本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，特別是涉及一種高細(xì)胞生長(zhǎng)密度微藻突變體的篩選方法。
背景技術(shù)：
：：微藻因其具有生長(zhǎng)速率快、生長(zhǎng)周期短、油脂含量高等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最具潛力的油脂生物能源。萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardti)作為研究微藻的單細(xì)胞模式生物，已成為潛在的適合大規(guī)模生產(chǎn)的能源微藻。但是，萊茵衣藻與其他商業(yè)微藻相比生物量較小，較低的生長(zhǎng)密度和生物量限制了其作為大規(guī)模能源生產(chǎn)的可能。插入突變是一種常用的突變株篩選方法，已廣泛應(yīng)用于萊茵衣藻特殊表型突變株的篩選。插入的序列一般都含有標(biāo)記基因，例如aphⅷ(sizova,i.,fuhrmann,m.andhegemann,p.(2001)astreptomycesrimosusaphviiigenecodingforanewtypephosphotransferaseprovidesstableantibi-oticresistancetochlamydomonasreinhardtii.genetics,277,221-229.)，ble(lumbreras,v.,stevens,d.r.andpurton,s.(1998)efficientforeigngeneexpressioninchlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.theplantjournal,14,441-447.)等，便于對(duì)突變株進(jìn)行篩選。已有研究表明：為提高生物量，降低色素，去除觸角等的插入突變株在高光下可達(dá)到目的，但在低光照下卻不可行。這主要是因?yàn)樵诟吖鈼l件下，去觸角的細(xì)胞會(huì)浮在表面獲得更多的光照，比野生型可接收到更多的光源。但在低光下無(wú)觸角的生物量與野生型相比類(lèi)似，因?yàn)榇藭r(shí)光照強(qiáng)度在表面和底下相差不大(polle,j.e.w.,kanakagiri,s.d.andmelis,a.(2003)tla1,adnainsertionaltransformantofthegreenalgachlamydomonasreinhardtiiwithatruncatedlight-harvestingchlorophyllantennasize.planta,217,49-59.)。盡管高光下可提高衣藻生物量，但強(qiáng)光能耗大，不利于大規(guī)模投入使用。因此，如何篩選在普通光照強(qiáng)度下仍具有較高生物量的微藻品系變得更加重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中缺乏合適的方法來(lái)篩選在普通光照強(qiáng)度下仍具有較高生物量的微藻品系的問(wèn)題，提供了一種高細(xì)胞生長(zhǎng)密度微藻突變體的篩選方法。一種高細(xì)胞生長(zhǎng)密度微藻突變體的篩選方法，包括以下步驟：(1)將抗性基因轉(zhuǎn)化微藻，通過(guò)固體平板抗性篩選獲得轉(zhuǎn)入抗性基因序列的突變微藻的單藻落，收集各個(gè)單藻落獲得微藻突變體文庫(kù)；(2)從微藻突變體文庫(kù)中的每個(gè)單藻落取樣混合后在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并連續(xù)傳代；(3)每傳代若干次用抗性基因序列特異性的rflp分析方法檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示只剩一種微藻突變體時(shí)結(jié)束篩選，獲得一株高細(xì)胞生長(zhǎng)密度微藻突變體；當(dāng)檢測(cè)結(jié)果顯示還剩2～5種微藻突變體時(shí)，使用固體培養(yǎng)基進(jìn)行單藻落分離獲得高細(xì)胞生長(zhǎng)密度微藻突變體。從隨機(jī)插入突變法獲得的突變株中篩選細(xì)胞密度較高的突變子不能通過(guò)固體平板篩選獲得。因?yàn)橥坎荚谄桨迳系募?xì)胞并非同步生長(zhǎng)，且區(qū)域性營(yíng)養(yǎng)耗竭也會(huì)導(dǎo)致藻落大小與生長(zhǎng)密度缺乏相關(guān)性。因此，本發(fā)明選擇在液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代突變子混合藻液，由于密度高的突變子在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，富集之后高細(xì)胞密度突變株可在有效的傳代培養(yǎng)后從藻液中分離出來(lái)。為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)過(guò)程，本發(fā)明采用rflp分析方法對(duì)富集效果進(jìn)行追蹤測(cè)試。rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性)是指基因型之間限制性片段長(zhǎng)度的差異，這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的。通過(guò)使用限制性?xún)?nèi)切酶酶切dna，然后用凝膠電泳分開(kāi)dna片段，再把dna片段轉(zhuǎn)移到濾膜上，利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的dna片段(southern雜交)，最后進(jìn)行結(jié)果分析。在本發(fā)明中，抗性標(biāo)記基因插入位置不同，使用特定的限制性?xún)?nèi)切酶(一般是抗性標(biāo)記基因序列中不包含的)處理后，所得的片段中，包含抗性標(biāo)記基因的酶切片段長(zhǎng)度會(huì)有差異，再使用針對(duì)該抗性標(biāo)記基因序列的探針進(jìn)行southern雜交檢測(cè)。優(yōu)選的，所述微藻為萊茵衣藻。本發(fā)明篩選方法也同樣適用于其他可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的微藻，比如小球藻(chlorellasp.)，鹽藻(dunaliellasalina)，團(tuán)藻(volvoxcarteri)，三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)等。優(yōu)選的，所述抗性基因?yàn)閍ada基因、ble基因、aphⅷ基因或als基因。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述抗性基因?yàn)閎le基因。本發(fā)明篩選方法使用的抗性基因一方面是用于對(duì)突變株進(jìn)行抗性篩選，另一方面是用于rflp分析方法檢測(cè)，所以，只要滿足這兩點(diǎn)的基因序列或片段均適用于本發(fā)明篩選方法。優(yōu)選的，所述抗性基因轉(zhuǎn)化微藻使用電轉(zhuǎn)化法。當(dāng)然，使用其他適用于微藻的轉(zhuǎn)化方法也可以。比如基因槍法，又稱(chēng)為微粒子轟擊法，可適用于各種類(lèi)型的微藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化；針對(duì)細(xì)胞壁缺陷型的微藻可使用玻璃珠轉(zhuǎn)化法。優(yōu)選的，傳代時(shí)接種密度為od750為0.1～0.2。進(jìn)一步優(yōu)選的，傳代次數(shù)不少于30次。傳代次數(shù)與rflp檢測(cè)結(jié)果相結(jié)合，如果在傳代較少的時(shí)候，rflp檢測(cè)結(jié)果顯示突變株種類(lèi)已經(jīng)很少時(shí)，即可使用固體培養(yǎng)基來(lái)分離；而如果傳代次數(shù)大于30次時(shí)，rflp檢測(cè)結(jié)果顯示突變株種類(lèi)仍然較多時(shí)，需要繼續(xù)進(jìn)行傳代來(lái)篩選富集。優(yōu)選的，步驟(3)中，每傳代5～15次用抗性基因序列特異性的rflp分析方法檢測(cè)。每傳代一次，可能rflp檢測(cè)結(jié)果變化較小，所以可以在連續(xù)傳代幾次之后，進(jìn)行一次檢測(cè)。優(yōu)選的，rflp分析時(shí)，先用限制性酶進(jìn)行酶切，再采用southern法檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)用dig標(biāo)記的針對(duì)抗性基因的探針雜交。本發(fā)明篩選方法采用抗性基因隨機(jī)插入突變，然后將獲得的各突變體混合進(jìn)行液體培養(yǎng)連續(xù)傳代，傳代過(guò)程中生長(zhǎng)快的突變株逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)得到富集，連續(xù)傳代過(guò)程中使用rflp分析方法監(jiān)測(cè)篩選效果，最終在普通光照條件下即可篩選獲得生長(zhǎng)密度比野生型高的微藻突變體。本發(fā)明篩選方法無(wú)需高光條件，無(wú)需特殊的檢測(cè)設(shè)備，能夠快速、簡(jiǎn)便、高效地完成篩選過(guò)程。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例2中傳代培養(yǎng)突變株的生長(zhǎng)曲線圖。圖2為連續(xù)傳代培養(yǎng)流程示意圖。圖3為rflp分析結(jié)果圖，其中a、b、c分別代表3個(gè)重復(fù)，泳道m(xù)為dnamarker(下同)，泳道c為作為對(duì)照的野生型萊茵衣藻cc503(下同)，泳道0、10、20、30分別代表傳代次數(shù)。圖4為實(shí)施例4中傳代篩選結(jié)束后分別對(duì)a、b、c三組實(shí)驗(yàn)篩選到的突變株進(jìn)行驗(yàn)證的rflp分析結(jié)果圖，其中泳道i1～i6分別代表單個(gè)分離株(下同)。圖5為實(shí)施例4中雙酶切基因組dna后的rflp分析結(jié)果圖。圖6為實(shí)施例5中篩選所得3株突變株的生長(zhǎng)曲線檢測(cè)結(jié)果圖。圖7為實(shí)施例5中篩選所得3株突變株的生長(zhǎng)速率比較圖，其中wt表示野生型萊茵衣藻cc503(下同)。圖8為實(shí)施例5中篩選所得3株突變株在hs培養(yǎng)基和2倍hs培養(yǎng)基中最大生物量結(jié)果比較圖。圖9為實(shí)施例5中篩選所得3株突變株的葉綠素含量結(jié)果圖。具體實(shí)施方式萊茵衣藻原始藻株：萊茵衣藻cc503，購(gòu)自衣藻資源中心(chlamydomonasresourcecenter)(網(wǎng)址：www.chlamy.org)。質(zhì)粒psp124s：購(gòu)自衣藻資源中心，該質(zhì)粒包含ble基因序列。萊茵衣藻od值檢測(cè)均在750nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。hs培養(yǎng)基：配方參見(jiàn)文獻(xiàn)sueoka,n.(1960)proc.natl.acad.sci.usa46,83-91，具體成分如下：母液1(鹽溶液)：nh4cl100.0gmgso4·7h2o4.0gcacl2·2h2o2.0g加h2o至1l母液2(磷酸緩沖液)：k2hpo4288.0gkh2po4144.0g加h2o至1l母液3(微量元素)：hs培養(yǎng)基使用時(shí)：5ml母液1，5ml母液2，1ml母液3，加水至1l。tap培養(yǎng)基：配方參見(jiàn)文獻(xiàn)gorman,d.s.,andr.p.levine(1965)proc.natl.acad.sci.usa54,1665-1669，具體成分如下：母液1(tap鹽)：nh4cl15.0gmgso4·7h2o4.0gcacl2·2h2o2.0g加h2o至1l母液2(磷酸緩沖液)：k2hpo428.8gkh2po414.4g加h2o至100ml母液3(微量元素)：tap培養(yǎng)基使用時(shí)：2.42gtris，25ml母液1，0.375ml母液2，1ml母液31ml乙酸(glacialaceticacid)，加h2o至1l。實(shí)施例1上游引物ble_1f：5’-tggaagcttaaatgccagaaggagcgcagcc-3’；下游引物ble_1160r：5’-ccgagctcagcttcaaatacgcccagcccg-3’，使用上述引物擴(kuò)增質(zhì)粒psp124s，獲得ble基因序列，核苷酸序列如seqidno.1所示，長(zhǎng)度為1.1kb。使用電轉(zhuǎn)化法將上述ble基因片段轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻cc503細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化株在具有2.5μg/ml博來(lái)霉素(zeocin)的tap平板上進(jìn)行篩選，平板上長(zhǎng)出的萊茵衣藻藻落即為轉(zhuǎn)化了ble基因片段的突變株，將所有獲得的藻落一一保存到96孔板中，構(gòu)建萊茵衣藻突變體文庫(kù)。本實(shí)施例經(jīng)上述方法獲得了1000多個(gè)萊茵衣藻突變株。電轉(zhuǎn)化步驟：(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的藻液2500rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞，經(jīng)電轉(zhuǎn)液(geneartmaxefficiencytransformationreagent)清洗離心3次后，重懸至終濃度為2×108～3×108個(gè)/ml。(2)每250μl細(xì)胞懸液加入2～4μg線性化dna，2～8℃下孵育5分鐘。(3)電轉(zhuǎn)化之前將含dna的250μl細(xì)胞懸液加入到預(yù)冷的比色皿中。(4)電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓500v，電容為50μf，電阻為800ω。通常，電脈沖持續(xù)時(shí)間為30ms。(5)電轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞復(fù)蘇15分鐘。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有10mltap-40mm蔗糖溶液50ml離心管內(nèi)室溫放置；然后將藻液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)為26℃，光照強(qiáng)度為50μem-2s-1孵育14～16h。(6)2500rpm離心5分鐘收集藻細(xì)胞，棄上清，將藻液重懸于200μltap培養(yǎng)基中。(7)在含有2.5μg/ml博來(lái)霉素(zeocin)的tap培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選突變體，多板篩選匯集總共獲得了1000多個(gè)萊茵衣藻突變株。這些突變株培養(yǎng)于96孔板的液體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基體積200μl)中保存?zhèn)溆?。?shí)施例2將實(shí)施例1中獲得的1000多個(gè)突變株從96孔板各取10μl藻液，混合后離心，用新鮮配制的含2.5μg/mlzeocin的hs培養(yǎng)液懸浮，接種于含100ml(含2.5μg/mlzeocin)的hs培養(yǎng)液的搖瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)光照條件為連續(xù)的50μmolm-2s-1。在這種情況下，初始培養(yǎng)的突變株(約0.15od)在1、2、3、4天可分別達(dá)到約0.4od、約0.95od、約1.35od、約1.45od(圖1)。細(xì)胞在第三天開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期，選取這一點(diǎn)用作接種的起點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)(圖2)。待初始混合藻液生長(zhǎng)至od750＝1.0時(shí)，突變株以約為0.15od的初始濃度接種至3個(gè)搖瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，分為a，b，c三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。連續(xù)的傳代在平臺(tái)早期(3天，約1.4od)進(jìn)行，取新鮮培養(yǎng)基(含2.5μg/mlzeocin)重新接種(0天，約0.15od)，繼續(xù)進(jìn)行對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期的傳代。該連續(xù)傳代次數(shù)為30代。實(shí)施例3rflp檢測(cè)為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)過(guò)程，本發(fā)明采用rflp對(duì)富集效果進(jìn)行追蹤測(cè)試。由于rflp圖譜中每個(gè)插入突變株至少有一條獨(dú)特大小的dna片段，在含1000多個(gè)插入突變株的初始培養(yǎng)中可以見(jiàn)到復(fù)雜的rflp圖譜。隨著傳代的繼續(xù)，rflp圖譜的復(fù)雜性下降，表明在連續(xù)傳代培養(yǎng)中hcd突變株(high-cell-density的簡(jiǎn)寫(xiě)，代表篩選到的高細(xì)胞密度突變株)的逐漸富集。大概30個(gè)傳代循環(huán)后，rflp中只留下幾條帶，含有這些片段的突變株被認(rèn)為是hcd的候選突變株。為檢測(cè)傳代過(guò)程中藻株變化情況，對(duì)突變株進(jìn)行了ble序列特異性的rflp分析。具體操作如下：收集初培養(yǎng)細(xì)胞，傳代第10代，20代，30代的細(xì)胞樣品，采用ctab緩沖液裂解，苯酚∶氯仿法提取基因組dna。用限制性?xún)?nèi)切酶ncoi酶切dna，檢測(cè)rflp圖譜情況。檢測(cè)探針從模板質(zhì)粒psp124s中利用pcrdig探針合成試劑盒(roche，pcrdigprobesynthesiskit，貨號(hào)：11636090910)合成，合成引物如下：ble_e2_f：5'-tggccaagctgaccagcgccgttcc-3'；ble_e3_r：5'-cctccgaccactcggcgtacagc-3'，最后所得探針序列如seqidno.2所示，探針偶聯(lián)了堿性磷酸酶的抗地高辛抗體。southern雜交按照dig標(biāo)記膜雜交方式進(jìn)行。具體步驟如下，分離電泳后的基因組dna，將dna片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，采用上述合成的dig標(biāo)記的探針與其雜交并檢測(cè)。檢測(cè)反應(yīng)中α-dig-ap按1∶15000稀釋?zhuān)瑸閮?yōu)化檢測(cè)步驟，洗脫液成分為0.1m馬來(lái)酸，3mnacl，0.3％tween20，ph8.0。在實(shí)施例2中的3個(gè)重復(fù)的傳代實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)a，b，c中分別有1，3和3個(gè)優(yōu)勢(shì)片段(圖3)。一個(gè)在實(shí)驗(yàn)a中存在的優(yōu)勢(shì)片段stn_a1在實(shí)驗(yàn)組b和c中均存在。在實(shí)驗(yàn)b中存在的片段stn_b3在c中也存在(stn_c2)。因此，進(jìn)行連續(xù)傳代后，富集獲得至少4個(gè)可能的hcd突變株。實(shí)施例4將實(shí)施例2傳代30次后獲得的突變株進(jìn)行固體平板單藻落篩選，每板挑取5-6個(gè)單藻落再次進(jìn)行rflp驗(yàn)證分析。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)a中的5個(gè)突變株都顯示有一條片段同stn_a1片段相似。實(shí)驗(yàn)b中，分離的2，4，6同stn_b1片段相似，分離的3和5片段同stn_b3相似，分離的1同stn_b2片段相似。實(shí)驗(yàn)c中，所有分離的片段都同stn_c1相似，未發(fā)現(xiàn)包含同stn_c2和stn_c3片段大小的分離株(圖4)。為驗(yàn)證在分離株中觀察到的片段確實(shí)同30次傳代后富集的一致，每個(gè)分離株的基因組經(jīng)ncoi和kpni的雙酶切后進(jìn)行了rflp分析。雙酶切后的片段大小同30次傳代后富集藻株的一致(圖5)。結(jié)果表明，分離株是所有插入突變株中的優(yōu)勢(shì)種。因此，把包含stn_b1(分離株stn_a1_i1-i5；stn_b1_i2、i4和i6；stn_c1_i1和i3-i6)，stn_b2(分離株stn_b2_i1)和stn_b3(分離株stn_b3_i3和i5)片段的突變株分別命名為hcd1，hcd2和hcd3突變株。因此，本發(fā)明采用連續(xù)傳代的方式富集獲得了具有以上3株高細(xì)胞生長(zhǎng)密度突變株，連續(xù)傳代法能夠分離快速生長(zhǎng)或密集生長(zhǎng)的突變株。實(shí)施例5為分析hcd突變株的生長(zhǎng)速率和最大細(xì)胞密度，突變株在連續(xù)光照強(qiáng)度為50μmolm-2s-1的hs培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線(圖6)、生長(zhǎng)速率及生物量。結(jié)果顯示，hcd1和hcd2的生長(zhǎng)速率均高于野生型(p-value<0.001)(圖7)。hs培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的hcd1、hcd2和hcd3最大細(xì)胞密度(最大細(xì)胞干重，cdw)比野生型高22％-40％；當(dāng)培養(yǎng)基在2倍hs培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)，hcd突變株的最大細(xì)胞密度比野生型高50％-100％(圖8)。同時(shí)，葉綠素含量(圖9)和細(xì)胞形態(tài)顯示，hcd突變株與野生型相比未見(jiàn)顯著差異。綜上，hcd突變株已經(jīng)具備了優(yōu)于野生型萊茵衣藻的生長(zhǎng)密度和生物量。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12