一種重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用與流程

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本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤需要功能性的血管網(wǎng)絡(luò)提供氧氣、養(yǎng)料并清除代謝產(chǎn)物。腫瘤除了通過與宿主血管融合而獲得部分血管外，還必須通過形成新生血管網(wǎng)構(gòu)建自己的血管系統(tǒng)，這樣才能持續(xù)地生長和發(fā)展。如果沒有血管系統(tǒng)提供氧氣和養(yǎng)料，實體瘤的增長不會超過1mm³。實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成的學(xué)說的提出，為腫瘤治療開辟了一個新的途徑。

1997年，哈佛大學(xué)o’reilly等發(fā)現(xiàn)小鼠血管內(nèi)皮瘤(eoma)細(xì)胞系的培養(yǎng)液能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。通過分離純化得到一種新的蛋白質(zhì)，命名為鼠的endostatin，后來翻譯成血管內(nèi)皮抑制素(簡稱內(nèi)皮抑素)。內(nèi)皮抑素是由細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原xⅷ的羧基末端水解而來的一種動物體內(nèi)天然存在的蛋白，是一種內(nèi)源性血管形成抑制因子，能有效地抑制機體內(nèi)病理性血管的形成，具有廣譜的抗腫瘤作用。關(guān)于人血管內(nèi)皮抑制素(es)，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，down’s綜合癥病人的es表達水平較高，實體瘤發(fā)病率很低；癌癥患者血清中es的含量有利于總生存時間的延長。體外研究發(fā)現(xiàn)，es特異性地抑制微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、粘附和存活，能有效地抑制雞胚尿囊膜(cam)新生血管的形成，而實驗性動物研究也證實es有顯著的抗腫瘤作用。目前發(fā)現(xiàn)es可以和內(nèi)皮細(xì)胞(ecs)表面多個非特異性受體結(jié)合，抑制ecs在血管形成中的作用。人血管內(nèi)皮抑制素同樣具有抑制腫瘤的作用，因此，關(guān)于人內(nèi)皮抑素的研究也越來越多。

中國專利文獻cn1177005a是國際上關(guān)于內(nèi)皮抑素的最早獲得授權(quán)的專利之一，其中通過大腸桿菌表達了人內(nèi)皮抑素基因，是人膠原蛋白十八基因1503-2055表達的蛋白活性片段，184個氨基酸，分子量20kd，與小鼠內(nèi)皮抑素氨基酸序列有85.33％的同源性，目前已經(jīng)完成三期臨床研究。我國以大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)了新型重組人內(nèi)皮抑素(recombinanthumanendostatin，rh-es，商品名endostar，恩度)，其氨基末端經(jīng)過基因修飾加上了9個氨基酸序列(mggshhhhh)，形成6個組氨酸標(biāo)簽，從而簡化了純化工藝，中國食品藥品監(jiān)督管理局(sfda)在2005年9月批準(zhǔn)了恩度聯(lián)合np(諾維本+順鉑)方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，nsclc)的適應(yīng)癥。但是endostar在使用時仍存在一些缺點，如由于其體內(nèi)半衰期短，入胞能力差，臨床上的使用劑量較大，增加了患者的經(jīng)濟和身體負(fù)擔(dān)。為解決上述問題，中國專利文獻cn105646701a中公開了一種與endostar有13個氨基酸差異的重組內(nèi)皮抑素蛋白，該重組內(nèi)皮抑素蛋白更容易進入血管內(nèi)皮細(xì)胞和雞胚絨毛尿囊膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，蛋白穿膜效果和n端的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都有了顯著提高。雖然改造后的重組內(nèi)皮抑素其抑制腫瘤細(xì)胞生長的效果顯著提高，但重組內(nèi)皮抑素進入人體后由于不具備器官靶向性，會在體內(nèi)隨內(nèi)循環(huán)進入各處，導(dǎo)致其組織分布的相對平均，未能在病灶部位形成有效的抗腫瘤濃度，且由于其未能有效地輸送至病變部位會產(chǎn)生擴散降解，因此臨床使用劑量較高和使用周期較長。為了提高重組內(nèi)皮抑素蛋白的靶向性，目前采用的融合蛋白通常采用人源的單克隆抗體融合到重組內(nèi)皮抑素蛋白上以提高靶向性，如美國專利文獻us9611313b2中，將人類野生型人內(nèi)皮抑制素huendo或突變形式的人內(nèi)皮抑制素(huendo-p125a)融合到人源化抗her2igg3抗體的3'端，產(chǎn)生兩種抗her2人內(nèi)皮抑素融合蛋白αher2-huendo和her2igg3-huendo-p125a，然而采用人源的單克隆抗體雖然能夠提高靶向性，但是申請人發(fā)現(xiàn)人源的單克隆抗體穿膜效果較差，限制了抗her2人內(nèi)皮抑素融合蛋白的應(yīng)用。

her2是由原癌基因her2/neu編碼的185kd的跨膜受體，是表皮生長因子(egf)酪氨酸蛋白激酶受體家族的成員。大約26％的乳腺癌出現(xiàn)her2基因的高表達，其過度活化可能與腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等行為有關(guān)，因此her2被認(rèn)為是乳腺癌檢測和治療的最佳靶點，已經(jīng)有相應(yīng)的抗體藥物如曲妥珠單抗和帕妥珠單抗等臨床使用。曲妥珠單抗治療her2陽性乳腺癌療效確切，但即使是her2高表達或基因擴增的患者，有效率也僅為12％～34％。納米抗體(nanobody,nb)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型抗體，即重鏈單域抗體vhh(variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody)，來源自駱駝體內(nèi)存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chainantibody,hcab)，克隆其可變區(qū)而得到的只由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，是目前可以得到的具有完整功能的穩(wěn)定的可結(jié)合抗原的最小單位。其相對分子質(zhì)量為15kd，比單抗小很多，可以有效地穿透濃密的組織，到達傳統(tǒng)抗體無法到達的地方，并且納米抗體迅速通過腎臟系統(tǒng)的過濾排出身體。因此，當(dāng)納米抗體用放射性或熒光染料標(biāo)記，可以在給藥后在靶細(xì)胞部位產(chǎn)生非常高的對比度，對腫瘤的檢測和靶向治療具有非常重要的臨床價值。但納米抗體單體由于分子量過小，進入人體后穩(wěn)定性差，作為藥物使用時需要多次服藥以維持藥用濃度；同時納米抗體在保藏以及運輸過程中容易發(fā)生降解，不利于長時間保藏與運輸，使納米抗體的使用成本升高，影響了納米抗體作為疾病治療藥物開發(fā)中的藥用效果，因此，現(xiàn)有技術(shù)中還未提出一種利用納米抗體制備重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的方案。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中納米抗體單體在進入人體后易分解，保藏時穩(wěn)定性較低，易隨保藏時間延長而發(fā)生降解的缺陷，從而提供一種可以長時間穩(wěn)定保藏和運輸?shù)膆er2納米抗體二聚體。

本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的重組人內(nèi)皮抑素進入人體后由于不具備器官靶向性或靶向性差,未能有效地輸送至病變部位產(chǎn)生擴散降解，從而提供一種可以靶向her2陽性乳腺癌病變部位，并能有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種her2納米抗體二聚體，所述her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體、連接肽和her2結(jié)合肽。

所述的her2納米抗體二聚體，所述連接肽序列如seqidno.4所示，所述her2結(jié)合肽序列如seqidno.2所示。

所述的her2納米抗體二聚體，所述her2納米抗體二聚體的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明提供了一種編碼上述her2納米抗體二聚體的基因，所述her2納米抗體二聚體的編碼基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本發(fā)明提供了一種重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，所述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白包括上述her2納米抗體二聚體和重組人內(nèi)皮抑素蛋白。

所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示。

所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的編碼基因的核苷酸序列如seqidno.6所示。

所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，所述her2納米抗體二聚體連接于所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的n端或c端。

所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，所述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白還包括連接her2納米抗體二聚體和所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的連接肽，所述連接肽序列如seqidno.4所示。

所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，所述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白選自如下蛋白：

(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)，其氨基酸序列如seqidno.7所示；

(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)，其氨基酸序列如seqidno.8所示；或

(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)，其氨基酸序列如seqidno.9所示。

本發(fā)明提供了一種編碼上述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的基因，所述編碼基因選自如下基因：

(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.10所示；

(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.11所示；或

(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.12所示。

上述的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)，即表示所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白從n端到c端依次為her2納米抗體二聚體、重組人內(nèi)皮抑素蛋白；同理，所述的(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)，表示所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白從n端到c端依次為重組人內(nèi)皮抑素蛋白、her2納米抗體二聚體；(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)，表示所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白從n端到c端依次為her2納米抗體二聚體、連接肽和重組人內(nèi)皮抑素蛋白。

本發(fā)明提供了包含上述的her2納米抗體二聚體的編碼基因或上述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌。

本發(fā)明提供了一種重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建所述her2納米抗體二聚體的編碼基因和所述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的編碼基因；

(2)將步驟(1)中的編碼基因克隆至表達載體中得到重組表達載體；

(3)將步驟(2)中獲得的所述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得表達重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)得到所述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白；

(4)純化分離得到的所述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白。

本發(fā)明提供了上述重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白在制備檢測或靶向治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明所述的her2納米抗體二聚體，包括2個her2納米抗體單體、連接肽和her2結(jié)合肽；二聚體形態(tài)的her2納米抗體單體進入體內(nèi)后的穩(wěn)定性顯著提高，同時her2納米抗體二聚體能夠長時間保存，易于保藏和運輸，降低了抗體的使用成本；her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體，在結(jié)合癌細(xì)胞中her2受體時產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，增強了對癌細(xì)胞的抑制作用；her2納米抗體二聚體包括her2結(jié)合肽，her2結(jié)合肽與her2受體特異性結(jié)合，提高了her2納米抗體二聚體靶向her2的結(jié)合親和力。

2、本發(fā)明所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，包括her2納米抗體二聚體和重組人內(nèi)皮抑素蛋白；重組人內(nèi)皮抑素蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示，該重組內(nèi)皮抑素蛋白更容易進入血管內(nèi)皮細(xì)胞和雞胚絨毛尿囊膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，蛋白穿膜效果和n端的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性都有了顯著提高，可以直接抑制腫瘤細(xì)胞生長，并發(fā)揮更好的抑制新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的作用；her2納米抗體二聚體連接于所述重組人內(nèi)皮抑素蛋白的n端或c端，使重組人內(nèi)皮抑素蛋白能夠直接靶向her2高表達的乳腺癌細(xì)胞，從而特異性抑制乳腺癌細(xì)胞和癌癥病變區(qū)域新生血管的形成，達到治療乳腺癌的效果；重組內(nèi)皮抑素蛋白在病變區(qū)富集可減少全身用量，降低副作用，提高量效比。

3、本發(fā)明所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白同時發(fā)揮高效抑制腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生成和靶向癌癥病變部位的功能，能夠應(yīng)用于制備檢測或靶向治療her2高表達的乳腺癌的藥物。

4、本發(fā)明所述的重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白，由于納米抗體具有較好的親水性和可溶性，提高了重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白在體內(nèi)的吸收率和其作為靶向檢測和治療腫瘤藥物的利用率。

5、本發(fā)明所述的編碼重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的基因，由于重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白能夠靶向her2高表達的腫瘤細(xì)胞并高效抑制腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，上述編碼重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的基因可應(yīng)用于檢測或治療her2高表達的腫瘤。

6、本發(fā)明所述的包含her2納米抗體二聚體的編碼基因或重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌，以及重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白的制備方法，為制備檢測或治療乳腺癌潛在藥物提供了新的基因工程表達載體、細(xì)胞系以及重組菌。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例1中pet-28a-dim-1重組載體測序檢測結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實施例1中top10-pet28a-dim-endo(m)質(zhì)粒測序檢測結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實施例1中top10-pet28a-dim-endo(m)的質(zhì)粒圖譜；

圖4為本發(fā)明實施例1中(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)誘導(dǎo)表達的鑒定結(jié)果；

其中圖a顯示20℃誘導(dǎo)18h后融合蛋白表達的sds-page檢測結(jié)果，泳道1：iptg0.5mm誘導(dǎo)后上清中融合蛋白，泳道2：iptg0.5mm誘導(dǎo)后沉淀中融合蛋白，泳道3：iptg1.0mm誘導(dǎo)后上清中融合蛋白，泳道4：iptg1.0mm誘導(dǎo)后沉淀中融合蛋白；

圖b顯示37℃誘導(dǎo)6h后融合蛋白表達的sds-page檢測結(jié)果，泳道1：iptg0.5mm誘導(dǎo)后上清中融合蛋白，泳道2：iptg0.5mm誘導(dǎo)后沉淀中融合蛋白，泳道3：iptg1.0mm誘導(dǎo)后上清中融合蛋白，泳道4：iptg1.0mm誘導(dǎo)后沉淀中融合蛋白；

圖c顯示融合蛋白表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示iptg0.5mm、20℃誘導(dǎo)18h后的上清、iptg0.5mm、20℃誘導(dǎo)18h后的沉淀，iptg1.0mm、20℃誘導(dǎo)18h后的上清、iptg1.0mm、20℃誘導(dǎo)18h后的沉淀，iptg0.5mm、37℃誘導(dǎo)6h后的上清、iptg0.5mm、37℃誘導(dǎo)6h后的沉淀，iptg1.0mm、37℃誘導(dǎo)6h后的上清、iptg1.0mm、37℃誘導(dǎo)6h后的沉淀；

圖5為本發(fā)明實施例1中(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)純化復(fù)性后的鑒定結(jié)果；

其中圖a顯示(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)純化和復(fù)性后sds-page檢測結(jié)果，泳道1：pbs洗滌2次后的電泳圖，泳道2：pbs洗滌3次后的電泳圖，泳道3：pbs洗滌4次后的電泳圖，泳道4：pbs洗滌5次后的電泳圖；

圖b顯示(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)純化復(fù)性后的梯度復(fù)性；m為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

圖6為本發(fā)明實施例4中pet-28a-dim、pet-28a-tet和pet-28a-hex的質(zhì)粒圖譜，其中圖a顯示pet-28a-dim的質(zhì)粒圖譜，圖b顯示pet-28a-tet的質(zhì)粒圖譜，圖c顯示pet-28a-hex的質(zhì)粒圖譜；

圖7為本發(fā)明實施例4中her2納米抗體二聚體誘導(dǎo)表達的鑒定結(jié)果；

其中圖a顯示不同誘導(dǎo)條件下her2納米抗體二聚體表達的sds-page檢測結(jié)果，泳道自左向右依次表示誘導(dǎo)條件為：(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)；

圖b顯示her2納米抗體二聚體表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導(dǎo)后的上清和(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導(dǎo)后的沉淀；

圖8為本發(fā)明實施例4中her2納米抗體四聚體誘導(dǎo)表達的鑒定結(jié)果；

其中圖a顯示不同誘導(dǎo)條件下her2納米抗體四聚體表達的sds-page檢測結(jié)果，泳道自左向右依次表示誘導(dǎo)條件為：(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)；

圖b顯示her2納米抗體四聚體表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導(dǎo)后的上清和(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導(dǎo)后的沉淀；

圖9為本發(fā)明實施例4中her2納米抗體六聚體誘導(dǎo)表達的鑒定結(jié)果；

其中圖a顯示不同誘導(dǎo)條件下her2納米抗體六聚體表達的sds-page檢測結(jié)果，泳道自左向右依次表示誘導(dǎo)條件為：(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)；

圖b顯示her2納米抗體六聚體表達的量化圖，柱形圖從左向右依次顯示(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導(dǎo)后的上清和(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)誘導(dǎo)后的沉淀；

圖10為本發(fā)明實施例4中動態(tài)光散射(dls)實驗檢測her2納米抗體多聚體的粒徑大小分布比例；

其中圖a顯示her2納米抗體二聚體的粒徑大小分布比例；圖b顯示her2納米抗體四聚體的粒徑大小分布比例；圖c顯示her2納米抗體六聚體的粒徑大小分布比例；

圖11為本發(fā)明實施例4中圓二色譜法測定her2納米抗體多聚體的二級結(jié)構(gòu)；

圖12為本發(fā)明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置14天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置14天后剩余蛋白的sds-page檢測結(jié)果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置14天后剩余蛋白的量化圖；

圖13為本發(fā)明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置21天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置21天后剩余蛋白的sds-page檢測結(jié)果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置21天后剩余蛋白的量化圖；

圖14為本發(fā)明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置42天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置42天后剩余蛋白的sds-page檢測結(jié)果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置42天后剩余蛋白的量化圖；

圖15為本發(fā)明實施例4中her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃和-80℃下放置60天后蛋白剩余情況；

其中圖a顯示放置60天后剩余蛋白的sds-page檢測結(jié)果，泳道1、2、3依次顯示her2納米抗體二聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道4、5、6依次顯示her2納米抗體四聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白，泳道7、8、9依次顯示her2納米抗體六聚體在4℃、-20℃、-80℃放置后的剩余蛋白；

圖b顯示放置60天后剩余蛋白的量化圖；

圖16為本發(fā)明實施例5中(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)對乳腺癌細(xì)胞sk-br-3、mcf-7、mda-mb-231和正常乳腺細(xì)胞hbl100的抑制作用；柱形圖由左至右依次蛋白濃度為5.50ug/ml對細(xì)胞sk-br-3、mda-mb-231、mcf-7和hbl100的抑制效果；蛋白濃度為13.75ug/ml對細(xì)胞sk-br-3、mda-mb-231、mcf-7和hbl100的抑制效果；蛋白濃度為27.50ug/ml對細(xì)胞sk-br-3、mda-mb-231、mcf-7和hbl100的抑制效果；

圖17為本發(fā)明實施例6中細(xì)胞免疫熒光檢測her2納米抗體二聚體與乳腺癌細(xì)胞sk-br-3的結(jié)合情況；圖片由左至右依次顯示細(xì)胞核dapi染色結(jié)果、her2納米抗體二聚體在細(xì)胞中的染色定位結(jié)果和前兩者染色的融合結(jié)果；

圖18為本發(fā)明實施例7中細(xì)胞免疫熒光檢測(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)與乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合情況；橫向第一排顯示sk-br-3細(xì)胞中的免疫熒光檢測結(jié)果，橫向第二排顯示mcf-7細(xì)胞中的免疫熒光檢測結(jié)果；豎向第一列顯示細(xì)胞核dapi染色結(jié)果，豎向第二列顯示(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)在細(xì)胞中的染色定位結(jié)果，豎向第三列為第一列和第二列染色的融合結(jié)果。

具體實施方式

以下通過具體實施例來說明本發(fā)明的實施方式，除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，所有引物合成以及測序工作由南京金斯瑞生物有限公司完成，實施例中所用到的試劑和原料均可由市場購得。如pet28a(+)購自novagen公司，菌株bl21(de3)購自novagen公司；下述實施例中所涉及的細(xì)胞均來自上海細(xì)胞所。

實施例1(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的制備

1、構(gòu)建top10-pet28a-dim-endo(m)重組表達載體

所述her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體、連接肽和her2結(jié)合肽，所述her2結(jié)合肽序列如seqidno.2所示，所述連接肽序列如seqidno.4所示，所述her2納米抗體二聚體的氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.3所示。

1)由南京金斯瑞公司依據(jù)seqidno.3所示的核苷酸序列合成her2納米抗體二聚體基因，利用引物1(5’-caagtcaaactggtggaatcg-3’)和引物2(5’-cacgtccatgtaacacgcatag-3’)通過pcr在her2納米抗體二聚體基因的氨基端添加bamhi酶切位點，羧基端添加ecori酶切位點，克隆進入pet28a(+)載體的bamhi和ecori兩個酶切位點位置，測序驗證重組載體，驗證結(jié)果如圖1所示，序列符合seqidno.3所示的質(zhì)粒即為pet-28a-dim-1重組載體；

2)設(shè)計引物endo-f和endo-r，endo-f序列為5’-atgcgccgccgccgccgccgccgccgccgc-3’，endo-r序列為5’-ttacttggaggcagtcatgaagctg-3’，以pet28a-m-endostatin(保存于南京大學(xué))為dna模板，利用上述兩種引物pcr擴增重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白基因，pcr擴增體系下所示：

dna模板,1μl，

endo-r,3pmol,2μl，

endo-f,3pmol,2μl，

dntpmixture,1μl，

taqdna聚合酶,1μl，

ddh2o,補齊50μl；

pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸10min，30個循環(huán)；72℃退火10min。將pcr擴增產(chǎn)物純化后和步驟1)中得到的所述pet-28a-dim-1重組載體同時用ecori和xhoi雙酶切，跑膠純化，連接，連接體系如下所示：

pet-28a-dim(ecori和xhoi雙酶切),1μl，

pcr擴增片段,10μl，

10×t4ligasebuffer,2μl，

t4ligase,1μl，

ddh2o,補齊20μl，

混勻后，22℃反應(yīng)2h后，65℃10min或70℃5min終止反應(yīng)。

3)將步驟2)中得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布kan抗性平板進行篩選，通過對菌液pcr和測序篩選序列符合seqidno.10所示的質(zhì)粒，測序結(jié)果如圖2所示，即獲得(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)基因克隆載體top10-pet28a-dim-endo(m)(如圖3所示)。

2、(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的誘導(dǎo)表達和純化

1)將質(zhì)粒top10-pet28a-dim-endo(m)轉(zhuǎn)化到表達菌株bl21(de3)中。誘導(dǎo)表達菌株表達，在不同的iptg誘導(dǎo)劑濃度(0.5mmol/l和1.0mmol/l)和不同的誘導(dǎo)溫度(20℃和37℃)下分別誘導(dǎo)表達，在20℃培養(yǎng)溫度下誘導(dǎo)18h，37℃培養(yǎng)溫度下誘導(dǎo)6h。

2)離心收集菌體，將菌體超聲破碎后分別取上清和沉淀進行sds-page凝膠電泳，鑒定結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后菌體在50kd附近有明顯表達帶，與預(yù)期相符；且在不同的誘導(dǎo)條件下融合蛋白均主要存在于沉淀中，即融合蛋白以包涵體的形式存在；iptg濃度為0.5mm、20℃誘導(dǎo)18h后的沉淀中得到最高表達量的融合蛋白。

3)選用包涵體變性復(fù)性的方法純化目的蛋白，首先大量誘導(dǎo)表達目的蛋白，離心獲取菌體沉淀，預(yù)冷pbs懸浮后，超聲破碎菌體，高速離心得到包涵體。離心得到的包涵體中含有一些細(xì)胞碎片和雜蛋白，通過pbs反復(fù)洗滌后，包涵體中目的蛋白的純度有所上升。然后使用變性液(含質(zhì)量濃度1％β-巰基乙醇的6m鹽酸胍溶液)對包涵體進行溶解提純，經(jīng)20mmtris-hcl(ph8.0)溶液沉淀后，加入6m鹽酸胍進行包涵體的再溶解，高速離心獲取的上清即為純度較高的包涵體溶液。隨后在變性環(huán)境(6m鹽酸胍)下，使用nta-ni柱進行目的蛋白的純化，最終獲得目的蛋白溶液。

由于純化得到的蛋白溶液中含有6m鹽酸胍，蛋白處于變性可溶狀態(tài)，需要進行復(fù)性才能獲取具有活性的蛋白質(zhì)。采用梯度透析法：(1)復(fù)性液i含4m鹽酸胍，1mm還原型谷胱甘肽(gsh)，0.1mm氧化型谷胱甘肽(gssg)，20mm醋酸緩沖液(naac-hac)(ph5.0)溶液，4℃旋轉(zhuǎn)透析12h；(2)復(fù)性液ii含2m鹽酸胍，1mmgsh，0.1mmgssg，20mmnaac-hac(ph5.0)溶液，4℃旋轉(zhuǎn)透析12h；(3)復(fù)性液iii含1m鹽酸胍，1mmgsh，0.1mmgssg，20mmnaac-hac(ph5.0)溶液，4℃旋轉(zhuǎn)透析12h；(4)復(fù)性液iv為20mmnaac-hac(ph5.0)溶液，4℃旋轉(zhuǎn)透析12h；(5)重復(fù)步驟(4)一次。復(fù)性得到的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)溶液經(jīng)超濾濃縮后，加入凍干保護劑甘油后分裝并保存于-20℃冰箱，所述(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的氨基酸序列如seqidno.7所示。復(fù)性后的融合蛋白進行sds-page和western-blot檢測，結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示在50kd附近可得到明顯條帶，蛋白復(fù)性效率高。

實施例2(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)的制備

1、構(gòu)建top10-pet28a-endo(m)-dim重組表達載體

1)將實施例1中合成的序列為seqidno.3所示的her2納米抗體二聚體基因，利用引物3(5’-caagtcaaactggtggaatcg-3’)和引物4(5’-taacacgtccatgtaacacgcatag-3’)通過pcr在氨基端添加ecori酶切位點，羧基端添加xhoi酶切位點，克隆進入pet28a(+)載體的ecori和xhoi兩個酶切位點位置，得到pet-28a-dim-2重組載體；

2)設(shè)計引物endo-f’和endo-r’，endo-f’(5’-atgcgccgccgccgccgccgccgccgccgc-3’)，endo-r’(5’-cttggaggcagtcatgaagctg-3’)，以pet28a-m-endostatin為dna模板，利用上述兩種引物pcr擴增重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白基因，pcr擴增體系依據(jù)實施例1中所述的pcr擴增體系；

pcr反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃退火10min。將pcr擴增產(chǎn)物純化后和步驟1)中得到的pet-28a-dim-2同時用bamhi和ecori雙酶切，跑膠純化，連接，連接體系和連接條件依據(jù)實施例1中所述方法進行。

3)將步驟2)中得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布kan抗性平板進行篩選，通過菌液pcr和測序篩選序列符合seqidno.11所示的質(zhì)粒，即獲得(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)基因克隆載體top10-pet28a-endo(m)-dim。

2、(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)的誘導(dǎo)表達和純化

依據(jù)實施例1中蛋白誘導(dǎo)和純化方法，獲得復(fù)性的(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)，其其氨基酸序列如seqidno.8所示。

實施例3(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的制備

1、構(gòu)建top10-pet28a-dim-linker-endo(m)重組表達載體

1)將實施例1中合成的序列為seqidno.3所示的her2納米抗體二聚體基因，利用引物1和引物2通過pcr在氨基端bamhi酶切位點，在羧基端沿蛋白編碼方向添加連接肽序列和ecori酶切位點；所述連接肽的氨基酸序列如seqidno.4所示，核苷酸序列如seqidno.13所示；將上述her2納米抗體二聚體基因克隆進入pet28a(+)載體的bamhi和ecori兩個酶切位點位置，得到pet-28a-dim-3重組載體；

2)以實施例1中所述的引物和pcr方法擴增重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白基因，并通過ecori和xhoi位點與pet-28a-dim-3重組載體進行連接。

3)將步驟2)中得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布kan抗性平板進行篩選，通過菌液pcr和測序篩選序列符合seqidno.12所示的質(zhì)粒，即獲得(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)基因克隆載體top10-pet28a-dim-linker-endo(m)。

2、(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的誘導(dǎo)表達和純化。

依據(jù)實施例1中蛋白誘導(dǎo)和純化方法，獲得復(fù)性的(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)，其氨基酸序列如seqidno.9所示。

實施例4her2納米抗體二聚體的性能評估

1、構(gòu)建her2納米抗體二聚體(pet-28a-dim)、her2納米抗體四聚體(pet-28a-tet)和her2納米抗體六聚體(pet-28a-hex)的重組表達載體

1)設(shè)計her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體的編碼基因，上述多聚體由her2納米抗體單體通過連接肽相連，并由南京金斯瑞公司依據(jù)下述序列進行基因合成：

her2納米抗體二聚體的氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.3所示；her2納米抗體四聚體的氨基酸序列如seqidno.14所示，核苷酸序列如seqidno.15所示；her2納米抗體六聚體，其氨基酸序列如seqidno.16所示，核苷酸序列如seqidno.17所示。

利用引物1和引物2通過pcr方法在her2納米抗體二聚體的氨基端引入ndei位點，羧基端引入xhoi位點，克隆至pet28a(+)載體的ndei和xhoi兩個酶切位點位置，得到pet-28a-dim重組載體(圖6-a)；利用引物5(5'-caagtcaaactggtggaatcg-3')和引物6(5'-cacgtccatgtaacacgcataaag-3')在her2納米抗體四聚體的氨基端引入bamhi位點，羧基端引入hindiii位點，克隆至pet28a(+)載體的bamhi和hindiii兩個酶切位點位置，得到pet-28a-tet重組載體(圖6-b)；利用引物7(5'-caagtcaaactggtggaatcg-3')和引物8(5'-cacgtccatgtaacacgcataaag-3')在her2納米抗體六聚體的氨基端引入bamhi位點，羧基端引入xhoi位點，克隆至pet28a(+)載體的bamhi和xhoi兩個酶切位點位置，得到pet-28a-hex重組載體(圖6-c)；酶切得到片段大小～750bp的質(zhì)粒為構(gòu)建成功的pet-28a-dim重組載體,酶切得到片段大小～1500bp的質(zhì)粒為構(gòu)建成功的pet-28a-tet重組載體,酶切得到片段大小～2200bp的質(zhì)粒為構(gòu)建成功的pet-28a-hex重組載體。

2)分別在(iptg0mm,37℃,6h)(iptg0.5mm,37℃,6h)(iptg1.0mm,37℃,6h)(iptg0mm,20℃,12h)(iptg0.5mm,20℃,12h)(iptg1.0mm,20℃,12h)六種條件下誘導(dǎo)her2納米抗體二聚體表達，表達產(chǎn)物經(jīng)sds-page凝膠電泳檢測(圖7)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后菌體在27kd附近有明顯表達帶，與預(yù)期相符；在不添加iptg時，菌體基本不表達her2納米抗體二聚體；使用iptg誘導(dǎo)產(chǎn)生的her2納米抗體二聚體在不同的誘導(dǎo)條件下均主要存在于沉淀中，即her2納米抗體二聚體以包涵體的形式存在；iptg1.0mm20℃誘導(dǎo)12h后的沉淀中得到最高表達量的her2納米抗體二聚體蛋白。

3)在步驟2)所述的六種條件下誘導(dǎo)her2納米抗體四聚體表達，表達產(chǎn)物經(jīng)sds-page凝膠電泳檢測(圖8)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后菌體在53kd附近有明顯表達帶，與預(yù)期相符；在不添加iptg時，菌體表達量較低；使用iptg誘導(dǎo)產(chǎn)生的her2納米抗體四聚體在不同的誘導(dǎo)條件下均主要存在于沉淀中，即her2納米抗體四聚體以包涵體的形式存在；iptg1.0mm20℃誘導(dǎo)12h后的沉淀中得到最高表達量的her2納米抗體四聚體蛋白。

4)在步驟2)所述的六種條件下誘導(dǎo)誘導(dǎo)her2納米抗體六聚體表達，表達產(chǎn)物經(jīng)sds-page凝膠電泳檢測(圖9)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后菌體在75kd附近有明顯表達帶，與預(yù)期相符；在不添加iptg時，菌體表達量較低；使用iptg誘導(dǎo)產(chǎn)生的her2納米抗體六聚體在不同的誘導(dǎo)條件下均主要存在于沉淀中，即her2納米抗體六聚體以包涵體的形式存在；iptg1.0mm20℃誘導(dǎo)12h后的沉淀中得到最高表達量的her2納米抗體六聚體蛋白。

5)依據(jù)實施例1中所述的蛋白純化、復(fù)性方法，得到her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體蛋白溶液。

2、her2納米抗體的物理學(xué)性能檢測

1)動態(tài)光散射(dls)實驗

將步驟1中得到的三種蛋白溶液，使用醋酸鹽緩沖液(ph5.5)稀釋成1mg/ml，后取1.5ml放入貝克曼庫爾特ls13320系列激光粒度分析儀粒徑池后在25℃下測量蛋白粒徑。醋酸鹽緩沖液(ph5.5)用于基線調(diào)零。

2)圓二色實驗

運用圓二色儀(jasco,日本)檢測三種納米抗體蛋白的二級結(jié)構(gòu)，蛋白溶液濃度為12μg/ml，掃描范圍為190-250nm。

3)蛋白穩(wěn)定性

將步驟1中得到的三種蛋白溶液進行分裝，每管40μl，分別放置于4℃，-20℃和-80℃溫度下，待放置14天、21天、42天和60天后，sds-page檢測蛋白穩(wěn)定性。

3、結(jié)果與討論

1)動態(tài)光散射(dls)實驗

通過動態(tài)光散射(dls)分析測定純化納米抗體粒徑的尺寸分布：her2納米抗體二聚體的平均粒徑是92.57±0.94nm(圖10-a),her2納米抗體四聚體蛋白的平均粒徑是140.83±1.13nm(圖10-b),her2納米抗體六聚體蛋白的平均粒徑是395.45±0.59nm(圖10-c)。隨著納米抗體粒徑的增大，在蛋白純化復(fù)性過程中析出的沉淀也會逐漸增加，從而影響納米抗體的復(fù)性效率和產(chǎn)量。

2)圓二色結(jié)果

采用圓二色譜法測定納米抗體蛋白的二級結(jié)構(gòu)，通過cdpro軟件在195-250nm波長范圍內(nèi)測得納米抗體的相對摩爾橢圓率(deg.cm2.dmol-1)。如圖11所示，her2納米抗體二聚體、her2納米抗體四聚體和her2納米抗體六聚體的α螺旋的比重分別為1.88％、3.16％和3.55％，呈現(xiàn)上升趨勢；β折疊的比重分別為42.32％、33.79％和24.27％，呈現(xiàn)下降趨勢。由于蛋白質(zhì)表面的疏水性隨α-螺旋含量的增加而減小，隨β-折疊及不規(guī)則性含量的增加而增加。結(jié)果表明，her2納米抗體六聚體的表面疏水性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于her2納米抗體四聚體和her2納米抗體二聚體，這使得her2納米抗體六聚體相比her2納米抗體二聚體在純化時易于積累和沉淀，從而影響其復(fù)性效率和產(chǎn)量。

3)蛋白穩(wěn)定性

如圖12所示，三種納米抗體蛋白在4℃、-20℃和-80℃溫度下放置14天后，三種抗體的相對濃度可保持在90％以上；如圖13所示，在4℃下放置21天后三種抗體均能保持相應(yīng)的濃度(75％～80％)；如圖14所示，三種抗體在-20℃和-80℃時的穩(wěn)定性較好，能夠維持42天左右，且her2納米抗體二聚體和her2納米抗體四聚體的穩(wěn)定性優(yōu)于her2納米抗體六聚體。如圖15所示，當(dāng)放置在不同的溫度60天后，目標(biāo)蛋白已經(jīng)失去了一半以上，her2納米抗體六聚體剩余量已不足30％，不能繼續(xù)使用。her2納米抗體二聚體和her2納米抗體四聚體具有較好的穩(wěn)定性，在沒有保護劑的情況下，放置在4℃可以使用三個星期，在低溫(-20℃和-80℃)可放置六至七周左右，平均剩余量在70％以上。

實驗結(jié)論：her2納米抗體二聚體的穩(wěn)定性高，加上保護劑可長時間運輸及保藏，可降低抗體使用成本；her2納米抗體二聚體對比納米抗體單體有更大的分子量，可延長納米抗體進入人體后的半衰期，提高了納米抗體在體內(nèi)的穩(wěn)定性；her2納米抗體二聚體對比其他多聚體，有較小的蛋白粒徑和較高親水性的蛋白結(jié)構(gòu)，有利于蛋白誘導(dǎo)后的純化復(fù)性，并可提高蛋白的吸收率。

實施例5重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白對乳腺癌的抑制作用

通過cck-8實驗分別檢測(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)、(n)-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-her2納米抗體二聚體-(c)和(n)-her2納米抗體二聚體-連接肽-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)三種融合蛋白對乳腺癌細(xì)胞sk-br-3生長的抑制效果，三種蛋白對乳腺癌細(xì)胞的抑制效果無明顯差異，選擇(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)檢測對乳腺癌細(xì)胞mcf-7、sk-br-3、mda-mb-231生長的抑制效果，正常乳腺細(xì)胞hbl100作為對照。

cck-8檢測重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白對細(xì)胞活力的影響，具體步驟如下：

1)將細(xì)胞轉(zhuǎn)接至96孔板中，待到細(xì)胞密度生長至50％覆蓋率，棄去原培養(yǎng)基，用無菌pbs洗一次；

3)將重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白用不含胎牛血清的dmem培養(yǎng)基稀釋成梯度濃度的溶液，分別加入到96孔板中，每孔100μl，另設(shè)置直接加入100μldmem培養(yǎng)基的空白對照組，設(shè)3組重復(fù)；

4)將培養(yǎng)板置于37℃，含5％co2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)；

5)培養(yǎng)24小時后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl單獨dmem培養(yǎng)液和10μlcck-8試劑，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測吸光值。由于細(xì)胞數(shù)量與od450的值成正比，所以od450的值即可以反映細(xì)胞的相對數(shù)量。按照以下公式進行細(xì)胞活力的計算：

抑制率數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用graphpadprim軟件包，組間差異采用單向方差分析。統(tǒng)計學(xué)顯著性水平為p<0.05，所有的p值均為雙尾檢驗。

cck8實驗結(jié)果顯示三種融合蛋白對乳腺癌細(xì)胞sk-br-3生長的抑制效果沒有明顯差別，結(jié)合蛋白表達純化結(jié)果，最終于選擇(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)蛋白作為檢測蛋白，并檢測該融合蛋白對多種乳腺癌細(xì)胞的抑制效果。

檢測結(jié)果如圖16所示：隨著(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)蛋白濃度的升高，對乳腺癌細(xì)胞mcf-7、sk-br-3和mda-mb-231的抑制作用也隨之加強，其中對her2陽性細(xì)胞株sk-br-3的抑制效果要明顯優(yōu)于對其它乳腺癌細(xì)胞株的抑制效果，27.50ug/ml的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)蛋白對sk-br-3細(xì)胞的抑制率達80％。

結(jié)果分析：因為(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)的her2納米抗體二聚體同時具有靶向作用和穿膜肽的作用，使融合蛋白靶向her2高表達乳腺癌細(xì)胞株sk-br-3的表面，與細(xì)胞表面的her2受體特異性結(jié)合；融合蛋白的重組人內(nèi)皮抑素蛋白部分是經(jīng)過改造的人內(nèi)皮抑素蛋白，重組人內(nèi)皮抑素蛋白的n端包括穿膜肽序列(氨基酸序列：rrrrrrrrr)，具有更好的蛋白穿膜效果和n端的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在her2納米抗體二聚體與細(xì)胞表面her2受體結(jié)合后，重組人內(nèi)皮抑素蛋白部分進入細(xì)胞內(nèi)，直接抑制腫瘤細(xì)胞生長。her2納米抗體二聚體包括her2結(jié)合肽，her2結(jié)合肽與her2受體特異性結(jié)合進一步提高了her2納米抗體二聚體靶向her2受體的結(jié)合親和力；her2納米抗體二聚體包括2個her2納米抗體單體，在結(jié)合乳腺癌細(xì)胞中her2抗原時對癌細(xì)胞可產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，進一步增強了(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)對乳腺癌細(xì)胞的抑制效果。

實施例6her2納米抗體二聚體對乳腺癌細(xì)胞的靶向作用

1、cck-8檢測重組納米抗體對細(xì)胞活力的影響

分別將skbr3細(xì)胞、mcf7細(xì)胞以合適的濃度轉(zhuǎn)接至96孔板中，待到細(xì)胞密度生長至50％覆蓋率，按以下步驟對細(xì)胞進行處理：

(1)棄去原培養(yǎng)基，用無菌pbs洗一次；

(2)將納米抗體母液用不含胎牛血清的dmem培養(yǎng)基稀釋成梯度濃度的溶液，分別加入到96孔板中，每孔100μl，另設(shè)置對照組，直接加入100μldmem培養(yǎng)基。設(shè)3組重復(fù)；

(3)將培養(yǎng)板置于37℃，含5％co2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行培養(yǎng)；

(4)培養(yǎng)24小時后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100μl單獨dmem培養(yǎng)液和10μlcck-8試劑，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測吸光值。由于細(xì)胞數(shù)量與od450的值成正比，所以od450的值即可以反映細(xì)胞的相對數(shù)量。按照以下公式進行細(xì)胞活力的計算：

2、fitc標(biāo)記納米抗體蛋白

將三種納米抗體蛋白dimnanobody、tetnanobody和hexnanobody上樣到sephadexg-50脫鹽柱中，洗脫液為0.1mna2co3(ph＝9.0)，收集最大吸收峰時的洗脫液，經(jīng)bsa試劑盒測量蛋白的濃度，每1mg蛋白加入25μl溶于dmso的1mg/mlfitc，37℃下避光孵育1h。將標(biāo)記好的蛋白在避光條件下透析約24h，以去除游離的fitc。最終獲得fitc-labelednanobodies，測量蛋白體積并計算蛋白濃度。

3、細(xì)胞結(jié)合實驗

將培養(yǎng)好的細(xì)胞取出培養(yǎng)箱，棄去培液，用無菌的pbs溶液清洗細(xì)胞2次，胰酶消化細(xì)胞1-2min，加新鮮培液終止反應(yīng)，用移液器將細(xì)胞吹打混勻，將細(xì)胞懸液分裝到2mlep管中，4℃下2000rpm離心5min，吸走上清，pbs重懸細(xì)胞后再次離心除去上清。加入用新鮮陪液稀釋的同濃度的fitc-labelednanobodies后重懸，37℃孵育30min后，4℃2000rpm離心5min，pbs洗滌兩次以去除未結(jié)合的游離蛋白，加入1mlpbs懸浮后轉(zhuǎn)移到流式管中，使用流式細(xì)胞儀進行分析。

4、細(xì)胞免疫熒光

將乳腺癌細(xì)胞傳代到事先放有蓋玻片的六孔板中，在co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h后細(xì)胞貼壁生長良好時，吸去培養(yǎng)液后用預(yù)冷的pbs輕輕洗滌兩次，4％多聚甲醛固定1h。預(yù)冷pbs洗滌三次，每孔加入0.02mg/ml的fitc-labelednanobodies，每孔培液體積為2ml，室溫孵育1h后，預(yù)冷pbs洗滌三次后，dapi染色30min，封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

如圖17所示，在乳腺癌細(xì)胞sk-br-3的細(xì)胞質(zhì)中可檢測到強的熒光，表明her2納米抗體二聚體能夠高效靶向sk-br-3細(xì)胞，并富集于細(xì)胞質(zhì)中。

結(jié)果分析：her2納米抗體二聚體可以靶向識別sk-br-3細(xì)胞表面表達的her2受體，并與her2受體特異性結(jié)合；由于納米抗體良好的穿透性，her2納米抗體二聚體通過細(xì)胞膜后集中在sk-br-3細(xì)胞質(zhì)中。her2納米抗體二聚體中的her2納米抗體單體，在結(jié)合到sk-br-3細(xì)胞后對癌細(xì)胞的生長產(chǎn)生協(xié)同抑制作用。

實施例7重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白對乳腺癌細(xì)胞的靶向作用

細(xì)胞免疫熒光檢測(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)與乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合效果，細(xì)胞免疫熒光檢測步驟如下：

1)將乳腺癌細(xì)胞sk-br-3和mcf-7培養(yǎng)一段時間后，傳代到放有蓋玻片的六孔板中，加新鮮培液培養(yǎng)過夜；

2)pbs洗滌細(xì)胞三次后，4％多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30分鐘，pbs洗滌3次；

3)5％血清pbs室溫封閉細(xì)胞30分鐘，去除封閉液；

4)兔多抗內(nèi)皮抑素抗體(1：200)室溫孵育2小時，封閉液洗滌3次；羊抗兔cy3熒光標(biāo)記二抗孵育1小時(避光)，pbs洗滌3次；

5)熒光倒置顯微鏡觀察。

如圖18所示，在乳腺癌細(xì)胞sk-br-3的細(xì)胞質(zhì)中可檢測到強的熒光，表明(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)蛋白與sk-br-3細(xì)胞結(jié)合量高，并定位于細(xì)胞質(zhì)中；在mcf-7細(xì)胞中，熒光效果弱，表明(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)與mcf-7細(xì)胞結(jié)合量少。

結(jié)果分析：(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)具有對her2陽性乳腺癌細(xì)胞株sk-br-3的特異性結(jié)合和識別作用，穿膜肽可以將融合蛋白帶入細(xì)胞內(nèi)部。在her2納米抗體二聚體和穿膜肽的雙重作用下，免疫熒光主要集中在sk-br-3細(xì)胞質(zhì)中。證明較多的(n)-her2納米抗體二聚體-重組人內(nèi)皮抑素蛋白-(c)進入到高表達her2受體的乳腺癌細(xì)胞sk-br-3的細(xì)胞質(zhì)中，進一步證實了該融合蛋白作為檢測和治療her2和高表達的乳腺癌細(xì)胞的藥用效果。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。

sequencelisting

<110>江蘇吳中醫(yī)藥集團有限公司蘇州中凱生物制藥廠

<120>一種重組人內(nèi)皮抑素融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

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proseralathrglyglnalaserserleuleuglyglyargleuleu

420425430

glyglnseralaalasercyshishisalatyrilevalleucysile

435440445

gluasnserphemetthralaserlys

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<212>dna

<213>人工序列

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