一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CXCR4的iPSCs的方法及其應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

具備多向分化能力的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)是治療心肌梗死的理想種子細(xì)胞，但心梗后局部微環(huán)境的變化以及較低細(xì)胞移植歸巢率限制了其應(yīng)用。

基質(zhì)衍生因子(stromalderivedfactor-1，sdf-1)即cxcl12，可在心肌梗死后的心梗區(qū)域局部上調(diào)，cxcl12通過與其獨(dú)特受體cxcr4相互作用可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞遷移、存活，在胚胎生長發(fā)育及器官形成中發(fā)揮著極重要作用。

tale(transcriptionactivator-like(tal)effector)靶向基因操作技術(shù)是一項(xiàng)嶄新的分子生物學(xué)工具，是基因功能研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重大技術(shù)突破。研究人員發(fā)現(xiàn)，來自植物病原菌xanthomonas的tal蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。基于這一對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用tal的序列模塊構(gòu)建特異性結(jié)合任意dna序列的重組蛋白，可實(shí)現(xiàn)操作目標(biāo)基因的目的。

目前尚無通過talens技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4-ipscs以提高ipscs在治療心肌梗死方面的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs的方法。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，talens技術(shù)可穩(wěn)定構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4-ipscs，且不改變其分化潛能及其基本形態(tài)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)可有效提高其細(xì)胞歸巢率。因此，基于talens技術(shù)構(gòu)建的cxcr4-ipscs可提高干細(xì)胞歸巢效率。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs的方法，包括如下步驟：

利用tales技術(shù)誘導(dǎo)cxcr4基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化，通過cxcr4慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染ipscs，得到穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs，從而實(shí)現(xiàn)靶向基因的過表達(dá)。

一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs的方法，所述的talens技術(shù)：

具體包括如下步驟：

1)cxcr4基因(nm_022205)的啟動(dòng)子區(qū)富含cpg甲基化位點(diǎn)，我們已經(jīng)成功合成了能夠識(shí)別并定位cxcr4基因啟動(dòng)子區(qū)dna序列的tale基因，這兩個(gè)人工合成基因分別定位cxcr4a：5′-tagacccacactgacttaaaac-3′和cxcr4b：5′-ttcaattttgttgcctggtgca-3′。

2)然后將這兩個(gè)基因分別同dna去甲基化酶tet1的催化域(catalyticdomain)融合，并在tet1c的末端用t2a技術(shù)連接綠色熒光蛋白(gfp)，構(gòu)建cxcr4a-tet1c-gfp和cxcr4b-tet1c-gfp質(zhì)粒；最后將這兩個(gè)融合基因分別克隆到慢病毒質(zhì)粒pcdhcd527a。

3)慢病毒的包裝和濃縮：將慢病毒包裝質(zhì)粒和載體質(zhì)粒cxcr4-tet1c-gfp以1：1的摩爾比例混合，在lipofectamine2000的作用下共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12h后換液，加入新鮮293ft細(xì)胞培養(yǎng)液；72h后觀察有強(qiáng)綠色熒光及細(xì)胞融合現(xiàn)象時(shí)收集培養(yǎng)上清，4℃、4500r/min離心15min，將病毒上清液用0.45μm濾膜過濾以去除細(xì)胞碎片，4℃、50000×g高速離心90min；用rnase-freel-dmem懸浮病毒顆粒沉淀，-80℃凍存?zhèn)溆?；同法?gòu)建只含綠色熒光蛋白的空病毒；

4)cxcr4-tet1c-gfp病毒顆粒穩(wěn)定感染ipscs：將對(duì)數(shù)生長期ipscs消化并離心后，以分化培養(yǎng)基重懸成濃度1×10⁶/l細(xì)胞懸液，將病毒cxcr4-tet1c-gfp和空病毒以10:1轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的；每天更換1次培養(yǎng)基；病毒感染24～48h后，更換新鮮培養(yǎng)液；并同時(shí)使用氨芐青霉素進(jìn)行篩選；得到穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs。

一種穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs，通過上述方法構(gòu)建得到。

所述的穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs在增強(qiáng)細(xì)胞遷移特性中的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)原理：本申請(qǐng)通過轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，talens)技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)cxcr4的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)，ipscs在修復(fù)急性心肌梗死后心肌上具有巨大臨床應(yīng)用前景，但其細(xì)胞移植歸巢效率低下及梗死部位惡劣的微環(huán)境造成其治療效果受限，通過生物手段提高干細(xì)胞歸巢率及治療效率在預(yù)防和治療心肌損傷相關(guān)心血管疾病(如缺血性心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明通過cxcr4慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染ipscs實(shí)現(xiàn)cxcr4過表達(dá)，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢驗(yàn)慢病毒顆粒對(duì)ipscs凋亡率影響，bsp(bisulfitesequencingpcr)、倒置顯微鏡、共聚焦顯微鏡和westernblots證實(shí)cxcr4可穩(wěn)定在細(xì)胞表面表達(dá)。體外遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)可顯著提高其細(xì)胞遷移率。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明中通過tales技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)cxcr4的ipscs，并通過qpcr、形態(tài)學(xué)鑒定和bsp證實(shí)過表達(dá)cxcr4后對(duì)ipscs的干性維持基因無影響，且可顯著提高體外細(xì)胞遷移率。

附圖說明

圖1是定位cxcr4a和cxcr4b的示意圖。

圖2是cxcr4b-tet1c-gfp質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。

圖3是慢病毒質(zhì)粒pcdhcd527a的骨架系統(tǒng)。

圖4是ipscs中cxcr4表達(dá)情況，其中，a：共聚焦顯微鏡下cxcr4表達(dá)情況(600×)；b：倒置顯微鏡下的ipscs轉(zhuǎn)染前后的形態(tài)學(xué)改變(40×)；c：mrna(cxcr4、oct4、c-myc)表達(dá)情況；d：cxcr4蛋白表達(dá)情況；e：cxcr4蛋白表達(dá)的相對(duì)定量(control：對(duì)照組，細(xì)胞不做任何處理；cxcr4-ipscs：cxcr4過表達(dá)的ipscs；且cxcr4代表cxcr4b)。

圖5是cxcr4慢病毒顆粒對(duì)ipscs凋亡影響；其中，a：流式細(xì)胞圖；b：凋亡數(shù)據(jù)分析(control：對(duì)照組，細(xì)胞不做任何處理；cxcr4-ipscs：cxcr4過表達(dá)的ipscs；emptyvectoripscs：空病毒轉(zhuǎn)染組；且cxcr4代表cxcr4b)。

圖6是體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；其中，a：transwell形態(tài)圖；b：細(xì)胞遷移率柱狀圖(cxcr4代表cxcr4b)。

圖7是cxcr4、oct4、c-myc甲基化狀態(tài)(cxcr4代表cxcr4b)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。未注明具體來源的試劑及生物材料，均為市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1制備ipscs

(1)滋養(yǎng)層(mef)的制備：0.1％(體積分?jǐn)?shù))的明膠加入t25培養(yǎng)瓶，搖勻覆蓋即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置20min后將其吸除，加入5～6ml預(yù)熱37℃的mef培養(yǎng)液，與此同時(shí)將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)(購自上海中科院細(xì)胞庫)從液氮中快速取出，置于37℃水浴中快速融解并立即用體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精擦拭凍存管后拿到超凈臺(tái)內(nèi)，將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含mef培養(yǎng)液的15ml離心管內(nèi)，以1000rpm離心5min，棄上清液重懸后加入到t25培養(yǎng)瓶中，放置到co2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后得到滋養(yǎng)層即可加入ipscs；

(2)ipscs的培養(yǎng)以及傳代：步驟(1)中培養(yǎng)24h后得到的滋養(yǎng)層，4倍顯微鏡下可見已經(jīng)均勻鋪滿t25培養(yǎng)瓶，此時(shí)可迅速從液氮中取出ipscs(中科院上海生科院生化細(xì)胞所和中科院上海生科院生化細(xì)胞所干細(xì)胞平臺(tái)提供)凍存管，復(fù)蘇過程類似小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，將復(fù)蘇的ipscs直接傳入mef鋪板的t25培養(yǎng)瓶，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，每日換液并且觀察細(xì)胞集落形態(tài)的變化。待細(xì)胞集落長到合適大小及時(shí)傳代，pbs(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍后加入0.25％(體積分?jǐn)?shù))胰酶(含edta)消化，小鼠ipscs培養(yǎng)液終止消化，以1000rpm離心5min，棄上清加培養(yǎng)液吹打制備成單細(xì)胞懸液。

實(shí)施例2制備cxcr4慢病毒顆粒

一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs的方法，所述的talens技術(shù)：

基本方法如下：

1)cxcr4基因(nm_022205)的啟動(dòng)子區(qū)富含cpg甲基化位點(diǎn)，我們已經(jīng)成功合成了能夠識(shí)別并定位cxcr4基因啟動(dòng)子區(qū)dna序列的tale基因，這兩個(gè)人工合成基因分別定位cxcr4a：5′-tagacccacactgacttaaaac-3′和cxcr4b：5′-ttcaattttgttgcctggtgca-3′(如圖1所示)。

2)然后將這兩個(gè)基因分別同dna去甲基化酶tet1的催化域(catalyticdomain)融合，并在tet1c的末端用t2a技術(shù)連接綠色熒光蛋白(gfp)，構(gòu)建cxcr4a-tet1c-gfp和cxcr4b-tet1c-gfp質(zhì)粒(如圖2所示，cxcr4代表cxcr4b)。最后將這兩個(gè)融合基因分別克隆到慢病毒質(zhì)粒pcdhcd527a(骨架系統(tǒng)見圖3所示)。

3)慢病毒的包裝和濃縮：將慢病毒包裝質(zhì)粒和載體質(zhì)粒cxcr4-tet1c-gfp以1：1的摩爾比例混合，在lipofectamine2000的作用下共轉(zhuǎn)染293ft細(xì)胞，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后換液，加入新鮮293ft細(xì)胞培養(yǎng)液。72h后觀察有強(qiáng)綠色熒光及細(xì)胞融合現(xiàn)象時(shí)收集培養(yǎng)上清，4℃、4500r/min離心15min，將病毒上清液用0.45μm濾膜過濾以去除細(xì)胞碎片，4℃、50000×g高速離心90min。用rnase-freel-dmem懸浮病毒顆粒沉淀，-80℃凍存?zhèn)溆?。同法?gòu)建只含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的空病毒。

4)慢病毒的滴度測定：接種293ft細(xì)胞于6孔板，每孔接種2×10⁵個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜；第2天將慢病毒溶液用無血清dmem(不含抗生素)按1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7進(jìn)行系列稀釋，將其分別加入到相應(yīng)的孔中，加入聚酰胺(polybrene)終濃度至8mg/l，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12h后全量換液，加入新鮮的293ft細(xì)胞培養(yǎng)液。第4天觀察熒光表達(dá)情況，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而減少，計(jì)數(shù)出表達(dá)熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)，將得到的數(shù)值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就得到病毒原液的滴度數(shù)。

5)cxcr4-tet1c-gfp病毒顆粒穩(wěn)定感染ipscs：將對(duì)數(shù)生長期ipscs消化并離心后，以分化培養(yǎng)基重懸成濃度1×10⁶/l細(xì)胞懸液，將病毒cxcr4-tet1c-gfp和空病毒以10:1轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的。每天更換1次培養(yǎng)基。病毒感染24～48h后，更換新鮮培養(yǎng)液。并同時(shí)使用氨芐青霉素進(jìn)行篩選。

所述的分化培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)分別為1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、0.25％β-巰基乙醇，15％胎牛血清的dmem。

6)流式細(xì)胞儀技術(shù)：制備單細(xì)胞細(xì)胞懸液后，冰預(yù)冷的70％的乙醇固定，4℃，1～2小時(shí)，細(xì)胞重懸，400目的篩網(wǎng)過濾1次，500～1000r/min離心5min，棄去pbs，1mlpi染液染色，4℃避光30min，pi用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析pi熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。

cxcr4慢病毒顆粒對(duì)ipscs凋亡影響，如圖5所示(control：對(duì)照組，細(xì)胞不做任何處理；cxcr4-ipscs：cxcr4過表達(dá)的ipscs；emptyvectoripscs：空病毒轉(zhuǎn)染組；且cxcr4代表cxcr4b)；其中，a：流式細(xì)胞圖；b：凋亡數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明：相比對(duì)照組而言，cxcr4慢病毒和空病毒對(duì)ipscs凋亡均存在一定的影響，可引起有效的凋亡；但cxcr4慢病毒和空病毒兩者間凋亡和增殖無顯著差異。

實(shí)施例3cxcr4過表達(dá)情況

單細(xì)胞克隆株在擴(kuò)增消化離心后進(jìn)行細(xì)胞爬片，pbs緩沖溶液沖洗3次后，小牛血清37℃孵育30min，一抗4℃過夜，二抗37℃孵育30min，dapa染色3～5min，共聚焦顯微鏡下觀察。

單細(xì)胞懸液經(jīng)過pbs緩沖液沖洗后，實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)技術(shù)：各組ipscs經(jīng)預(yù)處理48h后，按trizol操作說明書抽提樣品細(xì)胞的總rna。紫外分光光度計(jì)定量后，取總rna用反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cdna；于pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃首輪變性1min(stage1)；95℃變性15s，60℃退火和延伸45s(stage2)，40個(gè)循環(huán)后；95℃15s，60℃15s(stage3，dissociationstage)。為排除樣品上樣量差異造成的影響，每個(gè)基因的ct值都用管家基因gapdh的ct值進(jìn)行校正。

ipscs中cxcr4表達(dá)情況，如圖4所示(control：對(duì)照組，細(xì)胞不做任何處理；cxcr4-ipscs：cxcr4過表達(dá)的ipscs；且cxcr4代表cxcr4b)；其中，a：共聚焦顯微鏡下cxcr4表達(dá)情況(600×)；b：倒置顯微鏡下的ipscs轉(zhuǎn)染前后的形態(tài)學(xué)改變(40×)；c：mrna(cxcr4、oct4、c-myc)表達(dá)情況；d：cxcr4蛋白表達(dá)情況；e：cxcr4蛋白表達(dá)的相對(duì)定量。結(jié)果表明：共聚焦顯微鏡下可見cxcr4可在ipscs上大量表達(dá)，且倒置顯微鏡下無顯著形態(tài)學(xué)改變；qpcr技術(shù)結(jié)果提示cxcr4mrna水平相比對(duì)照組增加了1.8倍(p<0.05)，且對(duì)分化潛能控制基因oct-4和c-myc的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。westernblot結(jié)果相比對(duì)照組而言提示ipscs經(jīng)過talens的修飾cxcr4蛋白顯著提高6倍(p<0.05)。

實(shí)施例4cxcr4對(duì)ipscs遷移的影響

1)選用5mm孔徑的transwell小室(bectondickinsonlabware，usa)；

2)ipscs胰酶消化后重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；

3)實(shí)驗(yàn)分組：

①cxcr4-ipscs組(cxcr4過表達(dá)的ipscs)；

②ipscs組(ipscs不做任何處理)；

③vector-ipscs組(空病毒轉(zhuǎn)染組)；

④cxcr4-ipscs+cxcl12組；

⑤ipscs+cxcl12組；

⑥vector-ipscs+cxcl12組；

⑦amd3100+cxcr4-ipscs+cxcl12組；

⑧pd98059+cxcr4-ipscs+cxcl12組組；

⑨ly294002+cxcr4-ipscs+cxcl12組；

選用8mm孔徑的transwell小室，上室按實(shí)驗(yàn)分組分別加入5×10⁴/孔的細(xì)胞，以及cxcr4特異性阻斷劑amd3100(10μg/ml)、erk1/2特異阻斷劑pd98059(20μmol/l)、akt特異阻斷劑ly294002(20μmol/l)預(yù)處理1h，下室分別加入含或不含cxcl12(100ng/ml)的無血清培養(yǎng)基；37℃、co2培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，棄培養(yǎng)液，pbs沖洗2次，用棉簽刮輕輕刮除聚碳酸酯膜上層的細(xì)胞，將transwell小室室溫下置于4％多聚甲醛中固定10min，pbs沖洗2-3次，1％結(jié)晶紫室溫下染色15min；pbs沖洗2～3次，倒置相差顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)視野計(jì)數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)；結(jié)果如圖6所示(cxcr4代表cxcr4b)；其中，a：transwell形態(tài)圖；b：細(xì)胞遷移率數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明：transwell下室均未放置100ng/mlcxcl12的ipscs組、cxcr4-ipscs組、vector-ipscs組各組間細(xì)胞遷移數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。100ng/mlcxcl12預(yù)處理4h后，相比ipscs+cxcl12組的細(xì)胞遷移數(shù)而言，實(shí)驗(yàn)組cxcr4-ipscs+cxcl12組遷移至小室下層的細(xì)胞數(shù)量具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，而vector-ipscs組的遷移細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；經(jīng)過cxcr4受體拮抗劑amd3100和ly294002預(yù)處理1h后，相比cxcr4-ipscs+cxcl12組的高效遷amd3100+cxcr4-ipscs+cxcl12組的細(xì)胞遷移顯著減少(p<0.05)，但pd98059對(duì)cxcr4-ipscs的遷移無明顯的影響(p>0.05)。

實(shí)施例5ipscs過表達(dá)cxcr4后對(duì)分化潛能基因oct-4和c-myc的影響

利用qpcr技術(shù)(同上)以及bsp技術(shù)證實(shí)該方法可使ipscs穩(wěn)定cxcr4的同時(shí)，并不影響分化潛能基因。bsp技術(shù)：利用promegawizardgenomicdnapurificationkit(貨號(hào)cat.#a1125)抽提dna，qiagen公司的epitectbisulfitekit(貨號(hào)cat.no.59104)亞硫酸氫鹽修飾，再進(jìn)行基因的克隆測序，bsp擴(kuò)增的甲基化的引物：

bsp-cxcr4：183bp，15cpg，

bsp-cxcr4-f：5′-ggttttggatttatattgatttaaaatata-3′，

bsp-cxcr4-r：5′-ccaaacaacaaaattaaaatttctaac-3′；

bsp-c-myc：232bp，16cpg，

bsp-c-myc-f：5′-tttgttttttgaagggtagggt-3′，

bsp-c-myc-r：5′-aaaacaaaacccctctcactc-3′；

bsp-oct4：232bp，15cpg，

bsp-oct4-f：5′-tggttgagtgggttgtaaggataggt-3′，

bsp-oct4-r：5′-actccaaccctactaacccatcacc-3′。

cxcr4、oct4、c-myc甲基化狀態(tài)，如圖7所示(cxcr4代表cxcr4b)。結(jié)果表明：將經(jīng)過慢病毒顆粒處理篩選以及未處理的ipscs送至廣州艾基生物公司測序，可見cxcr4-ipscs上cxcr4的cpg位點(diǎn)有效去甲基化激活cxcr4內(nèi)源性表達(dá)，而對(duì)照組以甲基化為主(p<0.05)。oct4和c-myc基因的甲基化和去甲基化無顯著的改變(p>0.05)，cxcr4的表達(dá)量與其去甲基化狀態(tài)成正相關(guān)關(guān)系。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>暨南大學(xué)

<120>一種構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)cxcr4的ipscs的方法及其應(yīng)用

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