峰頂?shù)谋Ａ趔w積在2.737～2.849ml的范圍，因此表明在將對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素在上述條件下供于凝膠滲透色譜時(shí)，色譜圖的峰頂?shù)谋Ａ趔w積為2.5ml以上且小于3.0ml。<實(shí)施例7>細(xì)菌纖維素的形態(tài)(1)纖維寬度的測(cè)定準(zhǔn)備使用了實(shí)施例2(1)的甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液及實(shí)施例2(2)的混合器處理靜置培養(yǎng)bc液。將它們的纖維素濃度調(diào)制為約0.001％(w/w)后，分別將10μl滴加到包覆有聚乙烯醇縮甲醛(福姆瓦)的銅網(wǎng)上并風(fēng)干。然后，滴加5μl5％(w/v)醋酸釓水溶液，10秒后用濾紙除去多余的液體，由此進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡在加速電壓為80kv、觀察倍率為30000倍條件下觀察，基于觀察圖像測(cè)定纖維素纖維的寬度。其結(jié)果如圖9所示。如圖9所示，對(duì)于攪拌培養(yǎng)bc液，其纖維素纖維的寬度為17±8nm，與混合器處理靜置培養(yǎng)bc液的纖維素纖維的寬度55±22nm相比顯著小，且標(biāo)準(zhǔn)偏差也小。由該結(jié)果可知，對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的是細(xì)菌纖維素細(xì)、纖維間的寬度偏差小的均一的纖維。(2)纖維寬度的均一性及聚集狀態(tài)的確認(rèn)準(zhǔn)備使用了實(shí)施例2(1)的bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基的攪拌培養(yǎng)bc液及實(shí)施例3(1)的來(lái)自紙漿的cnf液。將它們的纖維素濃度調(diào)制為約0.01％(w/w)后，將噴霧到包覆有聚乙烯醇縮甲醛的銅網(wǎng)上并用干燥器使其干燥的操作反復(fù)進(jìn)行10次。然后，滴加5μl5％(w/v)醋酸釓水溶液，用濾紙除去多余的液體。進(jìn)而，將滴加5μl的超純水后用濾紙除去多余的液體的一系列操作反復(fù)進(jìn)行2次，然后風(fēng)干，由此進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡，在加速電壓為80kv、觀察倍率為10000倍的條件下觀察。其結(jié)果如圖10所示。此外，使用偏光顯微鏡通過(guò)正交尼科爾棱鏡進(jìn)行了觀察。其結(jié)果如圖11所示。如圖10所示，對(duì)于攪拌培養(yǎng)bc液觀察到較多的納米級(jí)的同等寬度的纖維素纖維，與此相對(duì)地，對(duì)于來(lái)自紙漿的cnf液則觀察到各種寬度的纖維素纖維，在較大的纖維中觀察到了纖維寬度為約500nm以上的纖維。由該結(jié)果再次確認(rèn)了對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素為納米級(jí)的寬度均一的纖維。此外，如圖11所示，如箭頭標(biāo)記所示，在來(lái)自紙漿的cnf液中明確觀察到較粗的纖維，與此相對(duì)地，對(duì)于攪拌培養(yǎng)bc液，在用虛線包圍的部分觀察到模糊地影像。由該結(jié)果可知，對(duì)于來(lái)自紙漿的纖維素，存在亞微纖維(submicrofiber)、微纖維等較粗的纖維，而對(duì)nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)進(jìn)行攪拌培養(yǎng)而獲得的細(xì)菌纖維素為納米級(jí)的細(xì)纖維均一地分散著。<實(shí)施例8>細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)(1)靜置培養(yǎng)中的生產(chǎn)能力調(diào)制在lb培養(yǎng)基中添加了經(jīng)過(guò)了前處理的bdf-b及試劑甘油代替葡萄糖來(lái)作為碳源的培養(yǎng)基，作為lb/bdf-b培養(yǎng)基及l(fā)b/甘油培養(yǎng)基。將nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、木葡糖醋桿菌atcc53582株、漢森葡糖醋桿菌atcc23769株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株接種到lb/甘油培養(yǎng)基及l(fā)b/bdf-b培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行7天靜置培養(yǎng)，由此使其生成凝膠狀膜。在其中加入1％(w/v)naoh水溶液并進(jìn)行高壓釜處理，將該操作反復(fù)進(jìn)行至凝膠狀膜變?yōu)榘咨?。然后，將加水進(jìn)行高壓釜處理的操作反復(fù)進(jìn)行至ph為7以下，進(jìn)行精制。精制后，測(cè)定干燥而獲得的細(xì)菌纖維素的絕干重量。其結(jié)果如圖12所示。如圖12所示，在lb/甘油培養(yǎng)基及l(fā)b/bdf-b培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中，漢森葡糖醋桿菌atcc23769株的細(xì)菌纖維素的重量均小。此外，木葡糖醋桿菌atcc53582株及木葡糖醋桿菌atcc700178(bpr2001)株在lb/甘油培養(yǎng)基中細(xì)菌纖維素的重量較大，但在lb/bdf-b培養(yǎng)基中沒(méi)有確認(rèn)到細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。與此相對(duì)地，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)在lb/甘油培養(yǎng)基及l(fā)b/bdf-b培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中細(xì)菌纖維素的重量為同等大小。這些結(jié)果表明，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)不僅可將試劑甘油為碳源，也可將bdf-b作為碳源，通過(guò)靜置培養(yǎng)有效地生產(chǎn)細(xì)菌纖維素?？蓪df-b作為碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的特征是其它比較株所不具有的特征，在可利用副產(chǎn)物的實(shí)用方面也是有利的，且非常有助于降低生產(chǎn)成本。(2)攪拌培養(yǎng)中的生產(chǎn)能力在10ml的hs培養(yǎng)基中接種nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)、atcc53582株及atcc23769株，在30℃下進(jìn)行3天靜置培養(yǎng)，由此進(jìn)行前前培養(yǎng)。然后，將進(jìn)行前前培養(yǎng)而獲得的培養(yǎng)液接種在10ml的hs培養(yǎng)基中，在30℃下進(jìn)行3天靜置培養(yǎng)，由此進(jìn)行前培養(yǎng)。然后，在帶槳葉的三角燒瓶中裝入100ml的實(shí)施例2(1)的甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基，對(duì)各菌株接種相當(dāng)于相同菌體數(shù)的量的前培養(yǎng)液，在150rpm、30℃的條件下進(jìn)行3天振蕩培養(yǎng)，由此進(jìn)行主培養(yǎng)。然后，利用實(shí)施例2(1)所述的方法對(duì)主培養(yǎng)液中的細(xì)菌纖維素進(jìn)行精制。其中，在60℃、80rpm下振蕩4～5小時(shí)后，再在20℃下振蕩一晚。使精制后的細(xì)菌纖維素干燥后測(cè)定絕干重量。其結(jié)果如圖13所示。如圖13所示，木葡糖醋桿菌atcc53582株在甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中均沒(méi)有確認(rèn)到細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。此外，漢森葡糖醋桿菌atcc23769株，在甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基中細(xì)菌纖維素的絕干重量較大，但在bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中沒(méi)有確認(rèn)到細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)。與此相對(duì)地，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)在甘油主培養(yǎng)培養(yǎng)基及bdf-b主培養(yǎng)培養(yǎng)基中的任一培養(yǎng)基中，細(xì)菌纖維素的絕干重量均大。該結(jié)果表明，nedo-01株(中間葡糖醋桿菌siid9587株)不僅可將試劑甘油作為碳源，也可將bdf-b作為碳源，不僅可通過(guò)靜置培養(yǎng)也可通過(guò)攪拌培養(yǎng)而有效地生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。當(dāng)前第1頁(yè)12