擬肽大環(huán)化合物的制作方法

本申請是2013年02月14日提交的發(fā)明名稱為“擬肽大環(huán)化合物”的第201380009782.9號(國際申請?zhí)杙ct/us2013/026238)中國專利申請的分案申請。

序列表

本申請包含序列表，該序列表已經(jīng)由efs-web以ascii格式提交。于2013年3月20日創(chuàng)建的所述ascii拷貝被命名為35224-766.601_sl.txt，大小為1,201,625字節(jié)。

背景技術(shù)：

人轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)p53響應(yīng)于dna損傷和細胞應(yīng)激而誘導(dǎo)細胞周期停滯和凋亡，從而在保護細胞免于惡性轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。e3遍在蛋白連接酶mdm2(也稱為hdm2)通過中和p53反式激活活性的直接結(jié)合相互作用而負調(diào)節(jié)p53的功能，導(dǎo)致p53蛋白質(zhì)從核輸出，并經(jīng)由遍在蛋白化-蛋白酶體途徑使p53降解。由缺失、突變或mdm2過表達而引起的p53活性喪失是人類癌癥的最常見缺陷。表達野生型p53的腫瘤易受到穩(wěn)定或提高活性p53濃度的藥劑的攻擊。在此背景下，已出現(xiàn)了對mdm2活性的抑制，作為經(jīng)過驗證的、用于在體外和體內(nèi)恢復(fù)p53活性并使癌細胞再次對凋亡敏感的方法。mdmx(mdm4)最近已被鑒定為p53的相似的負調(diào)節(jié)劑，并且研究顯示在mdm2和mdmx的p53結(jié)合界面之間具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性。p53-mdm2和p53-mdmx的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用由p53的同一個15個殘基的α螺旋反式激活域介導(dǎo)，所述α螺旋反式激活域插入mdm2和mdmx的表面上的疏水性裂隙內(nèi)。p53的這個域內(nèi)的三個殘基(f19、w23和l26)對與mdm2和mdmx的結(jié)合至關(guān)重要。

對于能夠與p53、mdm2和/或mdmx結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物存在相當(dāng)大的需求。本文提供了能調(diào)節(jié)p53活性的基于p53的擬肽大環(huán)化合物。本文還提供了能抑制p53、mdm2和/或mdmx蛋白之間相互作用的基于p53的擬肽大環(huán)化合物。此外，本文提供了能夠用于治療包括但不限于癌癥和其它高增生性疾病的疾病的基于p53的擬肽大環(huán)化合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文描述了與人p53的一部分相關(guān)的穩(wěn)定交聯(lián)的肽(“p53擬肽大環(huán)化合物”)。這些交聯(lián)的肽含有至少兩個經(jīng)修飾的氨基酸，這些氨基酸一起形成分子內(nèi)交聯(lián)，該分子內(nèi)交聯(lián)可幫助穩(wěn)定被認為對于p53與mdm2的結(jié)合和p53與mdmx的結(jié)合至關(guān)重要的p53一部分的α螺旋二級結(jié)構(gòu)。因此，本文描述的交聯(lián)多肽可具有相對于對應(yīng)的非交聯(lián)多肽改善的生物活性。據(jù)認為，p53擬肽大環(huán)化合物干擾p53與mdm2和/或p53與mdmx的結(jié)合，從而釋放功能性p53并抑制其破壞。本文描述的p53擬肽大環(huán)化合物可治療性地使用，例如用來治療以不希望的低p53水平或低p53活性為特征的癌癥和其它病癥，以及/或者用來治療以不希望的高水平mdm2或mdmx活性為特征的癌癥和其它病癥。p53擬肽大環(huán)化合物也可用于治療與遭到破壞的p53轉(zhuǎn)錄途徑的調(diào)節(jié)相關(guān)的任何病癥(這種遭到破壞的調(diào)節(jié)導(dǎo)致過量細胞存活和增殖的病狀，如癌癥和自身免疫病)，以及不適當(dāng)?shù)募毎芷谕偷蛲龅牟?，如神?jīng)變性和免疫缺陷。在一些實施方案中，p53擬肽大環(huán)化合物與mdm2(例如，登錄號：228952；gi：228952)和/或mdmx(也被稱為mdm4；登錄號：88702791；gi：88702791)結(jié)合。

在一個方面，本文提供一種擬肽大環(huán)化合物，其包含的氨基酸序列與選自表1、表1a、表1b或表1c中氨基酸序列的氨基酸序列至少約60％、80％、90％或95％相同?；蛘?，所述擬肽大環(huán)化合物的氨基酸序列選自表4中的氨基酸序列。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物不是如表2a或2b所示的肽。在其它情況下，該擬肽大環(huán)化合物不包含如表2a或2b所示的結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物具有選自表1的氨基酸序列。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物具有選自表1a的氨基酸序列。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物具有選自表1b的氨基酸序列。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物具有選自表1c的氨基酸序列。

或者，所述擬肽大環(huán)化合物的氨基酸序列如上所述進行選擇，并且進一步其中該大環(huán)化合物不包括硫醚或三唑。在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物包含螺旋，如α-螺旋。在其它實施方案中，擬肽大環(huán)化合物包含α,α-二取代的氨基酸。擬肽大環(huán)化合物可包含連接至少兩個氨基酸的α-位的交聯(lián)體(crosslinker)。所述兩個氨基酸中的至少一個可以是α,α-二取代的氨基酸。

在一些實施方案中，提供了下式的擬肽大環(huán)化合物：

其中：

各個a、c、d和e獨立地為氨基酸；

b為氨基酸、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2和l3獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v和w獨立地為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

u為1-10的整數(shù)，例如1-5、1-3或1-2；

x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)，例如x+y+z之和為2、3或6；且

n為1-5的整數(shù)。

在一些實施方案中，w>2并且由e表示的前兩個氨基酸中的每一個包含不帶電荷的側(cè)鏈或帶負電荷的側(cè)鏈。

在一些實施方案中，由e代表的第一c-末端氨基酸和/或第二c-末端氨基酸包含疏水性側(cè)鏈。例如，由e代表的第一c-末端氨基酸和/或第二c-末端氨基酸包含疏水性側(cè)鏈，例如大的疏水性側(cè)鏈。

在一些實施方案中，w為3-1000。例如，由e代表的第三氨基酸包含大的疏水性側(cè)鏈。

在其它實施方案中，請求保護的擬肽大環(huán)化合物不包括以下序列：

ac-rtqatf$r8nqwaibanle$tnaibtr-nh2(seqidno:1),

ac-rtqatf$r8nqwaibanle$tnaibtr-nh2(seqidno:2),

ac-$r8sqqtfs$lwrllaibqn-nh2(seqidno:3),

ac-qsq$r8tfsnlw$llaibqn-nh2(seqidno:4),

ac-qs$r5qtfstnlw$llaibqn-nh2(seqidno:5),或

ac-qsqq$r8fsnlwr$laibqn-nh2(seqidno:6)。

在其它實施方案中，請求保護的擬肽大環(huán)化合物不包括以下序列：

ac-q$r8qqtfsn$wrllaibqn-nh2(seqidno:7)。

還提供了下式的擬肽大環(huán)化合物：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成接連體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10；且

n為1-5的整數(shù)。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中每個x為氨基酸；

各個d獨立地為氨基酸；

各個e獨立地為氨基酸，例如選自ala(丙氨酸)、d-ala(d-丙氨酸)、aib(α-氨基異丁酸)、sar(n-甲基甘氨酸)和ser(絲氨酸)的氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10；且

n為1-5的整數(shù)。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa8、xaa9和xaa10中的至少兩個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體，其中l(wèi)在e構(gòu)型中包含至少一個雙鍵；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)；

w為3-1000的整數(shù)；

n為1-5的整數(shù)；且

xaa7為boc-保護的色氨酸。

在本文所述的任何通式的一些實施方案中，[d]v為–leu1-thr2。在本文所述的通式的其它實施方案中，除由e表示的第三氨基酸以外的各個e為選自ala(丙氨酸)、d-ala(d-丙氨酸)、aib(α-氨基異丁酸)、sar(n-甲基甘氨酸)和ser(絲氨酸)的氨基酸。

在一些實施方案中，w為3-10的整數(shù)，例如3-6、3-8、6-8或6-10。在一些實施方案中，w為3。在其它實施方案中，w為6。在一些實施方案中，v為1-10的整數(shù)，例如2-5。在一些實施方案中，v為2。

在一些實施方案中，本文公開的肽結(jié)合至少部分由mdmx氨基酸側(cè)鏈所限定的結(jié)合位點l17、v46、m50、y96(形成口袋的邊緣)和l99。不受理論的束縛，與這樣的結(jié)合位點的結(jié)合改善了一種或多種性質(zhì)，如結(jié)合親和力、凋亡的誘導(dǎo)、體內(nèi)或體外抗腫瘤效力，或降低的mdmx結(jié)合親和力與mdm2結(jié)合親和力之比。

在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的對mdm2或mdmx的結(jié)合親和力。在其它情況下，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有降低的mdmx結(jié)合親和力與mdm2結(jié)合親和力之比。在另外其它的情況下，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的針對p53陽性腫瘤細胞系的體外抗腫瘤效力。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物在p53陽性腫瘤細胞系中顯示出改善的體外凋亡誘導(dǎo)。在其它情況下，權(quán)利要求1的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的針對p53陽性腫瘤細胞系與針對p53陰性或突變腫瘤細胞系的體外抗腫瘤效力比。在一些情況下，該改善的體外效力比為1-29、≥30-49或≥50。在另外其它的情況下，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的針對p53陽性腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤效力。在一些情況下，該改善的體內(nèi)效力比為-29、≥30-49或≥50。在另外其它的情況下，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物在p53陽性腫瘤中具有改善的體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的細胞透性。在其它情況下，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的溶解度。

在一些實施方案中，xaa5為glu或其氨基酸類似物。在一些實施方案中，xaa5為glu或其氨基酸類似物，并且其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中xaa5為ala的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的性質(zhì)，如改善的結(jié)合親和力、改善的溶解度、改善的細胞效力、改善的細胞透性、改善的體內(nèi)或體外抗腫瘤效力，或改善的凋亡誘導(dǎo)。

在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中xaa5為ala的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的對mdm2或mdmx的結(jié)合親和力。在其它實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中xaa5為ala的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有降低的mdmx結(jié)合親和力與mdm2結(jié)合親和力之比。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物相對于其中xaa5為ala的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的溶解度，或者該擬肽大環(huán)化合物相對于其中xaa5為ala的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的細胞效力。

在一些實施方案中，xaa5為glu或其氨基酸類似物，并且其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中xaa5為ala的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的生物活性，如改善的結(jié)合親和力、改善的溶解度、改善的細胞效力、改善的螺旋度、改善的細胞透性、改善的體內(nèi)或體外抗腫瘤效力，或改善的凋亡誘導(dǎo)。

在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物具有針對p53+/+細胞系的活性，該活性為針對p53-/-細胞系的結(jié)合親和力的至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、70倍或100倍。在一些實施方案中，該擬肽大環(huán)化合物具有針對p53+/+細胞系的活性，該活性為針對p53-/-細胞系的結(jié)合親和力的1-29倍、30-49倍或≥50倍。例如，活性可以作為ic50值進行測定。例如，該p53+/+細胞系為sjsa-1、rko、hct-116或mcf-7，且該p53-/-細胞系為rko-e6或sw-480。在一些實施方案中，該肽具有小于1μm的針對p53+/+細胞系的ic50。

在一些實施方案中，xaa5為glu或其氨基酸類似物，并且該擬肽大環(huán)化合物具有的針對p53+/+細胞系的活性至少為其針對p53-/-細胞系的結(jié)合親和力的10倍。

另外，提供了一種治療受試者的癌癥的方法，包括向該受試者施用擬肽大環(huán)化合物。在一些實施方案中，該癌癥為頭頸癌、黑素瘤、肺癌、乳腺癌或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

還提供了一種調(diào)節(jié)受試者中的p53或mdm2或mdmx的活性的方法，包括向該受試者施用擬肽大環(huán)化合物，或者一種拮抗受試者中的p53與mdm2和/或mdmx蛋白質(zhì)之間的相互作用的方法，包括向該受試者施用這樣的擬肽大環(huán)化合物。

本文提供了一種制備包含式(i)的擬肽大環(huán)化合物的組合物的方法：

該擬肽大環(huán)化合物包含與選自表1、表1a、表1b或表1c中的氨基酸序列的氨基酸序列約60％至約100％相同的氨基酸序列，該方法包括用催化劑處理式(ii)的化合物：

以產(chǎn)生式i的化合物

其中，在式(i)和(ii)的化合物中，

各個a、c、d和e獨立地為氨基酸；

各個b獨立地為氨基酸、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

各個r1和r2獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個r3獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

各個l1、l2和l3獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4和r4’獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k獨立地為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r7獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

各個r8獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

各個v和w獨立地為1-1000的整數(shù)；

u為1-10的整數(shù)；

各個x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)；

各個n獨立地為1-5的整數(shù)；

各個o獨立地為1-15的整數(shù)；

各個p獨立地為1-15的整數(shù)；

“(e)”表示反式雙鍵；且

式(i)和(ii)化合物中存在的氨基酸a、c和/或b(當(dāng)b為氨基酸時)中的一個或多個具有攜帶保護基團的側(cè)鏈。

在一些實施方案中，該保護基團是氮原子保護基團。

在一些實施方案中，該保護基團為boc基團。

在一些實施方案中，所述攜帶保護基團的氨基酸的側(cè)鏈包含受保護的吲哚。

在一些實施方案中，在其側(cè)鏈上攜帶所述保護基團的氨基酸為在其吲哚氮上被保護基團所保護的色氨酸(w)。例如，該保護基基團為boc基團。

在一些實施方案中，在式ii的化合物與催化劑接觸的步驟后，以等于或高于為z異構(gòu)體的對應(yīng)化合物的量獲得式(i)的化合物。例如，在式ii的化合物與催化劑接觸的步驟后，以2、3、4、5、6、7、8、9或10倍于為z異構(gòu)體的對應(yīng)化合物的量獲得式(i)的化合物。

在一些實施方案中，所述催化劑為釕催化劑。

在一些實施方案中，所述方法進一步包括用還原劑或氧化劑處理式(i)的化合物的步驟。

在一些實施方案中，式(ii)的化合物附著到固體載體上。在其它實施方案中，式(ii)的化合物不附著到固體載體上。

在一些實施方案中，所述方法進一步包括從式(i)的化合物上除去保護基團。

在一些實施方案中，在約20℃至約80℃的溫度下進行閉環(huán)復(fù)分解反應(yīng)。

在一些實施方案中，式(i)的擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa8、xaa9和xaa10中的至少兩個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體，其中l(wèi)在e構(gòu)型中包含至少一個雙鍵；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)；

w為3-1000的整數(shù)；

n為1-5的整數(shù)；且

xaa7為boc-保護的色氨酸。

在一些實施方案中，式(i)的擬肽大環(huán)化合物包含α-螺旋。

具體而言，本發(fā)明涉及：

1.下式的擬肽大環(huán)化合物：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10；且

n為1-5的整數(shù)。

2.下式的擬肽大環(huán)化合物：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10；且

n為1-5的整數(shù)。

3.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的對mdm2或mdmx的結(jié)合親和力。

4.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有降低的mdmx結(jié)合親和力與mdm2結(jié)合親和力之比。

5.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的針對p53陽性腫瘤細胞系的體外抗腫瘤效力。

6.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物在p53陽性腫瘤細胞系中顯示出改善的體外凋亡誘導(dǎo)。

7.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的針對p53陽性腫瘤細胞系與針對p53陰性或突變腫瘤細胞系的體外抗腫瘤效力比。

8.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的針對p53陽性腫瘤的體內(nèi)抗腫瘤效力。

9.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物在p53陽性腫瘤中具有改善的體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)。

10.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的細胞透性。

11.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中w為0、1或2的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的溶解度。

12.如段1-11中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中xaa5為glu或其氨基酸類似物。

13.如段12所述的擬肽大環(huán)化合物，其中xaa5為glu或其氨基酸類似物，并且其中該擬肽大環(huán)化合物相對于其中xaa5為ala的對應(yīng)擬肽大環(huán)化合物具有改善的性質(zhì)，如改善的結(jié)合親和力、改善的溶解度、改善的細胞效力、改善的螺旋度、改善的細胞透性、改善的體內(nèi)或體外抗腫瘤效力，或改善的凋亡誘導(dǎo)。

14.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中各個e獨立地為選自ala(丙氨酸)、d-ala(d-丙氨酸)、aib(α-氨基異丁酸)、sar(n-甲基甘氨酸)和ser(絲氨酸)的氨基酸。

15.如段1或2所述的擬肽大環(huán)化合物，其中[d]v為–leu1-thr2。

16.如前述段中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中w為3-10。

17.如段16所述的擬肽大環(huán)化合物，其中w為3-6。

18.如段16所述的擬肽大環(huán)化合物，其中w為6-10。

19.如段16所述的擬肽大環(huán)化合物，其中w為6。

20.如前述段中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中v為1-10。

21.如段20所述的擬肽大環(huán)化合物，其中v為2-10。

22.如段20所述的擬肽大環(huán)化合物，其中v為2-5。

23.如段20所述的擬肽大環(huán)化合物，其中v為2。

24.一種擬肽大環(huán)化合物，其包含與選自表1、表1a、表1b或表1c中的氨基酸序列的氨基酸序列至少約60％相同的氨基酸序列，其中該擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

各個a、c、d和e獨立地為氨基酸；

b為氨基酸、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2和l3獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v和w獨立地為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

u為1-10的整數(shù)，例如1-5、1-3或1-2；

x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)，例如x+y+z之和為2、3或6；

n為1-5的整數(shù)；并且

其中該擬肽大環(huán)化合物不是表2a或2b的擬肽大環(huán)化合物。

25.如段24所述的擬肽大環(huán)化合物，其中各個e獨立地為選自ala(丙氨酸)、d-ala(d-丙氨酸)、aib(α-氨基異丁酸)、sar(n-甲基甘氨酸)和ser(絲氨酸)的氨基酸。

26.如段24所述的擬肽大環(huán)化合物，其中[d]v為–leu1-thr2。

27.一種擬肽大環(huán)化合物，其包含與選自表1、表1a、表1b或表1c中的氨基酸序列的氨基酸序列至少約60％相同的氨基酸序列，其中該擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

各個a、c、d和e獨立地為氨基酸；

b為氨基酸、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2和l3獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v和w獨立地為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

u為1-10的整數(shù)，例如1-5、1-3或1-2；

x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)，例如x+y+z之和為6；

n為1-5的整數(shù)；

其中w>2并且由e表示的前兩個氨基酸中的每一個包含不帶電荷的側(cè)鏈或帶負電荷的側(cè)鏈，

條件是該擬肽大環(huán)化合物不是表2a的擬肽大環(huán)化合物并且不具有以下序列：

ac-rtqatf$r8nqwaibanle$tnaibtr-nh2(seqidno:1),

ac-$r8sqqtfs$lwrllaibqn-nh2(seqidno:3)，

ac-qsq$r8tfsnlw$llaibqn-nh2(seqidno:4)，

ac-qs$r5qtfstnlw$llaibqn-nh2(seqidno:5)，或

ac-qsqq$r8fsnlwr$laibqn-nh2(seqidno:6)，

其中aib表示2-氨基異丁酸，$表示通過包含一個雙鍵的全碳交聯(lián)體連接的α-mes5-戊烯基-丙氨酸烯烴氨基酸，$r5表示通過包含一個雙鍵的全碳交聯(lián)體連接的α-mer5-戊烯基-丙氨酸烯烴氨基酸，且$r8表示通過包含一個雙鍵的全碳交聯(lián)體連接的α-mer88-辛烯基-丙氨酸烯烴氨基酸。

28.如段27所述的擬肽大環(huán)化合物，其中各個e獨立地為選自ala(丙氨酸)、d-ala(d-丙氨酸)、aib(α-氨基異丁酸)、sar(n-甲基甘氨酸)和ser(絲氨酸)的氨基酸。

29.如段27所述的擬肽大環(huán)化合物，其中[d]v為–leu1-thr2。

30.如段27所述的擬肽大環(huán)化合物，其中由e表示的第一c-末端氨基酸和/或第二c-末端氨基酸包含疏水性側(cè)鏈。

31.如段30所述的擬肽大環(huán)化合物，其中所述疏水性鏈為大的疏水性側(cè)鏈。

32.一種擬肽大環(huán)化合物，其包含與選自表1、表1a、表1b或表1c中的氨基酸序列的氨基酸序列至少約60％相同的氨基酸序列，其中該擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

各個a、c、d和e獨立地為氨基酸；

b為氨基酸、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2和l3獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v和w獨立地為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

u為1-10的整數(shù)，例如1-5、1-3或1-2；

x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)，例如x+y+z之和為6；

n為1-5的整數(shù)；并且

w>2，其中由e表示的第三氨基酸中的每一個包含大的疏水性側(cè)鏈，

條件是該擬肽大環(huán)化合物不是表2a的擬肽大環(huán)化合物并且不具有以下序列：

ac-q$r8qqtfsn$wrllaibqn-nh2(seqidno:7)。

33.如段32所述的擬肽大環(huán)化合物，其中除由e表示的第三氨基酸之外的各個e為選自ala(丙氨酸)、d-ala(d-丙氨酸)、aib(α-氨基異丁酸)、sar(n-甲基甘氨酸)和ser(絲氨酸)的氨基酸。

34.如段32所述的擬肽大環(huán)化合物，其中[d]v為–leu1-thr2。

35.如段32-34中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中由e表示的前兩個氨基酸中的每一個包含不帶電荷的側(cè)鏈或帶負電荷的側(cè)鏈。

36.如段32-34中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中由e表示的第三氨基酸為選自異亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)和酪氨酸(y)的氨基酸。

37.如段1至36中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中l(wèi)1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基或亞雜環(huán)芳基，它們各自任選地被r5取代。

38.如段1至36中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中l(wèi)1和l2獨立地為亞烷基或亞烯基。

39.如段1至36中任一段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中l(wèi)為亞烷基、亞烯基或亞炔基。

40.如段39所述的擬肽大環(huán)化合物，其中l(wèi)為亞烷基。

41.如段40所述的擬肽大環(huán)化合物，其中l(wèi)為c3-c16亞烷基。

42.如段41所述的擬肽大環(huán)化合物，其中l(wèi)為c10-c14亞烷基。

43.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中r1和r2獨立地為-h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素-取代。

44.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中r1和r2為h。

45.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中r1和r2獨立地為烷基。

46.如段45所述的擬肽大環(huán)化合物，其中r1和r2為甲基。

47.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中x+y+z＝6。

48.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中u為1。

49.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中該擬肽大環(huán)化合物不是表2a或表2b的擬肽大環(huán)化合物。

50.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其中各個e為ser或ala或其類似物。

51.如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物，其包含至少一種為氨基酸類似物的氨基酸。

52.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:163)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

53.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:124)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

54.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:123)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

55.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:108)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

56.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:397)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

57.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:340)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

58.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:454)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

59.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:360)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

60.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:80)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

61.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:78)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

62.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:16)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

63.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:169)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

64.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:324)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

65.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:258)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

66.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:446)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

67.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:358)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

68.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:464)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

69.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:466)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

70.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:467)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

71.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:376)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

72.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:471)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

73.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:473)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

74.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:475)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

75.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:476)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

76.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:481)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

77.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:482)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

78.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:487)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

79.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:572)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

80.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:572)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

81.下式的擬肽大環(huán)化合物：

(seqidno:1500)

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

82.一種治療受試者的癌癥的方法，其包括向該受試者施用如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物。

83.如段84所述的方法，其中所述癌癥選自頭頸癌、黑素瘤、肺癌、乳腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

84.一種調(diào)節(jié)受試者中的p53和/或mdm2和/或mdmx活性的方法，其包括向該受試者施用如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物。

85.一種拮抗受試者中的p53與mdm2之間和/或p53與mdmx蛋白之間的相互作用的方法，其包括向該受試者施用如任一前述段所述的擬肽大環(huán)化合物。

86.一種制備包含式(i)的擬肽大環(huán)化合物的組合物的方法：

該擬肽大環(huán)化合物包含與選自表1、表1a、表1b或表1c中的氨基酸序列的氨基酸序列約60％至約100％相同的氨基酸序列，該方法包括用催化劑處理式(ii)的化合物：

以產(chǎn)生式i的化合物

其中，在式(i)和(ii)的化合物中

各個a、c、d和e獨立地為氨基酸；

各個b獨立地為氨基酸、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

各個r1和r2獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個r3獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

各個l1、l2和l3獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4和r4’獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k獨立地為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r7獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

各個r8獨立地為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

各個v和w獨立地為1-1000的整數(shù)；

u為1-10的整數(shù)；

各個x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)；

各個n獨立地為1-5的整數(shù)；

各個o獨立地為1-15的整數(shù)；

各個p獨立地為1-15的整數(shù)；

“(e)”表示反式雙鍵；且

式(i)和(ii)化合物中存在的氨基酸a、c和/或當(dāng)b為氨基酸時的b中的一個或多個具有攜帶保護基團的側(cè)鏈。

87.如段86所述的方法，其中所述保護基團為氮原子保護基團。

88.如段86-87中任一段所述的方法，其中所述保護基團為boc基團。

89.如段87-88中任一段所述的方法，其中所述攜帶保護基團的氨基酸的側(cè)鏈包含受保護的吲哚。

90.如段89所述的方法，其中所述在其側(cè)鏈上攜帶所述保護基團的氨基酸為在其吲哚氮上被保護基團所保護的色氨酸(w)。

91.如段90所述的方法，其中所述在其側(cè)鏈上攜帶所述保護基團的氨基酸為在其吲哚氮上被boc基團所保護的色氨酸(w)。

92.如段86-91中任一段所述的方法，其中在式ii的化合物與催化劑接觸的步驟后，以等于或高于為z異構(gòu)體的對應(yīng)化合物的量獲得式(i)的化合物。

93.如段92所述的方法，其中在式ii的化合物與催化劑接觸的步驟后，以2、3、4、5、6、7、8、9或10倍于為z異構(gòu)體的對應(yīng)化合物的量獲得式(i)的化合物。

94.如段86-93中任一段所述的方法，其中所述催化劑為釕催化劑。

95.如段86-94中任一段所述的方法，進一步包括用還原劑或氧化劑處理式(i)的化合物的步驟。

96.如段86-95中任一段所述的方法，其中所述式(ii)的化合物附著到固體載體上。

97.如段86-95中任一段所述的方法，其中所述式(ii)的化合物不附著到固體載體上。

98.如段86-97中任一段所述的方法，進一步包括從所述式(i)的化合物上除去保護基團。

99.如段86-98中任一段所述的方法，其中在約20℃至約80℃的溫度下進行閉環(huán)復(fù)分解反應(yīng)。

100.如段86-100中任一段所述的方法，其中所述式(i)的擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa8、xaa9和xaa10中的至少兩個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體，其中l(wèi)在e構(gòu)型中包含至少一個雙鍵；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)；

w為3-1000的整數(shù)；

n為1-5的整數(shù)；且

xaa7為boc-保護的色氨酸。

101.如段86-99中任一段所述的方法，其中所述式(i)的擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa8、xaa9和xaa10中的至少兩個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體，其中l(wèi)在e構(gòu)型中包含至少一個雙鍵；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)；

w為3-1000的整數(shù)；

n為1-5的整數(shù)；且

xaa7為boc-保護的色氨酸。

102.如段86-101中任一段所述的方法，其中所述式(i)的擬肽大環(huán)化合物包含α-螺旋。

附圖說明

在所附的權(quán)利要求書中詳細地闡述了本發(fā)明的新特征。通過參考以下對利用本發(fā)明原理的說明性實施方案加以闡述的詳細說明和附圖，將會獲得對本發(fā)明的特征和優(yōu)點的更好的理解，在這些附圖中：

圖1示出了與mdmx(primaryswissprot數(shù)據(jù)庫登錄號q7zuw7，條目mdm4_danre)復(fù)合的擬肽大環(huán)化合物46(表2b)(一種p53擬肽大環(huán)化合物)的結(jié)構(gòu)。

圖2示出了與mdmx(primaryswissprot數(shù)據(jù)庫登錄號q7zuw7，條目mdm4_danre)結(jié)合的p53擬肽大環(huán)化合物142(表2b)和sp43的疊加結(jié)構(gòu)。

圖3示出了擬肽大環(huán)化合物sp154對小鼠mcf-7異種移植模型中腫瘤生長的影響。

圖4示出了擬肽大環(huán)化合物sp249對小鼠mcf-7異種移植模型中腫瘤生長的影響。

圖5示出了擬肽大環(huán)化合物sp315對小鼠mcf-7異種移植模型中腫瘤生長的影響。

圖6示出了sp154的點突變sp252對小鼠mcf-7異種移植模型中腫瘤生長的影響。

圖7示出了具有不同c-末端延伸的擬肽大環(huán)化合物的溶解度曲線圖。

發(fā)明詳述

如本文所用的，術(shù)語“大環(huán)化合物”是指這樣一種分子，該分子具有包括由至少9個共價鍵合的原子形成的環(huán)或環(huán)形的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

如本文所用的，術(shù)語“擬肽大環(huán)化合物”或“交聯(lián)的多肽”是指包含通過多個肽鍵連接的多個氨基酸殘基和至少一個大環(huán)形成連接體的化合物，所述大環(huán)形成連接體在第一天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基(或類似物)與同一分子內(nèi)的第二天然存在的或非天然存在的氨基酸殘基(或類似物)之間形成大環(huán)。擬肽大環(huán)化合物包括其中大環(huán)形成連接體將第一氨基酸殘基(或類似物)的α碳連接至第二氨基酸殘基(或類似物)的α碳的實施方案。擬肽大環(huán)化合物任選地包含處于一個或多個氨基酸殘基和/或氨基酸類似物殘基之間的一個或多個非肽鍵，且除了形成大環(huán)化合物的任意殘基外，任選地還包含一個或多個非天然存在的氨基酸殘基或氨基酸類似物殘基。當(dāng)在擬肽大環(huán)化合物的背景下提及時，“相應(yīng)的非交聯(lián)多肽”被理解為涉及與該大環(huán)化合物長度相同并且包含對應(yīng)于該大環(huán)化合物的野生型序列的等同天然氨基酸的多肽。

如本文所用的，術(shù)語“穩(wěn)定性”是指如通過圓二色性、nmr或另一種生物物理測量法測量的，擬肽大環(huán)化合物在溶液中維持確定的二級結(jié)構(gòu)，或在體外或體內(nèi)對蛋白水解降解作用的抗性。本文預(yù)期的二級結(jié)構(gòu)的非限制性例子是α-螺旋、310螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊。

如本文所用的，術(shù)語“螺旋穩(wěn)定性”是指如通過圓二色性或nmr測量的，擬肽大環(huán)化合物維持α-螺旋結(jié)構(gòu)。例如，在一些實施方案中，與相應(yīng)的非交聯(lián)的大環(huán)化合物相比，如通過圓二色性確定的，擬肽大環(huán)化合物在α-螺旋度上表現(xiàn)出至少1.25、1.5、1.75或2倍的增加。

術(shù)語“氨基酸”是指同時含有氨基和羧基的分子。合適的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的d-和l-異構(gòu)體，以及通過有機合成或其它代謝途徑制備的非天然存在的氨基酸。本文所用的術(shù)語氨基酸包括但不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸類似物。

術(shù)語“α-氨基酸”是指含有的氨基和羧基都結(jié)合到被指定為α-碳的碳上的分子。

術(shù)語“β-氨基酸”是指含有均為β構(gòu)型的氨基和羧基的分子。

術(shù)語“天然存在的氨基酸”是指在自然界合成的肽中通常發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸中的任一種，已知其單字母縮寫為a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v。

下表示出了天然氨基酸的性質(zhì)一覽：

“疏水性氨基酸”包括小疏水性氨基酸和大疏水性氨基酸?！靶∈杷园被帷睘楦拾彼?、丙氨酸、脯氨酸及其類似物?！按笫杷园被帷睘槔i氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其類似物?！皹O性氨基酸”為絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其類似物?！皫щ姲被帷睘橘嚢彼?、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及其類似物。

術(shù)語“氨基酸類似物”是指在結(jié)構(gòu)上類似于氨基酸并且在擬肽大環(huán)化合物的形成中可代替氨基酸的分子。氨基酸類似物包括但不限于β-氨基酸和其中氨基或羧基被相似反應(yīng)性的基團取代(例如，用仲胺或叔胺取代伯胺，或用酯取代羧基)的氨基酸。

術(shù)語“非天然氨基酸”是指并非在自然界合成的肽中通常發(fā)現(xiàn)的二十種氨基酸(已知其單字母縮寫為a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v)之一的氨基酸。非天然氨基酸或氨基酸類似物包括但不限于根據(jù)以下的結(jié)構(gòu)：

氨基酸類似物包括β-氨基酸類似物。β-氨基酸類似物的實例包括但不限以下：環(huán)狀β-氨基酸類似物；β-丙氨酸；(r)-β-苯丙氨酸；(r)-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-乙酸；(r)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-甲苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-三氟甲苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-甲苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-三氟甲苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-甲苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-三氟甲苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(r)-3-氨基-5-己烯酸；(r)-3-氨基-5-己炔酸；(r)-3-氨基-5-苯基戊酸；(r)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；(s)-1,2,3,4-四氫-異喹啉-3-乙酸；(s)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-甲苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-三氟甲苯基)-丁酸；

(s)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-甲苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-三氟甲苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-甲苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-三氟甲苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(s)-3-氨基-5-己烯酸；(s)-3-氨基-5-己炔酸；(s)-3-氨基-5-苯基戊酸；(s)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1,2,5,6-四氫吡啶-3-甲酸；1,2,5,6-四氫吡啶-4-甲酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧苯基)-丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；d-β-苯丙氨酸；β-亮氨酸；l-β-高丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-芐酯；l-β-高谷氨酸δ-芐酯；l-β-高異亮氨酸；l-β-高亮氨酸；l-β-高甲硫氨酸；l-β-高苯丙氨酸；l-β-高脯氨酸；l-β-高色氨酸；l-β-高纈氨酸；l-nω-芐氧羰基-β-高賴氨酸；nω-l-β-高精氨酸；o-芐基-l-β-高羥脯氨酸；o-芐基-l-β-高絲氨酸；o-芐基-l-β-高蘇氨酸；o-芐基-l-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-l-β-高天冬酰胺；(r)-β-苯丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；l-β-高谷氨酸δ-叔丁酯；l-nω-β-高賴氨酸；nδ-三苯甲基-l-β-高谷氨酰胺；nω-2,2,4,6,7-五甲基-二氫苯并呋喃-5-磺?；?l-β-高精氨酸；o-叔丁基-l-β-高羥基-脯氨酸；o-叔丁基-l-β-高絲氨酸；o-叔丁基-l-β-高蘇氨酸；o-叔丁基-l-β-高酪氨酸；2-氨基環(huán)戊烷羧酸；和2-氨基環(huán)己烷羧酸。

氨基酸類似物包括丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸或亮氨酸的類似物。丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸或亮氨酸的氨基酸類似物的實例包括但不限于以下：α-甲氧基甘氨酸；α-烯丙基-l-丙氨酸；α-氨基異丁酸；α-甲基-亮氨酸；β-(1-萘基)-d-丙氨酸；β-(1-萘基)-l-丙氨酸；β-(2-萘基)-d-丙氨酸；β-(2-萘基)-l-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-l-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-d-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-l-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-d-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-l-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-l-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-l-丙氨酸；β-氯-l-丙氨酸；β-氰基-l-丙氨酸；β-環(huán)己基-d-丙氨酸；β-環(huán)己基-l-丙氨酸；β-環(huán)戊烯-1-基-丙氨酸；β-環(huán)戊基-丙氨酸；β-環(huán)丙基-l-ala-oh·二環(huán)己基銨鹽；β-叔丁基-d-丙氨酸；β-叔丁基-l-丙氨酸；γ-氨基丁酸；l-α,β-二氨基丙酸；2,4-二硝基-苯基甘氨酸；2,5-二氫-d-苯基甘氨酸；2-氨基-4,4,4-三氟丁酸；2-氟-苯基甘氨酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氟-纈氨酸；4,4,4-三氟-纈氨酸；4,5-脫氫-l-leu-oh·二環(huán)己基銨鹽；4-氟-d-苯基甘氨酸；4-氟-l-苯基甘氨酸；4-羥基-d-苯基甘氨酸；5,5,5-三氟-亮氨酸；6-氨基己酸；環(huán)戊基-d-gly-oh·二環(huán)己基銨鹽；環(huán)戊基-gly-oh·二環(huán)己基銨鹽；d-α,β-二氨基丙酸；d-α-氨基丁酸；d-α-叔丁基甘氨酸；d-(2-噻吩基)甘氨酸；d-(3-噻吩基)甘氨酸；d-2-氨基己酸；d-2-茚滿基甘氨酸；d-烯丙基甘氨酸·二環(huán)己基銨鹽；d-環(huán)己基甘氨酸；d-正纈氨酸；d-苯基甘氨酸；β-氨基丁酸；β-氨基異丁酸；(2-溴苯基)甘氨酸；(2-甲氧基苯基)甘氨酸；(2-甲苯基)甘氨酸；(2-噻唑基)甘氨酸；(2-噻吩基)甘氨酸；2-氨基-3-(二甲氨基)-丙酸；l-α,β-二氨基丙酸；l-α-氨基丁酸；l-α-叔丁基甘氨酸；l-(3-噻吩基)甘氨酸；l-2-氨基-3-(二甲氨基)-丙酸；l-2-氨基己酸二環(huán)己基-銨鹽；l-2-茚滿基甘氨酸；l-烯丙基甘氨酸·二環(huán)己基銨鹽；l-環(huán)己基甘氨酸；l-苯基甘氨酸；l-炔丙基甘氨酸；l-正纈氨酸；n-α-氨基甲基-l-丙氨酸；d-α,γ-二氨基丁酸；l-α,γ-二氨基丁酸；β-環(huán)丙基-l-丙氨酸；(n-β-(2,4-二硝基苯基))-l-α,β-二氨基丙酸；(n-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亞環(huán)己-1-基)乙基)-d-α,β-二氨基丙酸；(n-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧環(huán)己-1-亞基)乙基)-l-α,β-二氨基丙酸；(n-β-4-甲基三苯甲基)-l-α,β-二氨基丙酸；(n-β-烯丙氧羰基)-l-α,β-二氨基丙酸；(n-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己-1-亞基)乙基)-d-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己-1-亞基)乙基)-l-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-4-甲基三苯甲基)-d-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-4-甲基三苯甲基)-l-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-烯丙氧羰基)-l-α,γ-二氨基丁酸；d-α,γ-二氨基丁酸；4,5-脫氫-l-亮氨酸；環(huán)戊基-d-gly-oh；環(huán)戊基-gly-oh；d-烯丙基甘氨酸；d-環(huán)己基高丙氨酸；l-1-芘基丙氨酸；l-2-氨基己酸；l-烯丙基甘氨酸；l-環(huán)己基高丙氨酸；和n-(2-羥基-4-甲氧基-bzl)-gly-oh。

氨基酸類似物包括精氨酸或賴氨酸的類似物。精氨酸和賴氨酸的氨基酸類似物的實例包括但不限于以下：瓜氨酸；l-2-氨基-3-胍基丙酸；l-2-氨基-3-脲基丙酸；l-瓜氨酸；lys(me)2-oh；lys(n3)-oh；nδ-芐氧羰基-l-鳥氨酸；nω-硝基-d-精氨酸；nω-硝基-l-精氨酸；α-甲基-鳥氨酸；2,6-二氨基庚二酸；l-鳥氨酸；(nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-環(huán)己-1-亞基)乙基)-d-鳥氨酸；(nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧-環(huán)己-1-亞基)乙基)-l-鳥氨酸；(nδ-4-甲基三苯甲基)-d-鳥氨酸；(nδ-4-甲基三苯甲基)-l-鳥氨酸；d-鳥氨酸；l-鳥氨酸；arg(me)(pbf)-oh；arg(me)2-oh(不對稱的)；arg(me)2-oh(對稱的)；lys(ivdde)-oh；lys(me)2-oh·hcl；lys(me)3-oh氯化物；nω-硝基-d-精氨酸；和nω-硝基-l-精氨酸。

氨基酸類似物包括天冬氨酸或谷氨酸的類似物。天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸類似物的實例包括但不限于以下：α-甲基-d-天冬氨酸；α-甲基-谷氨酸；α-甲基-l-天冬氨酸；γ-亞甲基-谷氨酸；(n-γ-乙基)-l-谷氨酰胺；[n-α-(4-氨基苯甲?；?]-l-谷氨酸；2,6-二氨基庚二酸；l-α-氨基辛二酸；d-2-氨基己二酸；d-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亞氨基二乙酸；l-2-氨基己二酸；蘇-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-d-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；γ-羧基-l-谷氨酸γ,γ-二-叔丁酯；glu(oall)-oh；l-asu(otbu)-oh；和焦谷氨酸。

氨基酸類似物包括半胱氨酸和甲硫氨酸的類似物。半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸類似物的實例包括但不限于cys(法呢基)-oh、cys(法呢基)-ome、α-甲基-甲硫氨酸、cys(2-羥乙基)-oh、cys(3-氨丙基)-oh、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、丁硫氨酸、丁硫氨酸亞砜胺、乙硫氨酸、甲硫氨酸甲基锍氯化物、硒代甲硫氨酸、磺丙氨酸、[2-(4-吡啶基)乙基]-dl-青霉胺、[2-(4-吡啶基)乙基]-l-半胱氨酸、4-甲氧芐基-d-青霉胺、4-甲氧芐基-l-青霉胺、4-甲基芐基-d-青霉胺、4-甲基芐基-l-青霉胺、芐基-d-半胱氨酸、芐基-l-半胱氨酸、芐基-dl-高半胱氨酸、氨甲?；?l-半胱氨酸、羧乙基-l-半胱氨酸、羧甲基-l-半胱氨酸、二苯基甲基-l-半胱氨酸、乙基-l-半胱氨酸、甲基-l-半胱氨酸、叔丁基-d-半胱氨酸、三苯甲基-l-高半胱氨酸、三苯甲基-d-青霉胺、胱硫醚、高胱氨酸、l-高胱氨酸、(2-氨基乙基)-l-半胱氨酸、硒代-l-胱氨酸、胱硫醚、cys(stbu)-oh和乙酰氨甲基-d-青霉胺。

氨基酸類似物包括苯丙氨酸和酪氨酸的類似物。苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸類似物的實例包括β-甲基-苯丙氨酸、β-羥基苯丙氨酸、α-甲基-3-甲氧基-dl-苯丙氨酸、α-甲基-d-苯丙氨酸、α-甲基-l-苯丙氨酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、2,4-二氯-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、2-溴-d-苯丙氨酸、2-溴-l-苯丙氨酸、2-氯-d-苯丙氨酸、2-氯-l-苯丙氨酸、2-氰基-d-苯丙氨酸、2-氰基-l-苯丙氨酸、2-氟-d-苯丙氨酸、2-氟-l-苯丙氨酸、2-甲基-d-苯丙氨酸、2-甲基-l-苯丙氨酸、2-硝基-d-苯丙氨酸、2-硝基-l-苯丙氨酸、2,4,5-三羥基-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-d-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-l-苯丙氨酸、3,4-二氯-d-苯丙氨酸、3,4-二氯-l-苯丙氨酸、3,4-二氟-d-苯丙氨酸、3,4-二氟-l-苯丙氨酸、3,4-二羥基-l-苯丙氨酸、3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸、3,5,3’-三碘-l-甲狀腺原氨酸、3,5-二碘-d-酪氨酸、3,5-二碘-l-酪氨酸、3,5-二碘-l-甲狀腺原氨酸、3-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、3-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、3-氨基-l-酪氨酸、3-溴-d-苯丙氨酸、3-溴-l-苯丙氨酸、3-氯-d-苯丙氨酸、3-氯-l-苯丙氨酸、3-氯-l-酪氨酸、3-氰基-d-苯丙氨酸、3-氰基-l-苯丙氨酸、3-氟-d-苯丙氨酸、3-氟-l-苯丙氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-d-苯丙氨酸、3-碘-l-苯丙氨酸、3-碘-l-酪氨酸、3-甲氧基-l-酪氨酸、3-甲基-d-苯丙氨酸、3-甲基-l-苯丙氨酸、3-硝基-d-苯丙氨酸、3-硝基-l-苯丙氨酸、3-硝基-l-酪氨酸、4-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、4-氨基-d-苯丙氨酸、4-氨基-l-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-d-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-l-苯丙氨酸、4-雙(2-氯乙基)氨基-l-苯丙氨酸、4-溴-d-苯丙氨酸、4-溴-l-苯丙氨酸、4-氯-d-苯丙氨酸、4-氯-l-苯丙氨酸、4-氰基-d-苯丙氨酸、4-氰基-l-苯丙氨酸、4-氟-d-苯丙氨酸、4-氟-l-苯丙氨酸、4-碘-d-苯丙氨酸、4-碘-l-苯丙氨酸、高苯丙氨酸、甲狀腺氨酸、3,3-二苯丙氨酸、甲狀腺原氨酸、乙基-酪氨酸和甲基-酪氨酸。

氨基酸類似物包括脯氨酸的類似物。脯氨酸的氨基酸類似物的實例包括但不限于3,4-脫氫-脯氨酸、4-氟-脯氨酸、順-4-羥基-脯氨酸、噻唑烷-2-甲酸和反-4-氟-脯氨酸。

氨基酸類似物包括絲氨酸和蘇氨酸的類似物。絲氨酸和蘇氨酸的氨基酸類似物的實例包括但不限于3-氨基-2-羥基-5-甲基己酸、2-氨基-3-羥基-4-甲基戊酸、2-氨基-3-乙氧丁酸、2-氨基-3-甲氧丁酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-氨基-3-芐氧丙酸、2-氨基-3-芐氧丙酸、2-氨基-3-乙氧丙酸、4-氨基-3-羥基丁酸和α-甲基絲氨酸。

氨基酸類似物包括色氨酸的類似物。色氨酸的氨基酸類似物的實例包括但不限于以下：α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-d-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-l-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-芐氧基-色氨酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羥基-色氨酸；5-羥基-l-色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-l-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴-色氨酸；6-氯-d-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸；7-芐氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；d-1,2,3,4-四氫-去甲哈爾滿-3-甲酸；6-甲氧基-1,2,3,4-四氫去甲哈爾滿-1-甲酸；7-氮雜色氨酸；l-1,2,3,4-四氫-去甲哈爾滿-3-甲酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；和6-氯-l-色氨酸。

在一些實施方案中，氨基酸類似物是外消旋的。在一些實施方案中，使用氨基酸類似物的d型異構(gòu)體。在一些實施方案中，使用氨基酸類似物的l型異構(gòu)體。在其它實施方案中，氨基酸類似物包含為r或s構(gòu)型的手性中心。在又一些其它實施方案中，β-氨基酸類似物的氨基基團被諸如叔丁氧羰基(boc基團)、9-芴甲氧羰基(fmoc)、甲苯磺?；缺Ｗo基團取代。在一些其它實施方案中，β-氨基酸類似物的羧酸官能團例如作為其酯衍生物被保護。在一些實施方案中，使用氨基酸類似物的鹽。

“非必需”氨基酸殘基是相對于多肽的野生型序列可能發(fā)生改變而不消除或基本不改變其基本生物學(xué)或生物化學(xué)活性(例如，受體結(jié)合或激活)的殘基?！氨匦琛卑被釟埢钱?dāng)相對于多肽的野生型序列發(fā)生改變時導(dǎo)致多肽的基本生物學(xué)或生物化學(xué)活性消除或基本消除的殘基。

“保守氨基酸置換”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所替代的氨基酸置換。本領(lǐng)域中已定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，k、r、h)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，d、e)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，g、n、q、s、t、y、c)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，a、v、l、i、p、f、m、w)、具有β分支的側(cè)鏈的氨基酸(例如，t、v、i)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，y、f、w、h)。因此，多肽中預(yù)測的非必需氨基酸殘基例如被來自同一側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基所替代?？山邮艿闹脫Q的其它例子是基于電子等排考慮(例如，正亮氨酸取代甲硫氨酸)或其它性質(zhì)(如2-噻吩丙氨酸取代苯丙氨酸，或6-cl-色氨酸取代色氨酸)的置換。

術(shù)語“封端基團”是指出現(xiàn)在本發(fā)明擬肽大環(huán)化合物的多肽鏈的羧基末端或氨基末端的化學(xué)部分。羧基末端的封端基團包括未修飾的羧酸(即-cooh)或具有取代基的羧酸。例如，羧基末端可被氨基取代，從而在c末端產(chǎn)生羧酰胺。各種取代基包括但不限于伯胺和仲胺，仲胺包括聚乙二醇化的仲胺。用于c末端的代表性的仲胺封端基團包括：

氨基末端的封端基團包括未修飾的胺(即-nh2)或具有取代基的胺。例如，氨基末端可被?；〈?，從而在n-末端生成羧酰胺。各種取代基包括但不限于取代的?；╟1-c6羰基、c7-c30羰基和聚乙二醇化的氨基甲酸酯。用于n-末端的代表性封端基團包括但不限于4-fbzl(4-氟-芐基)及以下：

在本文中與大環(huán)化合物或大環(huán)形成連接體一起使用的術(shù)語“元”是指形成或可以形成大環(huán)的原子，并且不包括取代基或側(cè)鏈原子。以此類推，環(huán)癸烷、1,2-二氟-癸烷和1,3-二甲基環(huán)癸烷都被認為是十元大環(huán)化合物，因為氫或氟取代基或甲基側(cè)鏈都沒有參與形成大環(huán)。

當(dāng)用作分子結(jié)構(gòu)的一部分時，符號是指單鍵或者反式或順式雙鍵。

術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈”是指連接到氨基酸中的α-碳(或另一個骨架原子)上的部分。例如，丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)羌谆奖彼岬陌被醾?cè)鏈?zhǔn)潜郊谆?，半胱氨酸的氨基酸?cè)鏈?zhǔn)橇蚣谆?，天冬氨酸的氨基酸?cè)鏈?zhǔn)囚燃谆野彼岬陌被醾?cè)鏈?zhǔn)?-羥基苯甲基，等等。也包括其它非天然存在的氨基酸側(cè)鏈，例如，自然產(chǎn)生的氨基酸側(cè)鏈(例如，氨基酸代謝物)或合成制備的氨基酸側(cè)鏈(例如，α,α-二取代的氨基酸)。

術(shù)語“α,α-二取代的氨基酸”是指包含的氨基和羧基都結(jié)合到碳(α-碳)上而該碳(α-碳)連接到兩個天然或非天然氨基酸側(cè)鏈上的分子或部分。

術(shù)語“多肽”包括通過共價鍵(例如，酰胺鍵)連接的兩個或更多個天然或非天然存在的氨基酸。本文所述的多肽包括全長蛋白質(zhì)(例如，完全加工的蛋白質(zhì))以及較短的氨基酸序列(例如，天然存在的蛋白質(zhì)的片段或合成的多肽片段)。

術(shù)語“第一c-末端氨基酸”是指最靠近c-末端的氨基酸。術(shù)語“第二c-末端氨基酸”是指連接在第一c-末端氨基酸的n末端處的氨基酸。

本文所用的術(shù)語“大環(huán)化試劑”或“大環(huán)形成試劑”是指任何可以用來通過介導(dǎo)兩個反應(yīng)性基團之間的反應(yīng)而制備擬肽大環(huán)化合物的試劑。該反應(yīng)性基團可以是，例如，疊氮和炔，在這種情況下，大環(huán)化試劑包括但不限于cu試劑，如提供反應(yīng)性cu(i)物質(zhì)的試劑，如cubr、cui或cuotf，以及通過加入諸如抗壞血酸或抗壞血酸鈉的還原劑可以原位轉(zhuǎn)化為活性cu(i)試劑的cu(ii)鹽，如cu(co2ch3)2、cuso4和cucl2。大環(huán)化試劑另外還可以包括，例如，本領(lǐng)域已知的ru試劑，如cp*rucl(pph3)2、[cp*rucl]4，或其它可以提供反應(yīng)性ru(ii)物質(zhì)的ru試劑。在其它情況下，反應(yīng)性基團為末端烯烴。在這樣的實施方案中，大環(huán)化試劑或大環(huán)形成試劑為復(fù)分解催化劑，包括但不限于穩(wěn)定的后過渡金屬卡賓絡(luò)合物催化劑，如viii族過渡金屬卡賓催化劑。例如，這樣的催化劑為具有+2氧化態(tài)、電子計數(shù)為16且五配位的ru和os金屬中心。在其它實例中，催化劑具有w或mo中心。各種催化劑在grubbs等人,"ringclosingmetathesisandrelatedprocessesinorganicsynthesis"acc.chem.res.1995,28,446-452，美國專利號5,811,515；美國專利號7,932,397；美國申請?zhí)?011/0065915；美國申請?zhí)?011/0245477；yu等人，"synthesisofmacrocyclicnaturalproductsbycatalyst-controlledstereoselectivering-closingmetathesis,"nature2011,479,88；和peryshkov等人，"z-selectiveolefinmetathesisreactionspromotedbytungstenoxoalkylidenecomplexes,"j.am.chem.soc.2011,133,20754中公開。在另外其它的情況下，反應(yīng)性基團為巰基。在這樣的實施方案中，大環(huán)化試劑為，例如，用兩個巰基反應(yīng)性基團如鹵素基團官能化的連接體。

術(shù)語“鹵代”或“鹵素”是指氟、氯、溴或碘或其基團。

術(shù)語“烷基”是指含有指定數(shù)目的碳原子的直鏈或支鏈烴鏈。例如，c1-c10表示該基團中具有1-10(含端值)個碳原子。在沒有指定任何數(shù)值時，“烷基”是其中具有1-20(含端值)個碳原子的鏈(直鏈或支鏈)。

術(shù)語“亞烷基”是指二價烷基(即，-r-)。

術(shù)語“烯基”是指具有一個或多個碳-碳雙鍵的直鏈或支鏈烴鏈。烯基部分含有指定數(shù)目的碳原子。例如，c2-c10表示該基團中具有2-10(含端值)個碳原子。術(shù)語“低級烯基”是指c2-c6烯基鏈。在沒有指定任何數(shù)值時，“烯基”是其中具有2-20(含端值)個碳原子的鏈(直鏈或支鏈)。

術(shù)語“炔基”是指具有一個或多個碳-碳叁鍵的直鏈或支鏈烴鏈。炔基部分含有指定數(shù)目的碳原子。例如，c2-c10表示該基團中具有2-10(含端值)個碳原子。術(shù)語“低級炔基”是指c2-c6炔基鏈。在沒有指定任何數(shù)值時，“炔基”是其中具有2-20(含端值)個碳原子的鏈(直鏈或支鏈)。

術(shù)語“芳基”是指6碳單環(huán)或10碳雙環(huán)的芳香環(huán)系，其中各環(huán)的0、1、2、3或4個原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等。術(shù)語“芳基烷氧基”是指被芳基取代的烷氧基。

“烷基芳基(arylalkyl)”是指其中芳基的氫原子中的一個被如上定義的c1-c5烷基取代的如上定義的芳基。烷基芳基的代表性例子包括但不限于：2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、2-乙基苯基、3-乙基苯基、4-乙基苯基、2-丙基苯基、3-丙基苯基、4-丙基苯基、2-丁基苯基、3-丁基苯基、4-丁基苯基、2-戊基苯基、3-戊基苯基、4-戊基苯基、2-異丙基苯基、3-異丙基苯基、4-異丙基苯基、2-異丁基苯基、3-異丁基苯基、4-異丁基苯基、2-仲丁基苯基、3-仲丁基苯基、4-仲丁基苯基、2-叔丁基苯基、3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。

“酰胺基芳基(arylamido)”是指其中芳基的氫原子中的一個被一個或多個-c(o)nh2基團取代的如上定義的芳基。酰胺基芳基的代表性例子包括：2-c(o)nh2-苯基、3-c(o)nh2-苯基、4-c(o)nh2-苯基、2-c(o)nh2-吡啶基、3-c(o)nh2-吡啶基和4-c(o)nh2-吡啶基。

“雜環(huán)基烷基(alkylheterocycle)”是指其中c1-c5烷基的氫原子中的一個被雜環(huán)取代的如上定義的c1-c5烷基。雜環(huán)基烷基的代表性例子包括但不限于：-ch2ch2-嗎啉、-ch2ch2-哌啶、-ch2ch2ch2-嗎啉和-ch2ch2ch2-咪唑。

“酰胺基烷基(alkylamido)”是指其中c1-c5烷基的氫原子中的一個被-c(o)nh2基團取代的如上定義的c1-c5烷基。酰胺基烷基的代表性例子包括但不限于：-ch2-c(o)nh2、-ch2ch2-c(o)nh2、-ch2ch2ch2c(o)nh2、-ch2ch2ch2ch2c(o)nh2、-ch2ch2ch2ch2ch2c(o)nh2、-ch2ch(c(o)nh2)ch3、-ch2ch(c(o)nh2)ch2ch3、-ch(c(o)nh2)ch2ch3、-c(ch3)2ch2c(o)nh2、-ch2-ch2-nh-c(o)-ch3、-ch2-ch2-nh-c(o)-ch3-ch3和-ch2-ch2–nh-c(o)-ch＝ch2。

“羥烷基(alkanol)”是指其中c1-c5烷基的氫原子中的一個被羥基取代的如上定義的c1-c5烷基。羥烷基的代表性例子包括但不限于：-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2ch2oh、-ch2ch(oh)ch3、-ch2ch(oh)ch2ch3、-ch(oh)ch3和-c(ch3)2ch2oh。

“羧基烷基(alkylcarboxy)”是指其中c1-c5烷基的氫原子中的一個被-cooh基團取代的如上定義的c1-c5烷基。羧基烷基的代表性例子包括但不限于：-ch2cooh、-ch2ch2cooh、-ch2ch2ch2cooh、-ch2ch2ch2ch2cooh、-ch2ch(cooh)ch3、-ch2ch2ch2ch2ch2cooh、-ch2ch(cooh)ch2ch3、-ch(cooh)ch2ch3和-c(ch3)2ch2cooh。

本文使用的術(shù)語“環(huán)烷基”包括具有3-12個碳、優(yōu)選3-8個碳、更優(yōu)選3-6個碳的飽和的和部分不飽和的環(huán)烴基團，其中環(huán)烷基另外任選地被取代。一些環(huán)烷基包括但不限于：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。

術(shù)語“雜芳基”是指芳香族的5-8元單環(huán)、8-12元雙環(huán)或11-14元三環(huán)的環(huán)系，其如果是單環(huán)則具有1-3個雜原子，如果是雙環(huán)則具有1-6個雜原子，或者如果是三環(huán)則具有1-9個雜原子，所述雜原子選自o、n或s(例如，如果是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)，分別為碳原子和1-3、1-6或1-9個o、n或s雜原子)，其中各個環(huán)的0、1、2、3或4個原子被取代基取代。雜芳基的例子包括吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、噻吩基(thiophenyl或thienyl)、喹啉基(quinolinyl)、吲哚基、噻唑基等。

術(shù)語“雜芳基烷基”或術(shù)語“雜芳烷基”是指被雜芳基取代的烷基。術(shù)語“雜芳基烷氧基”是指被雜芳基取代的烷氧基。

術(shù)語“雜芳基烷基”或術(shù)語“雜芳烷基”是指被雜芳基取代的烷基。術(shù)語“雜芳基烷氧基”是指被雜芳基取代的烷氧基。

術(shù)語“雜環(huán)基”是指非芳香族的5-8元單環(huán)、8-12元雙環(huán)或11-14元三環(huán)的環(huán)系，其如果是單環(huán)則具有1-3個雜原子，如果是雙環(huán)則具有1-6個雜原子，或者如果是三環(huán)則具有1-9個雜原子，所述雜原子選自o、n或s(例如，如果是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)，分別為碳原子和1-3、1-6或1-9個o、n或s雜原子)，其中各個環(huán)的0、1、2或3個原子被取代基取代。雜環(huán)基的例子包括哌嗪基、吡咯烷基、二氧雜環(huán)己基、嗎啉基、四氫呋喃基等。

術(shù)語“取代基”是指取代任何分子、化合物或部分上的第二原子或基團如氫原子的基團。合適的取代基包括但不限于鹵素、羥基、巰基、氧代、硝基、鹵代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、硫代烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、酰胺基、羧基、鏈烷磺?；?、烷基羰基和氰基。

在一些實施方案中，本文公開的化合物包含一個或多個不對稱中心，因而作為外消旋體或外消旋混合物、單一對映異構(gòu)體、單獨的非對映異構(gòu)體和非對映體混合物存在。除非另外明確地指出，包括這些化合物的所有這樣的異構(gòu)體形式。在一些實施方案中，本文公開的化合物也呈現(xiàn)為多種互變異構(gòu)形式，在這些情況下，所述化合物包括本文所述化合物的所有互變異構(gòu)形式(例如，如果環(huán)系的烷基化作用導(dǎo)致在多個位置發(fā)生烷基化，那么本發(fā)明包括所有這些反應(yīng)產(chǎn)物)。除非另外明確地指出，包括這些化合物的所有這些異構(gòu)體形式。除非另外明確地指出，包括本文所述化合物的所有晶形。

如本文所用的，術(shù)語“增加”和“減少”分別意味著導(dǎo)致至少5％的統(tǒng)計學(xué)顯著的(即，p<0.1)增加或減少。

如本文所用的，提及變量的數(shù)值范圍旨在表示變量等于該范圍內(nèi)的任意值。因此，對于本身不連續(xù)的變量，該變量等于該數(shù)值范圍內(nèi)的任意整數(shù)值，包括該范圍的端點。類似地，對于本身連續(xù)的變量，該變量等于該數(shù)值范圍內(nèi)的任意實值，包括該范圍的端點。作為例子，而不是限制，如果變量本身是不連續(xù)的，描述為具有0-2之間的值的變量取0、1或2的值；而如果變量本身是連續(xù)的，則取0.0、0.1、0.01、0.001的值或≥0且≤2的其它任何實值。

如本文所用的，除非另外特別指出，單詞“或”以“和/或”的包含性含義使用，而非“任一/或”的排它性的含義。

術(shù)語“平均”表示對于每個數(shù)據(jù)點通過進行至少3次獨立的重復(fù)而獲得的平均值。

術(shù)語“生物活性”包括大環(huán)化合物的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。生物活性是，例如，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、α-螺旋性、對靶標(biāo)的親和性、對蛋白水解降解的抗性、細胞透性、細胞內(nèi)穩(wěn)定性、體內(nèi)穩(wěn)定性或其任意組合。

術(shù)語“結(jié)合親和力”是指結(jié)合相互作用的強度，例如擬肽大環(huán)化合物與靶標(biāo)之間的結(jié)合相互作用的強度。結(jié)合親和力可以表示為，例如，平衡解離常數(shù)(“kd”)，其表示單位為濃度的量度(例如m、mm、μm、nm等)。在數(shù)字上，結(jié)合親和力和kd值相反地變化，從而使得較低的結(jié)合親和力對應(yīng)于較高的kd值，而較高的結(jié)合親和力對應(yīng)于較低的kd值。在需要高結(jié)合親和力的情況下，“改善的”結(jié)合親和力是指較高的結(jié)合親和力，因此指較低的kd值。

術(shù)語“體外效力”是指測試化合物如擬肽大環(huán)化合物在體外測試系統(tǒng)或試驗中產(chǎn)生有益結(jié)果的程度。例如，體外效力可以測量為“ic50”或“ec50”值，其表示測試化合物在測試系統(tǒng)中產(chǎn)生50％的最大效應(yīng)的濃度。

術(shù)語“體外效力之比”或“體外效力比”是指來自第一試驗(分子)與來自第二試驗(分母)的ic50或ec50值的比值。因此，針對試驗1相比于試驗2的改善的體外效力比是指較低的表示為ic50(試驗1)/ic50(試驗2)或ec50(試驗1)/ec50(試驗2)的比值。此概念也可表征為在試驗1中相比于在試驗2中的“改善的選擇性”，這可能是由于針對靶標(biāo)1的ic50或ec50值的降低，也可能是由于針對靶標(biāo)2的ic50或ec50值的升高。

在下面的附圖和描述中闡述了本發(fā)明的一個或多個具體實施方案的細節(jié)。從說明書、附圖和權(quán)利要求書可以明顯看出本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢。

擬肽大環(huán)化合物

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物具有式(i)：

其中：

各個a、c、d和e獨立地為氨基酸(包括天然或非天然氨基酸，和氨基酸類似物)，并且末端d和e獨立地任選地包括封端基團；

b為氨基酸(包括天然或非天然氨基酸，和氨基酸類似物)、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

l為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v和w獨立地為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

u為1-10的整數(shù)，例如1-5、1-3或1-2；

x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)，例如x+y+z之和為2、3或6；且

n為1-5的整數(shù)。

在一些實施方案中，v和w為1-30的整數(shù)。在一些實施方案中，w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10。在一些實施方案中，x+y+z之和為3或6。在一些實施方案中，x+y+z之和為3。在其它實施方案中，x+y+z之和為6。

在一些實施方案中，還提供了下式的擬肽大環(huán)化合物：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中各個x為氨基酸；

各個d和e獨立地為氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10；且

n為1-5的整數(shù)。

在一些實施方案中，v和w為1-30的整數(shù)。在一些實施方案中，w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10。在一些實施方案中，x+y+z之和為3或6。在一些實施方案中，x+y+z之和為3。在其它實施方案中，x+y+z之和為6。

在本文所述任何通式的一些實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少四個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少五個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少六個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少七個是與序列phe3-x4-his5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10-x11-ser12(seqidno:8)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物具有下式：

其中：

xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的每一個單獨地為氨基酸，其中xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸，其中每個x為氨基酸；

各個d獨立地為氨基酸；

各個e獨立地為氨基酸，例如選自ala(丙氨酸)、d-ala(d-丙氨酸)、aib(α-氨基異丁酸)、sar(n-甲基甘氨酸)和ser(絲氨酸)的氨基酸；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

各個l或l’獨立地為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與d殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

r8為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代，或是與e殘基形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分；

v為1-1000的整數(shù)，例如1-500、1-200、1-100、1-50、1-30、1-20或1-10；

w為3-1000的整數(shù)，例如3-500、3-200、3-100、3-50、3-30、3-20或3-10；且

n為1-5的整數(shù)。

在上述通式的一些實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少三個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在上述通式的其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少四個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在上述通式的其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少五個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在上述通式的其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少六個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。在上述通式的其它實施方案中，xaa3、xaa5、xaa6、xaa7、xaa8、xaa9和xaa10中的至少七個是與序列phe3-x4-glu5-tyr6-trp7-ala8-gln9-leu10/cba10-x11-ala12(seqidno:9)的相應(yīng)位置處的氨基酸相同的氨基酸。

在一些實施方案中，w為3-10的整數(shù)，例如3-6、3-8、6-8或6-10。在一些實施方案中，w為3。在其它實施方案中，w為6。在一些實施方案中，v為1-10的整數(shù)，例如2-5。在一些實施方案中，v為2。

在本文所述的任何通式的實施方案中，l1和l2單獨地或組合地不形成三唑或硫醚。

在一個實例中，r1和r2中的至少一個是未取代的或被鹵素–取代的烷基。在另一個實例中，r1和r2二者均獨立地為未取代的或被鹵素–取代的烷基。在一些實施方案中，r1和r2中的至少一個為甲基。在其它實施方案中，r1和r2為甲基。

在一些實施方案中，x+y+z至少為3。在其它實施方案中，x+y+z為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施方案中，x+y+z之和為3或6。在一些實施方案中，x+y+z之和為3。在其它實施方案中，x+y+z之和為6。大環(huán)化合物或大環(huán)化合物前體中每次出現(xiàn)的a、b、c、d或e獨立地選擇。例如，由式[a]x表示的序列，當(dāng)x為3時，包括其中氨基酸不相同的實施方案，例如gln–asp–ala，以及其中氨基酸相同的實施方案，例如gln–gln–gln。這適用于x、y或z在指定范圍內(nèi)的任意值。類似地，當(dāng)u大于1時，各個化合物可包含相同或不同的擬肽大環(huán)化合物。例如，化合物可以包含含有不同連接體長度或化學(xué)組成的擬肽大環(huán)化合物。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物包含為α-螺旋的二級結(jié)構(gòu)且r8為–h，從而允許螺旋內(nèi)氫鍵鍵合。在一些實施方案中，a、b、c、d或e中的至少一個為α,α-二取代的氨基酸。在一個實例中，b為α,α-二取代的氨基酸。例如，a、b、c、d或e中的至少一個為2-氨基異丁酸。

在其它實施方案中，a、b、c、d或e中的至少一個為

在其它實施方案中，選擇從第一cα到第二cα測量的大環(huán)形成連接體l的長度，以穩(wěn)定希望的二級肽結(jié)構(gòu)，例如由擬肽大環(huán)化合物的殘基(包括但不是必須限于第一cα到第二cα之間的殘基)形成的α-螺旋。

在一個實施方案中，式(i)的擬肽大環(huán)化合物為：

其中各個r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的。

在其它實施方案中，式(i)的擬肽大環(huán)化合物為：

其中各個r1’和r2’獨立地為氨基酸。

在其它實施方案中，式(i)的擬肽大環(huán)化合物是以下所示通式中的任一個的化合物：

其中“aa”表示任何天然或非天然氨基酸側(cè)鏈，且為如上定義的[d]v、[e]w，且n為0至20、50、100、200、300、400或500的整數(shù)。在一些實施方案中，n為0。在其它實施方案中，n小于50。

大環(huán)形成連接體l的示例性實施方案如下所示。

在其它實施方案中，為了促進細胞攝取，進一步修飾式i化合物中的d和/或e。在一些實施方案中，將擬肽大環(huán)化合物脂質(zhì)化(lipidating)或peg化有利于細胞攝取、提高生物利用度、增強血液循環(huán)、改變藥代動力學(xué)、降低免疫原性和/或降低所需的給藥頻率。。

在其它實施方案中，式i化合物中的[d]和[e]中的至少一個代表包含另外的大環(huán)形成連接體的部分，使得該擬肽大環(huán)化合物包含至少兩個大環(huán)形成連接體。在特定實施方案中，擬肽大環(huán)化合物包含兩個大環(huán)形成連接體。在一個實施方案中，u為2。

在一些實施方案中，本文所述的任何大環(huán)形成連接體可以與表1、表1a、表1b或表1c中所示的任何序列任意組合使用，也可以與本文所述的任何r–取代基任意組合使用。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物包含至少一個α-螺旋基序。例如，式i化合物中的a、b和/或c包含一個或多個α-螺旋。一般來說，α-螺旋每圈包含3至4個氨基酸殘基。在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物的α-螺旋包括1至5圈，因此包含3至20個氨基酸殘基。在特定實施方案中，α-螺旋包括1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在一些實施方案中，大環(huán)形成連接體穩(wěn)定化在擬肽大環(huán)化合物內(nèi)包含的α-螺旋基序。因此，在一些實施方案中，選擇大環(huán)形成連接體l從第一cα到第二cα的長度，以提高α-螺旋的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，大環(huán)形成連接體跨越α-螺旋的1圈至5圈。在一些實施方案中，大環(huán)形成連接體跨越α-螺旋的大約1圈、2圈、3圈、4圈或5圈。在一些實施方案中，大環(huán)形成連接體的長度為每圈α-螺旋大約至或每圈α-螺旋大約至當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約1圈α-螺旋時，長度等于大約5個碳-碳鍵至13個碳-碳鍵，大約7個碳-碳鍵至11個碳-碳鍵，或大約9個碳-碳鍵。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約2圈α-螺旋時，長度等于大約8個碳-碳鍵至16個碳-碳鍵，大約10個碳-碳鍵至14個碳-碳鍵，或大約12個碳-碳鍵。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約3圈α-螺旋時，長度等于大約14個碳-碳鍵至22個碳-碳鍵，大約16個碳-碳鍵至20個碳-碳鍵，或大約18個碳-碳鍵。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約4圈α-螺旋時，長度等于大約20個碳-碳鍵至28個碳-碳鍵，大約22個碳-碳鍵至26個碳-碳鍵，或大約24個碳-碳鍵。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約5圈α-螺旋時，長度等于大約26個碳-碳鍵至34個碳-碳鍵，大約28個碳-碳鍵至32個碳-碳鍵，或大約30個碳-碳鍵。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約1圈α-螺旋時，連接含有大約4個原子至12個原子，大約6個原子至10個原子，或大約8個原子。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約2圈α-螺旋時，連接含有大約7個原子至15個原子，大約9個原子至13個原子，或大約11個原子。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約3圈α-螺旋時，連接含有大約13個原子至21個原子，大約15個原子至19個原子，或大約17個原子。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約4圈α-螺旋時，連接含有大約19個原子至27個原子，大約21個原子至25個原子，或大約23個原子。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約5圈α-螺旋時，連接含有大約25個原子至33個原子，大約27個原子至31個原子，或大約29個原子。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約1圈α-螺旋時，得到的大環(huán)形成含有大約17元至25元、大約19元至23元或大約21元的環(huán)。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約2圈α-螺旋時，得到的大環(huán)形成含有大約29元至37元、大約31元至35元或大約33元的環(huán)。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約3圈α-螺旋時，得到的大環(huán)形成含有大約44元至52元、大約46元至50元或大約48元的環(huán)。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約4圈α-螺旋時，得到的大環(huán)形成含有大約59元至67元、大約61元至65元或大約63元的環(huán)。當(dāng)大環(huán)形成連接體跨越大約5圈α-螺旋時，得到的大環(huán)形成含有大約74元至82元、大約76元至80元或大約78元的環(huán)。

在其它實施方案中，提供了式(iv)或(iva)的擬肽大環(huán)化合物：

其中：

各個a、c、d和e獨立地為天然或非天然氨基酸，并且末端d和e獨立地任選地包括封端基團；

b為天然或非天然氨基酸、氨基酸類似物、[-nh-l3-co-]、[-nh-l3-so2-]或[-nh-l3-]；

r1和r2獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基，它們是未取代的或被鹵素–取代的；或者r1和r2中的至少一個形成連接至所述d或e氨基酸之一的α位置的大環(huán)形成連接體l’；

r3為氫、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

l為式–l1–l2–的大環(huán)形成連接體；

l1和l2獨立地為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞環(huán)芳基、亞雜環(huán)芳基或[-r4-k-r4-]n，它們各自任選地被r5取代；

各個r4為亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞雜烷基、亞環(huán)烷基、亞雜環(huán)烷基、亞芳基或亞雜芳基；

各個k為o、s、so、so2、co、co2或conr3；

各個r5獨立地為鹵素、烷基、-or6、-n(r6)2、-sr6、-sor6、-so2r6、-co2r6、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

各個r6獨立地為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、熒光部分、放射性同位素或治療劑；

r7為–h、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環(huán)烷基、雜烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)芳基或雜環(huán)芳基，它們?nèi)芜x地被r5取代；

v和w獨立地為1-1000的整數(shù)；

u為1-10的整數(shù)；

x、y和z獨立地為0-10的整數(shù)；且

n為1-5的整數(shù)。

在一個實例中，l1和l2單獨地或組合地不形成三唑或硫醚。

在一個實例中，r1和r2中的至少一個是未取代的或被鹵素–取代的烷基。在另一個實例中，r1和r2均獨立地為未取代的或被鹵素–取代的烷基。在一些實施方案中，r1和r2中的至少一個為甲基。在其它實施方案中，r1和r2為甲基。

在一些實施方案中，x+y+z之和至少為1。在其它實施方案中，x+y+z之和至少為2。在其它實施方案中，x+y+z之和為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。大環(huán)化合物或大環(huán)化合物前體中每次出現(xiàn)的a、b、c、d或e獨立地選擇。例如，由式[a]x表示的序列，當(dāng)x為3時，包括其中氨基酸不相同的實施方案，例如gln–asp–ala，以及其中氨基酸相同的實施方案，例如gln–gln–gln。這適用于x、y或z在指定范圍內(nèi)的任意值。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物包含為α-螺旋的二級結(jié)構(gòu)且r8為–h，從而允許螺旋內(nèi)氫鍵鍵合。在一些實施方案中，a、b、c、d或e中的至少一個為α,α-二取代的氨基酸。在一個實例中，b為α,α-二取代的氨基酸。例如，a、b、c、d或e中的至少一個為2-氨基異丁酸。在其它實施方案中，a、b、c、d或e中的至少一個為

在其它實施方案中，選擇從第一cα到第二cα測量的大環(huán)形成連接體l的長度，以穩(wěn)定希望的二級肽結(jié)構(gòu)，例如由擬肽大環(huán)化合物的殘基(包括但不是必須限于第一cα到第二cα之間的殘基)形成的α-螺旋。

大環(huán)形成連接體-l1-l2-的示例性實施方案如下所示。

除非另外說明，任何化合物(包括擬肽大環(huán)化合物、大環(huán)化合物前體和其它組合物)也意在包括僅在是否存在一個或多個同位素富集的原子方面不同的化合物。例如，除了用氘或氚替代氫或者用¹³c-或¹⁴c-富集的碳替代碳以外具有所述結(jié)構(gòu)的化合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在一些實施方案中，本文公開的化合物可以在構(gòu)成此類化合物的一個或多個原子處含有非自然比例的原子同位素。例如，該化合物可以用諸如例如氚(³h)、碘-125(¹²⁵i)或碳-14(¹⁴c)的放射性同位素進行放射性標(biāo)記。在其它實施方案中，一個或多個碳原子被硅原子替代。本文涉及本文公開的化合物的所有同位素變化，無論是放射性的還是非放射性的。

擬肽大環(huán)化合物的制備

擬肽大環(huán)化合物可以通過本領(lǐng)域已知的眾多方法中的任意方法來制備。例如，具有在表1、表1a、表1b或表1c中由“$”或“$r8”表示的任何殘基可以被替換為能夠與同一分子中的第二殘基形成交聯(lián)體的殘基或這樣的殘基的前體。

各種實現(xiàn)擬肽大環(huán)化合物的形成的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，schafmeister等人,j.am.chem.soc.122:5891-5892(2000)；schafmeister和verdine,j.am.chem.soc.122:5891(2005)；walensky等人,science305:1466-1470(2004)；美國專利號7,192,713和pct申請wo2008/121767中描述了式i的擬肽大環(huán)化合物的制備。在所引用的參考文獻中公開的α,α-二取代的氨基酸和氨基酸前體可以用于擬肽大環(huán)化合物前體多肽的合成。例如，“s5-烯烴氨基酸”是(s)-α-(2’-戊烯基)丙氨酸，且“r8-烯烴氨基酸”是(r)-α-(2’-辛烯基)丙氨酸。在將這樣的氨基酸摻入前體多肽中之后，末端烯烴與復(fù)分解反應(yīng)催化劑反應(yīng)，從而導(dǎo)致擬肽大環(huán)化合物的形成。在各種實施方案中，下列氨基酸可用于合成擬肽大環(huán)化合物。

在其它實施方案中，擬肽大環(huán)化合物為式iv或iva。制備這樣的大環(huán)化合物的方法例如在美國專利號7,202,332中描述。

預(yù)計為合適的形成擬肽大環(huán)化合物的另外的方法包括以下文獻中公開的方法：mustapa,m.firouzmohd等人,j.org.chem(2003),68,第8193-8198頁；yang,bin等人bioorgmed.chem.lett.(2004),14,第1403-1406頁；美國專利5,364,851；美國專利5,446,128；美國專利5,824,483；美國專利6,713,280和美國專利7,202,332。在這樣的實施方案中，使用在α-位含有另外的取代基r-的氨基酸前體。這樣的氨基酸在希望的位置并入大環(huán)化合物前體中，其可以處于交聯(lián)體被取代的位置，或者，備選地，在大環(huán)化合物前體序列中的其它位置。然后根據(jù)指定的方法實現(xiàn)前體的環(huán)化。

試驗

例如，擬肽大環(huán)化合物的性質(zhì)通過使用下面所述的方法進行分析。在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合相對于缺乏本文所述的取代基的相應(yīng)多肽具有改善的生物學(xué)性質(zhì)。

用于測定α-螺旋度的試驗

在溶液中，具有α-螺旋結(jié)構(gòu)域的多肽的二級結(jié)構(gòu)在隨機卷曲結(jié)構(gòu)和α-螺旋結(jié)構(gòu)之間達到動態(tài)平衡，這通常被稱為“百分螺旋度”。因此，例如，α-螺旋結(jié)構(gòu)域在溶液中主要是隨機卷曲，α-螺旋含量通常低于25％。另一方面，具有優(yōu)化的連接體的擬肽大環(huán)化合物具有例如至少為相應(yīng)的非交聯(lián)多肽的2倍的α-螺旋度。在一些實施方案中，大環(huán)化合物具有高于50％的α-螺旋度。為了測定擬肽大環(huán)化合物的螺旋度，將化合物溶解于水溶液(例如，ph7的50mm磷酸鉀溶液或蒸餾水，達到25-50μm的濃度)。使用標(biāo)準(zhǔn)測量參數(shù)(例如，溫度，20℃；波長，190-260nm；步分辨率(stepresolution)，0.5nm；速度，20nm/sec；累積，10；響應(yīng)，1秒；帶寬，1nm；路徑長度，0.1cm)在分光偏振計(例如，jascoj-710)上獲得圓二色性(cd)譜。通過將平均殘基橢圓度(例如，[φ]222obs)除以模型螺旋十肽的報道值(yang等人(1986),methodsenzymol.130:208)來計算各個肽的α-螺旋含量。

用于測量解鏈溫度(tm)的試驗

含有二級結(jié)構(gòu)如α-螺旋的擬肽大環(huán)化合物顯示出例如比相應(yīng)的非交聯(lián)多肽更高的解鏈溫度。通常，擬肽大環(huán)化合物顯示出>60℃的tm，表明在水溶液中高度穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。為了分析大環(huán)形成對解鏈溫度的影響，將擬肽大環(huán)化合物或未修飾的肽溶于蒸餾水中(例如，以50μm的終濃度)，并且通過使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)(例如，波長，222nm；步分辨率，0.5nm；速度，20nm/sec；累積，10；響應(yīng)，1秒；帶寬，1nm；溫度上升速度，1℃/分鐘；路徑長度，0.1cm)在分光偏振計(例如，jascoj-710)上測量橢圓度在一定溫度范圍(例如，4-95℃)內(nèi)的變化來確定tm。

蛋白酶抗性試驗

肽骨架的酰胺鍵易受到蛋白酶的水解，從而致使肽化合物在體內(nèi)易于快速降解。但是，肽螺旋的形成通常包埋酰胺骨架，因此可以保護其免于蛋白水解裂解。擬肽大環(huán)化合物可以經(jīng)歷體外胰蛋白酶的蛋白水解，以評價與相應(yīng)的非交聯(lián)多肽相比其降解速率的任何變化。例如，擬肽大環(huán)化合物和相應(yīng)的非交聯(lián)多肽與胰蛋白酶瓊脂糖一起溫育，并在各個時間點通過離心猝滅反應(yīng)，隨后進行hplc注入以根據(jù)280nm處的紫外吸收對殘留的底物進行定量。簡單來說，擬肽大環(huán)化合物和擬肽前體(5mcg)與胰蛋白酶瓊脂糖(pierce)(s/e～125)溫育0、10、20、90和180分鐘。通過臺式離心機高速離心猝滅反應(yīng)；通過基于hplc的在280nm處的峰檢測對分離的上清液中殘余的底物進行定量。蛋白水解反應(yīng)顯示出一級動力學(xué)，且速率常數(shù)k由ln[s]相對于時間的曲線確定(k＝-1x斜率)。

離體穩(wěn)定性試驗

具有優(yōu)化的連接體的擬肽大環(huán)化合物具有例如至少為相應(yīng)的非交聯(lián)多肽的2倍的離體半衰期，且具有12小時或更長的離體半衰期。對于離體血清穩(wěn)定性研究，可以使用多種試驗。例如，將擬肽大環(huán)化合物和相應(yīng)的非交聯(lián)多肽(2mcg)與新鮮的小鼠、大鼠和/或人血清(2ml)一起在37℃下溫育0、1、2、4、8和24小時。為了測定完整化合物的水平，可以使用下面的程序：通過將100μl的血清轉(zhuǎn)移到2ml離心管中，接著加入10μl的50％甲酸和500μl乙腈并在4±2℃下以14,000rpm離心10分鐘來提取樣品。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的2ml管中，并在n2<10psi、37℃下在turbovap上蒸發(fā)。樣品在100μl的50:50乙腈:水中重建，并進行l(wèi)c-ms/ms分析。

體外結(jié)合試驗

為了評價擬肽大環(huán)化合物和擬肽前體與受體蛋白質(zhì)的結(jié)合和親和力，例如使用熒光偏振試驗(fpa)。fpa技術(shù)使用偏振光和熒光示蹤劑測量分子取向和分子遷移率。當(dāng)用偏振光激發(fā)時，由于附著在具有高表觀分子量的分子(例如，與大蛋白質(zhì)結(jié)合的fitc標(biāo)記的肽)上的熒光示蹤劑(例如，fitc)與附著在較小分子(例如，在溶液中游離的fitc標(biāo)記的肽)上的熒光示蹤劑相比具有較慢的旋轉(zhuǎn)速度，附著在具有高表觀分子量的分子上的熒光示蹤劑發(fā)射較高水平的偏振熒光。

例如，熒光標(biāo)記的(fluoresceinated)擬肽大環(huán)化合物(25nm)與接受體蛋白質(zhì)(25-1000nm)在結(jié)合緩沖液(140mmnacl、50mmtris-hcl，ph7.4)中在室溫下溫育30分鐘。例如，用發(fā)光分光光度計(例如，perkin-elmerls50b)通過熒光偏振測定結(jié)合活性?？梢允褂美鏶raphpadprism軟件(graphpadsoftware,inc.,sandiego,ca)通過非線性回歸分析來確定kd值。在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物顯示出與相應(yīng)的非交聯(lián)多肽類似的或更低的kd。

用于表征肽-蛋白質(zhì)相互作用的拮抗劑的體外置換試驗

為了評價拮抗肽與接受體蛋白質(zhì)之間相互作用的化合物的結(jié)合和親和力，例如，使用利用來源于擬肽前體序列的熒光標(biāo)記的擬肽大環(huán)化合物的熒光偏振試驗(fpa)。fpa技術(shù)使用偏振光和熒光示蹤劑測量分子取向和分子遷移率。當(dāng)用偏振光激發(fā)時，由于附著在具有高表觀分子量的分子(例如，與大蛋白質(zhì)結(jié)合的fitc標(biāo)記的肽)上的熒光示蹤劑(例如，fitc)與附著在較小分子(例如，在溶液中游離的fitc標(biāo)記的肽)上的熒光示蹤劑相比具有較低的旋轉(zhuǎn)速度，附著在具有高表觀分子量的分子上的熒光示蹤劑發(fā)射較高水平的偏振熒光。拮抗熒光標(biāo)記的擬肽大環(huán)化合物與接受體蛋白質(zhì)之間相互作用的化合物將在競爭性結(jié)合fpa實驗中進行檢測。

例如，推定的拮抗劑化合物(1nm至1mm)和熒光標(biāo)記的擬肽大環(huán)化合物(25nm)與接受體蛋白質(zhì)(50nm)一起在結(jié)合緩沖液(140mmnacl、50mmtris-hcl，ph7.4)中在室溫下溫育30分鐘。例如，用發(fā)光分光光度計(例如，perkin-elmerls50b)通過熒光偏振測定拮抗劑結(jié)合活性?？梢允褂美鏶raphpadprism軟件(graphpadsoftware,inc.,sandiego,ca)通過非線性回歸分析來確定kd值。

任一類分子，如有機小分子、肽、寡核苷酸或蛋白質(zhì)，可以在該試驗中作為推定的拮抗劑進行檢測。

通過親和選擇-質(zhì)譜法對蛋白質(zhì)-配體結(jié)合的分析

為了評估測試化合物對蛋白質(zhì)的結(jié)合和親和力，例如采用親和選擇-質(zhì)譜分析試驗。按照以下對全系統(tǒng)對照實驗概述的代表性程序，使用1μm擬肽大環(huán)化合物加5μmhmdm2進行蛋白質(zhì)-配體結(jié)合實驗。將40μm擬肽大環(huán)化合物儲備溶液的1μldmso等份溶解在19μlpbs(磷酸鹽緩沖鹽水：含有150mmnacl的50mm,ph7.5磷酸鹽緩沖液)中。得到的溶液通過反復(fù)吸液進行混合并通過在10000g下離心10分鐘進行澄清。向4μl等份得到的上清液中加入4μl10μmhmdm2的pbs溶液。每個8.0μl實驗樣品因此含有在pbs中的濃度為5.0μm的40pmol(1.5μg)蛋白質(zhì)，加1μm擬肽大環(huán)化合物和2.5％dmso。針對每個濃度點如此制備的雙份樣品在室溫下溫育60分鐘，然后冷卻至4℃，之后進行5.0μl注入液的大小排阻層析-lc-ms分析。將含有靶蛋白、蛋白質(zhì)-配體復(fù)合體和未結(jié)合的化合物的樣品注入到sec柱上，通過快速sec步驟將復(fù)合體與未結(jié)合的成分在該柱上分離。采用uv檢測器監(jiān)測sec柱洗脫液，以證實在sec柱的外水體積中洗脫的早期洗脫的蛋白質(zhì)級分從保留在柱上的未結(jié)合的成分中良好地分離出來。在含有蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配體復(fù)合體的峰從主uv檢測器洗脫后，它進入樣品環(huán)路，在其中從sec階段的流上截下，并通過閥門機構(gòu)直接轉(zhuǎn)移到lc-ms。通過esi-ms以預(yù)期的m/z觀察擬肽大環(huán)化合物的(m+3h)³⁺離子，證實檢測到蛋白質(zhì)-配體復(fù)合體。

用于蛋白質(zhì)-配體kd滴定實驗的分析

為了評估測試化合物對蛋白質(zhì)的結(jié)合和親和力，例如，進行蛋白質(zhì)-配體kd滴定實驗。蛋白質(zhì)-配體kd滴定實驗如下進行：制備連續(xù)稀釋的滴定劑擬肽大環(huán)化合物儲備溶液(5,2.5,...,0.098mm)的2μldmso等份，然后溶解在38μlpbs中。得到的溶液通過反復(fù)吸液進行混合并通過在10000g下離心10分鐘進行澄清。向4.0μl等份得到的上清液中加入4.0μl10μmhmdm2的pbs溶液。每個8.0μl實驗樣品因此含有在pbs中的濃度為5.0μm的40pmol(1.5μg)蛋白質(zhì)，不同濃度(125,62.5,...,0.24μm)的滴定肽和2.5％dmso。針對每個濃度點如此制備的雙份樣品在室溫下溫育30分鐘，然后冷卻至4℃，之后進行2.0μl注入液的sec-lc-ms分析。通過esi-ms觀察(m+h)¹⁺、(m+2h)²⁺、(m+3h)³⁺和/或(m+na)¹⁺離子；對提取的離子色譜圖進行定量，然后與方程擬合，以推導(dǎo)出結(jié)合親和力kd，如以下文獻所述：“ageneraltechniquetorankprotein-ligandbindingaffinitiesanddetermineallostericvs.directbindingsitecompetitionincompoundmixtures.”annis,d.a.；nazef,n.；chuang,c.c.；scott,m.p.；nash,h.m.j.am.chem.soc.2004,126,15495-15503，以及“alis:anaffinityselection-massspectrometrysystemforthediscoveryandcharacterizationofprotein-ligandinteractions”d.a.annis,c.-c.chuang,andn.nazef.inmassspectrometryinmedicinalchemistry.wannerk,g:wiley-vch編著；2007:121-184.mannholdr,kubinyih,folkersg(系列編者):methodsandprinciplesinmedicinalchemistry。

通過親和選擇-質(zhì)譜法進行競爭性結(jié)合實驗的分析

為了確定測試化合物競爭性結(jié)合蛋白質(zhì)的能力，例如，進行親和選擇-質(zhì)譜分析試驗。通過將三種化合物中每一種的2μl等份400μm儲備液與14μldmso混合制備每種成分40μm的配體混合物。然后，將1μl等份的該每種成分40μm的混合物與滴定劑擬肽大環(huán)化合物連續(xù)稀釋儲備溶液(10,5,2.5,...,0.078mm)的1μldmso等份混合。將這些2μl樣品溶解在38μlpbs中。得到的溶液通過反復(fù)吸液進行混合并通過在10000g下離心10分鐘進行澄清。向4.0μl等份得到的上清液中加入4.0μl10μmhmdm2蛋白的pbs溶液。每個8.0μl實驗樣品因此含有在pbs中的濃度為5.0μm的40pmol(1.5μg)蛋白質(zhì)，加0.5μm配體、2.5％dmso和不同濃度(125,62.5,...,0.98μm)的滴定劑擬肽大環(huán)化合物。針對每個濃度點如此制備的雙份樣品在室溫下溫育60分鐘，然后冷卻至4℃，之后進行2.0μl注入液的sec-lc-ms分析。這些和其它方法的另外的細節(jié)在以下文獻中提供：“ageneraltechniquetorankprotein-ligandbindingaffinitiesanddetermineallostericvs.directbindingsitecompetitionincompoundmixtures.”annis,d.a.；nazef,n.；chuang,c.c.；scott,m.p.；nash,h.m.j.am.chem.soc.2004,126,15495-15503；以及“alis:anaffinityselection-massspectrometrysystemforthediscoveryandcharacterizationofprotein-ligandinteractions”d.a.annis,c.-c.chuang,andn.nazef.inmassspectrometryinmedicinalchemistry.wannerk,g:wiley-vch編著；2007:121-184.mannholdr,kubinyih,folkersg(系列編者):methodsandprinciplesinmedicinalchemistry。

在完整細胞中的結(jié)合分析

有可能通過免疫沉淀實驗測定肽或擬肽大環(huán)化合物與其天然受體在完整細胞中的結(jié)合。例如，完整的細胞與熒光標(biāo)記的(fitc-標(biāo)記的)化合物在無血清的情況下溫育4小時，接著進行血清置換并進一步溫育4-18小時。然后使細胞沉淀，并在4℃下在裂解緩沖液(50mmtris[ph7.6]、150mmnacl、1％的chaps和蛋白酶抑制劑混合物)中溫育10分鐘。以14,000rpm離心提取物15分鐘，收集上清液，并與10μl山羊抗-fitc抗體一起溫育2小時，在4℃下旋轉(zhuǎn)，接著進一步在4℃下與蛋白a/gsepharose(50μl的50％微珠漿)溫育2小時。快速離心之后，將沉淀物在含有漸增的鹽濃度(例如，150、300、500mm)的裂解緩沖液中洗滌。隨后以150mmnacl再平衡微珠，之后加入含有sds的樣品緩沖液并煮沸。離心之后，任選地使用4％-12％梯度的bis-tris凝膠對上清液進行電泳，接著轉(zhuǎn)移到immobilon-p膜上。封閉后，任選地將印跡與檢測fitc的抗體一起溫育，也與一種或多種檢測與擬肽大環(huán)化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)的抗體一起溫育。

細胞透性分析

與相應(yīng)的非交聯(lián)大環(huán)化合物相比，擬肽大環(huán)化合物例如具有更高的細胞透性。具有優(yōu)化的連接體的擬肽大環(huán)化合物具有例如是相應(yīng)的非交聯(lián)大環(huán)化合物的至少2倍的細胞透性，并且常常觀察到20％或更多的應(yīng)用的擬肽大環(huán)化合物在4小時后已滲透入細胞。為了測量擬肽大環(huán)化合物和相應(yīng)的非交聯(lián)大環(huán)化合物的細胞透性，將完整的細胞與熒光標(biāo)記的(例如熒光化的(fluoresceinated))擬肽大環(huán)化合物或相應(yīng)的非交聯(lián)大環(huán)化合物(10μm)一起在不含血清的培養(yǎng)基中37℃溫育4小時，用培養(yǎng)基洗滌2次，并與胰蛋白酶(0.25％)在37℃下溫育10分鐘。再次洗滌細胞并將其重懸浮于pbs中。例如，通過使用facscalibur流式細胞儀或cellomics’hcs讀數(shù)儀分析細胞熒光。.

細胞效力分析

例如，在基于細胞的殺傷試驗中，使用多種致瘤和非致瘤的細胞系及源自人類或小鼠細胞群體的原代細胞測定某些擬肽大環(huán)化合物的效力。例如，在與擬肽大環(huán)化合物(0.5-50μm)一起溫育的24-96小時期間監(jiān)測細胞的活力，以鑒定那些以ec50<10μm殺死細胞的化合物。檢測細胞活力的幾種標(biāo)準(zhǔn)分析是可以通過商業(yè)途徑得到的，并且任選地用來評價擬肽大環(huán)化合物的效力。另外，測定膜聯(lián)蛋白v和胱天蛋白酶激活的分析任選地用來評價擬肽大環(huán)化合物是否通過激活凋亡機制殺死細胞。例如，采用celltiter-glo試驗，該試驗確定隨細胞內(nèi)atp濃度變化的細胞活力。

體內(nèi)穩(wěn)定性分析

為了研究擬肽大環(huán)化合物的體內(nèi)穩(wěn)定性，例如，向小鼠和/或大鼠通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服或吸入途徑以0.1-50mg/kg的濃度施用化合物，并在注射后0'、5'、15'、30'、1小時、4小時、8小時和24小時抽取血樣。然后如上所述通過lc-ms/ms測定25μl新鮮血清中的完整化合物的水平。

在動物模型中的體內(nèi)效力

為了確定擬肽大環(huán)化合物在體內(nèi)的抗致癌活性，例如，化合物單獨給予(靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服、通過吸入或鼻途徑)或與亞最佳劑量的相關(guān)化療劑(例如，環(huán)磷酰胺、阿霉素、依托泊苷)聯(lián)合給予。在一個實例中，在nod-scid小鼠遭受全身輻射3小時后，通過尾靜脈注射穩(wěn)定表達螢光素酶的5x10⁶rs4；11細胞(從急性淋巴細胞白血病患者的骨髓建立)。如果不予處理，在該模型中這種形式的白血病在3周內(nèi)是致命的。例如，通過對小鼠注射d-螢光素(60mg/kg)并對麻醉的動物進行成像(例如，xenogeninvivoimagingsystem,caliperlifesciences,hopkinton,ma)可容易地監(jiān)測該白血病。通過livingimagesoftware(caliperlifesciences,hopkinton,ma)進行光子通量(photonicflux)(光子/秒)的積分(integration)來對全身生物發(fā)光進行定量。例如，擬肽大環(huán)化合物單獨地或與亞最佳劑量的相關(guān)化學(xué)治療劑聯(lián)合地通過尾靜脈或靜脈內(nèi)途徑以0.1mg/kg-50mg/kg的劑量向白血病小鼠施用(注射后10天/實驗第1天，生物發(fā)光范圍為14-16)7-21天。任選地，在整個實驗過程中每隔一天對小鼠成像，并在實驗期間每天監(jiān)測其存活。在實驗結(jié)束時任選地對死亡的小鼠進行尸體檢查。另一種動物模型是將穩(wěn)定表達螢光素酶的dohh2(源自人類濾泡性淋巴瘤的細胞系)植入到nod-scid小鼠中。這些體內(nèi)試驗任選地產(chǎn)生初步的藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

臨床試驗

為了確定擬肽大環(huán)化合物對于人類治療的適用性，進行了臨床試驗。例如，可選擇出被診斷為患有癌癥并且需要治療的患者并將他們分成治療組和一個或多個對照組，其中，對治療組施用擬肽大環(huán)化合物，而對照組接受安慰劑或已知的抗癌藥物。這樣，可以通過對患者組就諸如生存率和生活質(zhì)量的因素進行比較來評價擬肽大環(huán)化合物的治療安全性和有效性。在本實施例中，相比于用安慰劑治療的患者對照組，用擬肽大環(huán)化合物治療的患者組可以顯示出提高的長期生存率。

藥物組合物和給藥途徑

本文公開的藥物組合物包含擬肽大環(huán)化合物及其藥學(xué)上可接受的衍生物或前藥?！八帉W(xué)上可接受的衍生物”意指本文公開的化合物的任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酯的鹽、前藥或其它衍生物，其在向接受者施用后能夠(直接或間接地)提供本文公開的化合物。尤其有利的藥學(xué)上可接受的衍生物是當(dāng)向哺乳動物施用時可以提高該化合物的生物利用度(例如，通過提高口服施用的化合物進入血液的吸收)，或相對于母體物質(zhì)增加活性化合物向生物區(qū)室(例如，腦或淋巴系統(tǒng))的遞送的那些衍生物。一些藥學(xué)上可接受的衍生物包含提高水溶性或跨過胃腸粘膜的主動轉(zhuǎn)運的化學(xué)基團。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物通過共價或非共價地連接的合適的官能團進行修飾，以提高選擇性的生物學(xué)性質(zhì)。這樣的修飾包括那些提高進入給定生物區(qū)室(例如，血液、淋巴系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng))的生物學(xué)滲透性、提高口服利用度、增加溶解度以允許注射施用、改變代謝以及改變排泄率的修飾。

本文公開的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括那些由藥學(xué)上可接受的無機和有機的酸和堿衍生的鹽。合適的酸式鹽的例子包括乙酸鹽、己二酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、乙醇酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、棕櫚酸鹽(palmoate)、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽(undecanoate)。由合適的堿衍生的鹽包括堿金屬鹽(例如，鈉鹽)、堿土金屬鹽(例如，鎂鹽)、銨鹽和n-(烷基)4⁺鹽。

為了由本文公開的化合物制備藥物組合物，藥學(xué)上可接受的載體包括固體或液體載體。固體形式的制劑包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊劑、扁囊劑、栓劑和分散顆粒劑。固體載體可以是一種或多種物質(zhì)，其也可以作為稀釋劑、調(diào)味劑、粘合劑、防腐劑、片劑崩解劑或包封材料發(fā)揮作用。在科學(xué)文獻和專利文獻中詳細描述了配制和給藥技術(shù)的細節(jié)，參見，例如，最新版本的remington'spharmaceuticalsciences,maackpublishingco,eastonpa。

在粉劑中，載體是細碎的固體，其與細碎的活性成分混合。在片劑中，活性成分與具有必要粘合性質(zhì)的載體按照適當(dāng)?shù)谋壤旌希褐瞥尚枰男螤詈痛笮　?/p>

合適的固體賦形劑是碳水化合物或蛋白質(zhì)填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素，如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；和樹膠，包括阿拉伯樹膠和黃蓍膠；以及蛋白質(zhì)，如明膠和膠原蛋白。如果需要的話，加入崩解劑或增溶劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。

液體形式的制劑包括溶液、懸浮液和乳液，例如，水或水/丙二醇溶液。對于腸胃外注射，液體制劑可以在聚乙二醇水溶液中配制成溶液。

藥物制劑可以為單位劑型。在這樣的形式中，制劑細分為含有適量活性成分的單位劑量。單位劑型可以是包裝制劑，該包裝包含不連續(xù)量的制劑，如包裝的片劑、膠囊和小瓶或安瓿中的粉末。另外，單位劑型也可以是膠囊、片劑、扁囊劑或錠劑本身，或者可以是包裝形式的適當(dāng)數(shù)目的這些劑型中的任一種。

當(dāng)一種或多種本文公開的組合物包含擬肽大環(huán)化合物和一種或多種另外的治療劑或預(yù)防劑的組合時，該化合物和另外的藥劑都應(yīng)該以通常在單一治療方案中施用的劑量的大約1-100％的劑量水平，更優(yōu)選大約5-95％的劑量水平存在。在一些實施方案中，另外的藥劑作為多劑量方案的一部分與一種或多種本文公開的化合物分開施用?；蛘?，這些藥劑是單一劑型的一部分，在單一組合物中與本文公開的化合物混合在一起。

使用方法

在一個方面，本文提供了新型擬肽大環(huán)化合物，其可在競爭性結(jié)合試驗中用于鑒別可與擬肽大環(huán)化合物所模擬的蛋白質(zhì)或肽的天然配體相結(jié)合的物質(zhì)。例如，在p53/mdmx系統(tǒng)中，基于p53的標(biāo)記的擬肽大環(huán)化合物可以與競爭性結(jié)合mdmx的小分子一起在mdmx結(jié)合試驗中使用。競爭結(jié)合研究允許在體外快速評價及確定對于p53/mdmx系統(tǒng)具有特異性的候選藥物。可以使用本文公開的任何擬肽大環(huán)化合物及其結(jié)合配偶體進行這類結(jié)合研究。

進一步提供了生成抗擬肽大環(huán)化合物的抗體的方法。在一些實施方案中，這些抗體特異性地結(jié)合擬肽大環(huán)化合物和擬肽大環(huán)化合物相關(guān)的前體肽，如p53。例如，這樣的抗體破壞天然的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，例如p53與mdmx之間的結(jié)合。

在其它方面，本文提供了處理處于患與分子(包括p53、mdm2或mdmx)的異常(例如，不足或過量)表達或活性有關(guān)的疾病的危險中(或易患所述疾病)或患有所述疾病的受試者的預(yù)防方法和治療方法。

在另一實施方案中，疾病至少部分地是由p53或mdm2或mdmx的異常水平(例如，過度表達或不足表達)引起的，或由顯示異?；钚缘膒53或mdm2或mdmx的存在引起的。這樣，由源自p53的擬肽大環(huán)化合物導(dǎo)致的p53或mdm2或mdmx水平和/或活性的降低或者p53或mdm2或mdmx水平和/或活性的提高用來例如緩解或減輕疾病的負面癥狀。

另一方面，本文提供了通過干擾結(jié)合配偶體之間(例如，p53與mdm2或p53與mdmx之間)的相互作用或結(jié)合來治療或預(yù)防疾病(包括過度增殖性疾病和炎性病癥)的方法。這些方法包括向包括人類的溫血動物施用有效量的化合物。在一些實施方案中，一種或多種本文公開的化合物的施用誘導(dǎo)細胞生長停滯或凋亡。

如本文所用的，術(shù)語“治療”被定義為向患者應(yīng)用或施用治療劑，或者向從患者分離的組織或細胞系應(yīng)用或施用治療劑，所述患者患有疾病、疾病癥狀或具有患病傾向，其目的是治愈、恢復(fù)、減輕、解除、改變、矯正、緩解、改善或影響疾病、疾病癥狀或患病傾向。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物可以用來治療、預(yù)防和/或診斷癌癥和腫瘤性病狀。如本文所用的，術(shù)語“癌癥”、“過度增殖的”和“腫瘤性的”指具有自主生長能力的細胞，即，以快速增殖的細胞生長為特征的異常狀態(tài)或病狀。過度增殖性的和腫瘤性的疾病狀態(tài)可以分類為病理性的，即，表現(xiàn)或構(gòu)成疾病狀態(tài)；或者可以分類為非病理性的，即，偏離正常但與疾病狀態(tài)無關(guān)。該術(shù)語意味著包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉(zhuǎn)移性的組織或惡性轉(zhuǎn)化的細胞、組織或器官，而與組織病理類型或侵入階段無關(guān)。轉(zhuǎn)移性腫瘤可以由許多原發(fā)性腫瘤類型產(chǎn)生，包括但不限于：乳腺、肺、肝、結(jié)腸和卵巢源的腫瘤類型?！安±硇赃^度增殖”細胞出現(xiàn)于以惡性腫瘤生長為特征的疾病狀態(tài)中。非病理性過度增殖細胞的例子包括與創(chuàng)傷修復(fù)有關(guān)的細胞增殖。細胞增殖和/或分化疾病的例子包括癌癥，例如，癌瘤、肉瘤或轉(zhuǎn)移性疾病。在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物是用于控制乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌、這些癌癥的轉(zhuǎn)移等的新的治療劑。

癌癥或腫瘤性疾病的例子包括但不限于：纖維肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、胃癌、食道癌、直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、頭頸癌、皮膚癌、腦癌、鱗狀細胞癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯腫瘤、子宮頸癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。

在一些實施方案中，所述癌癥是頭頸癌、黑素瘤、肺癌、乳腺癌或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

增殖性疾病的例子包括造血系統(tǒng)腫瘤性疾病。如本文所用，術(shù)語“造血系統(tǒng)腫瘤性疾病”包括涉及造血系統(tǒng)起源的(例如，源自骨髓、淋巴或紅細胞譜系的)增生性/腫瘤性細胞或其前體細胞的疾病。該疾病可起因于分化不良的急性白血病，例如，成紅細胞白血病和急性巨核母細胞性白血病。另外的示例性的骨髓疾病包括但不限于：急性早幼粒細胞白血病(apml)、急性髓性白血病(aml)和慢性髓性白血病(cml)(綜述見vaickus(1991),critrev.oncol./hemotol.11:267-97)；淋巴樣惡性腫瘤包括但不限于急性淋巴母細胞性白血病(all)，包括b-譜系all和t-譜系all、慢性淋巴細胞性白血病(cll)、幼淋巴細胞性白血病(pll)、多毛細胞白血病(hll)和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(wm)。其它形式的惡性淋巴瘤包括但不限于：非何杰金淋巴瘤及其變化形式、外周t細胞淋巴瘤、成人t細胞白血病/淋巴瘤(atl)、皮膚t細胞淋巴瘤(ctcl)、巨粒淋巴細胞白血病(lgf)、何杰金病和里德-斯特恩伯格病。

乳腺的細胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：增生性乳腺疾病，包括，例如，上皮細胞增生、硬化性腺病和小導(dǎo)管乳頭狀瘤；腫瘤，例如，諸如纖維腺瘤、葉狀瘤和肉瘤的間質(zhì)腫瘤，和諸如大導(dǎo)管乳頭狀瘤的上皮腫瘤；乳腺癌，包括原位(非侵襲性)癌(包括原位導(dǎo)管癌(包括佩吉特病)和原位小葉癌)和侵襲性(浸潤性)癌(包括但不限于，浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌、髓樣癌、膠體(粘液)癌、小管癌和侵襲性乳頭狀癌)；和混雜性的惡性腫瘤。男性乳房疾病包括但不限于男性乳腺發(fā)育癥和癌。

皮膚的細胞增殖性和/或分化性病癥的實例包括但不限于增殖性皮膚病，如黑素瘤，包括粘膜黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、雀斑(例如，惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣黑素瘤或肢端著色斑性黑素瘤)、無黑色素黑色素瘤、結(jié)締組織增生性黑素瘤、具有斯皮茨痣特征的黑素瘤、具有小痣樣細胞的黑素瘤、息肉狀黑素瘤和軟組織黑素瘤；基底細胞癌，包括小結(jié)基底細胞癌、表面基底細胞癌、結(jié)節(jié)性基底細胞癌(侵蝕性潰瘍)、囊性基底細胞癌、疤痕性基底細胞癌、色素性基底細胞癌、異位基底細胞癌、浸潤性基底細胞癌、痣樣基底細胞癌綜合征、息肉狀基底細胞癌、孔樣基底細胞癌和平庫斯纖維上皮瘤；鱗狀細胞癌，包括棘皮瘤(巨細胞棘皮瘤)、腺樣鱗狀細胞癌、基底細胞樣鱗狀細胞癌、透明細胞鱗狀細胞癌、印戒細胞鱗狀細胞癌、梭形細胞鱗狀細胞癌、馬喬林潰瘍、凱拉增生性紅斑和bowen??；或其它皮膚或皮下腫瘤。

肺的細胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：支氣管原癌，包括類腫瘤綜合征、細支氣管肺泡癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，例如，支氣管類癌瘤、混雜性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤；胸膜的病狀，包括炎性胸腔積液、非炎性胸腔積液、氣胸和胸膜腫瘤，包括孤立性纖維瘤(胸膜纖維瘤)和惡性間皮瘤。

結(jié)腸的細胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：非腫瘤性息肉、腺瘤、家族性綜合征、結(jié)直腸癌形成、結(jié)直腸癌和類癌瘤。

肝的細胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：結(jié)節(jié)性增生、腺瘤和惡性腫瘤，包括原發(fā)肝癌和轉(zhuǎn)移性腫瘤。

卵巢的細胞增殖和/或分化疾病的例子包括但不限于：卵巢腫瘤，例如，體腔上皮腫瘤、漿液性腫瘤、粘液瘤、子宮內(nèi)膜樣瘤、透明細胞腺癌、囊腺纖維瘤、布倫納瘤、表面上皮腫瘤；生殖細胞瘤，例如，成熟(良性)畸胎瘤、單胚層畸胎瘤、不成熟的惡性畸胎瘤、無性細胞瘤、內(nèi)胚層竇瘤、絨毛膜癌；性索-間質(zhì)腫瘤(sexcord-stomaltumors)，例如，粒層-卵泡膜細胞瘤、泡膜細胞瘤纖維瘤(thecomafibromas)、男性母細胞瘤、希爾細胞瘤(hillcelltumors)和性腺母細胞瘤；和諸如克魯肯貝格瘤的轉(zhuǎn)移性腫瘤。

雖然本文已顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，這些實施方案只是以舉例的方式提供的。在不背離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會想到許多變化、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，在實施本發(fā)明時，可以采用本文所述的本發(fā)明的實施方案的各種替代方案。旨在用下列權(quán)利要求限定范圍，并且這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等效物也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。

實施例

實施例1：6-氯色氨酸fmoc氨基酸的合成

6-氯-3-甲?；?1h-吲哚-1-甲酸叔丁酯，1。在氬氣下于0℃向攪拌中的干dmf(12ml)的溶液中逐滴加入pocl3(3.92ml，43mmol，1.3當(dāng)量)。在同一溫度下攪拌該溶液20分鐘，然后逐滴加入6-氯吲哚(5.0g，33mmol，1當(dāng)量)的干dmf(30ml)溶液。使所得到的混合物升溫至室溫，并再攪拌2.5h。加水(50ml)，并用4mnaoh水溶液(ph～8)中和該溶液。濾出所得到的固體，用水洗滌，并在真空下干燥。這種材料無需額外的純化而直接用于下一步驟。在n2下于室溫向攪拌中的粗甲酰吲哚(33mmol，1當(dāng)量)的thf(150ml)溶液中相繼添加boc2o(7.91g，36.3mmol，1.1當(dāng)量)和dmap(0.4g，3.3mmol，0.1當(dāng)量)。在室溫下攪拌所得到的混合物1.5h，減壓蒸發(fā)溶劑。將殘留物用etoac吸收，并用1nhc1洗滌，干燥并濃縮，從而得到白色固體甲酰吲哚1(經(jīng)2步，9g，98％)。¹hnmr(cdcl3)δ:1.70(s,boc,9h)；7.35(dd,1h)；8.21(m,3h)；10.07(s,1h)。

6-氯-3-(羥甲基)-1h-吲哚-1-甲酸叔丁酯，2。向化合物1(8.86g，32mmol，1當(dāng)量)的乙醇(150ml)溶液中加入nabh4(2.4g，63mmol，2當(dāng)量)。在室溫下攪拌反應(yīng)液3h。濃縮反應(yīng)混合物，并將殘留物倒入乙醚和水中。分離有機層，用硫酸鎂干燥并濃縮，從而得到白色固體(8.7g，98％)。這種材料無需額外的純化而直接用于下一步驟。¹hnmr(cdcl3)δ:1.65(s,boc,9h)；4.80(s,2h,ch2)；7.21(dd,1h)；7.53(m,2h)；8.16(bs,1h)。

3-(溴甲基)-6-氯-1h-吲哚-1-甲酸叔丁酯，3。于-40℃向氬氣下的化合物2(4.1g，14.6mmol，1當(dāng)量)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入三苯基膦(4.59g，17.5mmol，1.2當(dāng)量)的二氯甲烷(50ml)溶液。在40℃下再攪拌反應(yīng)溶液30分鐘。然后加入nbs(3.38g，19mmol，1.3當(dāng)量)。使所得到的混合物升溫至室溫并攪拌過夜。蒸發(fā)二氯甲烷，加入四氯化碳(100ml)，攪拌混合物1h并過濾。將濾液濃縮，將其裝入二氧化硅柱塞，并用25％etoac的己烷溶液快速洗脫。濃縮溶液，得到白色泡沫(3.84g，77％)。¹hnmr(cdcl3)δ:1.66(s,boc,9h)；4.63(s,2h,ch2)；7.28(dd,1h)；7.57(d,1h)；7.64(bs,1h)；8.18(bs,1h)。

αme-6cl-trp(boc)-ni-s-bpb，4。在氬氣下向s-ala-ni-s-bpb(2.66g，5.2mmol，1當(dāng)量)和ko-tbu(0.87g，7.8mmol，1.5當(dāng)量)中加入50mldmf。通過注射器加入溴化物衍生化合物3(2.68g，7.8mmol，1.5當(dāng)量)在dmf(5.0ml)中的溶液。在環(huán)境溫度下攪拌反應(yīng)混合物1h。然后用5％的醋酸水溶液猝滅溶液，并用水稀釋。在二氯甲烷中萃取所需產(chǎn)物，干燥并濃縮。在使用etoac和己烷作為洗脫液的正相上通過快速色譜法(固體加載)純化油狀產(chǎn)物4，得到紅色固體(1.78g，45％產(chǎn)率)。αme-6cl-trp(boc)-ni-s-bpb，4：m+h計算775.21，m+h觀測775.26；¹hnmr(cdc13)δ:1.23(s,3h,αme)；1.56(m,11h,boc+ch2)；1.82-2.20(m,4h,2ch2)；3.03(m,1h,chα)；3.24(m,2h,ch2)；3.57和4.29(ab系統(tǒng),2h,ch2(苯甲基),j＝12.8hz)；6.62(d,2h)；6.98(d,1h)；7.14(m,2h)；7.23(m,1h)；7.32-7.36(m,5h)；7.50(m,2h)；7.67(bs,1h)；7.98(d,2h)；8.27(m,2h)。

fmoc-αme-6cl-trp(boc)-oh，6。向50℃的3nhcl/meoh(1/3，15ml)溶液中逐滴加入化合物4(1.75g，2.3mmol，1當(dāng)量)的meoh(5ml)溶液。原始材料在3-4h內(nèi)消失。然后用冰浴使酸性溶液冷卻至0℃，并用na2co3(1.21g，11.5mmol，5當(dāng)量)水溶液將其猝滅。除去甲醇，并向懸浮液中添加另外8當(dāng)量的na2co3(1.95g，18.4mmol)。然后添加清除鎳的edta二鈉鹽二水合物(1.68g，4.5mmol，2當(dāng)量)，并攪拌該懸浮液2h。添加fmoc-osu(0.84g，2.5mmol，1.1當(dāng)量)的丙酮(50ml)溶液并攪拌該反應(yīng)液過夜。之后，用乙醚和1nhc1稀釋該反應(yīng)液。然后用硫酸鎂干燥有機層，并在真空中濃縮。在正相上使用丙酮和二氯甲烷作為洗脫液純化所需產(chǎn)物6，得到白色泡沫(0.9g，70％產(chǎn)率)。fmoc-αme-6cl-trp(boc)-oh，6：m+h計算575.19,m+h觀測575.37；^lhnmr(cdc13)1.59(s,9h,boc)；1.68(s,3h,me)；3.48(bs,2h,ch2)；4.22(m,1h,ch)；4.39(bs,2h,ch2)；5.47(s,1h,nh)；7.10(m,1h)；7.18(m,2h)；7.27(m,2h)；7.39(m,2h)；7.50(m,2h)；7.75(d,2h)；8.12(bs,1h)。

6cl-trp(boc)-ni-s-bpb，5。在氬氣下向gly-ni-s-bpb(4.6g，9.2mmol，1當(dāng)量)和ko-tbu(1.14g，10.1mmol，1.1當(dāng)量)中加入95mldmf。通過注射器添加溴化物衍生化合物3(3.5g，4.6mmol，1.1當(dāng)量)在dmf(10ml)中的溶液。在環(huán)境溫度下攪拌反應(yīng)混合物1h。然后用5％的醋酸水溶液猝滅溶液，并用水稀釋。在二氯甲烷中萃取所需產(chǎn)物，干燥并濃縮。在正相上使用etoac和己烷作為洗脫液通過快速色譜法(固體加載)純化油狀產(chǎn)物5，得到紅色固體(5g，71％產(chǎn)率)。6cl-trp(boc)-ni-s-bpb，5：m+h計算761.20，m+h觀測761.34；¹hnmr(cdcl3)δ:1.58(m,11h,boc+ch2)；1.84(m,1h)；1.96(m,1h)；2.24(m,2h,ch2)；3.00(m,1h,chα)；3.22(m,2h,ch2)；3.45和4.25(ab系統(tǒng),2h,ch2(苯甲基),j＝12.8hz)；4.27(m,1h,chα)；6.65(d,2h)；6.88(d,1h)；7.07(m,2h)；7.14(m,2h)；7.28(m,3h)；7.35-7.39(m,2h)；7.52(m,2h)；7.96(d,2h)；8.28(m,2h)。

fmoc-6cl-trp(boc)-oh，7。向50℃下的3nhcl/meoh(1/3，44ml)溶液中逐滴加入化合物5(5g，6.6mmol，1當(dāng)量)在meoh(10ml)中的溶液。原始材料在3-4h內(nèi)消失。然后用冰浴使酸性溶液冷卻至0℃，并用na2co3(3.48g，33mmol，5當(dāng)量)水溶液將其猝滅。除去甲醇，并向懸浮液中添加另外8當(dāng)量的na2co3(5.57g，52mmol)。然后添加清除鎳的edta二鈉鹽二水合物(4.89g，13.1mmol，2當(dāng)量)，并攪拌懸浮液2h。添加fmoc-osu(2.21g，6.55mmol，1.1當(dāng)量)在丙酮(100ml)中的溶液，并攪拌反應(yīng)液過夜。之后，用乙醚和1nhc1稀釋該反應(yīng)液。然后用硫酸鎂干燥有機層，并在真空中濃縮。在正相上使用丙酮和二氯甲烷作為洗脫液純化所需產(chǎn)物7，得到白色泡沫(2.6g，69％產(chǎn)率)。fmoc-6cl-trp(boc)-oh，7：m+h計算561.17，m+h觀測561.37；¹hnmr(cdc13)1.63(s,9h,boc)；3.26(m,2h,ch2)；4.19(m,1h,ch)；4.39(m,2h,ch2)；4.76(m,1h)；5.35(d,1h,nh)；7.18(m,2h)；7.28(m,2h)；7.39(m,3h)；7.50(m,2h)；7.75(d,2h)；8.14(bs,1h)。

實施例2：擬肽大環(huán)化合物

如以前所述以及如下所述合成、純化和分析擬肽大環(huán)化合物(schafmeister等人，j.am.chem.soc.122:5891-5892(2000)；schafmeister和verdine，j.am.chem.soc.122:5891(2005)；walensky等人，science305:1466-1470(2004)；和美國專利號7,192,713)。通過用相對應(yīng)的合成氨基酸替代兩個或多個天然存在的氨基酸來設(shè)計擬肽大環(huán)化合物。替代發(fā)生在i和i+4以及i和i+7位。使用固相條件、rinkamideam樹脂(novabiochem)和fmoc主鏈保護基團化學(xué)方法人工地或在自動化肽合成儀(appliedbiosystems，433a型)上進行肽合成。對于天然fmoc保護的氨基酸(novabiochem)的偶聯(lián)，使用10當(dāng)量的氨基酸和1:1:2摩爾比的偶聯(lián)試劑hbtu/hobt(novabiochem)/diea。非天然氨基酸(4當(dāng)量)與1:1:2摩爾比的hatu(appliedbiosystems)/hobt/diea偶聯(lián)。合成肽的n末端被乙?；?，而c末端被酰胺化。

通過在反相c18柱(varian)上的高效液相色譜法(hplc)(varianprostar)來實現(xiàn)交聯(lián)化合物的純化，以產(chǎn)生純的化合物。通過lc/ms質(zhì)譜法(與agilent1100hplc系統(tǒng)接口連接的micromasslct)和氨基酸分析(appliedbiosystems，型號420a)確認該純產(chǎn)物的化學(xué)組成。

在包括sp662、sp663和sp664在內(nèi)的二炔烴交聯(lián)的擬肽大環(huán)化合物的合成中使用下列方案。以0.2mmol規(guī)模在peg-ps樹脂(加載0.45mmol/g)上合成完全保護的結(jié)合樹脂的肽。通過采用在dmf中的20％(v/v)的哌啶對結(jié)合樹脂的肽進行3×10min的處理來實現(xiàn)臨時fmoc基團的脫保護。用nmp(3×)、二氯甲烷(3×)和nmp(3x)洗滌后，通過與適當(dāng)?shù)念A(yù)活化的fmoc-氨基酸衍生物進行1×60min的溫育來實現(xiàn)每個連續(xù)氨基酸的偶聯(lián)。在將偶聯(lián)溶液轉(zhuǎn)移至脫保護的結(jié)合樹脂的肽之前，將所有被保護的氨基酸(0.4mmol)溶解在nmp中，并用hctu(0.4mmol)和diea(0.8mmol)進行活化。偶聯(lián)反應(yīng)完成后，洗滌樹脂，準(zhǔn)備下一個脫保護/偶聯(lián)循環(huán)。在存在于nmp中的乙酸酐/diea的存在下進行氨基末端的乙?；?。對從完全組裝的結(jié)合樹脂的肽的等分試樣所獲得的已切割和脫保護的樣品進行l(wèi)c-ms分析以驗證每個偶聯(lián)的完成。在典型的實例中，將四氫呋喃(4ml)和三乙胺(2ml)加入到在40ml玻璃小瓶中的肽樹脂(0.2mmol)中并搖動10分鐘。然后加入pd(pph3)2cl2(0.014g,0.02mmol)和碘化亞銅(0.008g,0.04mmol)，并將所得反應(yīng)混合物在大氣開放的同時機械搖動16小時。在室溫下通過用tfa/h2o/tis(95/5/5v/v)處理2.5h來將二炔環(huán)化的結(jié)合樹脂的肽脫保護并從固體載體上切下。將樹脂過濾后，使tfa溶液在冷乙醚中沉淀并進行離心，以生產(chǎn)呈固體的所需產(chǎn)物。通過制備型hplc對粗產(chǎn)物進行純化。

在包括sp665在內(nèi)的單炔交聯(lián)的擬肽大環(huán)化合物的合成中使用下列方案。以0.1mmol規(guī)模在rinkamidembha樹脂(加載0.62mmol/g)上合成完全保護的結(jié)合樹脂的肽。通過采用在nmp中的25％(v/v)的哌啶對結(jié)合樹脂的肽進行2×20min的處理來實現(xiàn)臨時fmoc基團的脫保護。采用nmp和二氯甲烷進行充分的流動洗滌后，通過與適當(dāng)?shù)念A(yù)活化的fmoc-氨基酸衍生物進行1×60min的溫育來實現(xiàn)每個連續(xù)氨基酸的偶聯(lián)。在將偶聯(lián)溶液轉(zhuǎn)移至脫保護的結(jié)合樹脂的肽之前，將所有被保護的氨基酸(1mmol)溶解在nmp中，并用hctu(1mmol)和diea(1mmol)進行活化。偶聯(lián)反應(yīng)完成后，對樹脂進行充分的流動洗滌，準(zhǔn)備下一個脫保護/偶聯(lián)循環(huán)。在存在于nmp/nmm中的乙酸酐/diea的存在下進行氨基末端的乙?；?。對從完全組裝的結(jié)合樹脂的肽的等分試樣所獲得的已切割和脫保護的樣品進行l(wèi)c-ms分析以驗證每個偶聯(lián)反應(yīng)的完成。在一個典型的實例中，用dcm洗滌肽樹脂(0.1mmol)。將樹脂裝入微波小瓶中。對容器進行抽真空并用氮氣進行吹掃。加入六羰基鉬(0.01當(dāng)量,sigmaaldrich199959)。將無水氯苯加入到反應(yīng)容器中。然后加入2-氟苯酚(1當(dāng)量,sigmaaldrichf12804)。將反應(yīng)物裝入微波爐，并在130℃保持10分鐘。可能需要在隨后的時間推動反應(yīng)以完成反應(yīng)。在室溫下通過用tfa/h2o/tis(94/3/3v/v)處理3h來對炔烴復(fù)分解的樹脂結(jié)合肽進行脫保護并將其從固體載體上切下。將樹脂過濾后，使tfa溶液在冷乙醚中沉淀并進行離心，以得到呈固體的所需產(chǎn)物。通過制備型hplc對粗產(chǎn)物進行純化。

表1示出了所制備的擬肽大環(huán)化合物的列表。

表1

表1a示出了擬肽大環(huán)化合物的選擇。

表1a

表1b示出了擬肽大環(huán)化合物的進一步選擇。

表1b

在上文和別處顯示的序列中，使用了以下縮寫：“nle”表示正亮氨酸，“aib”表示2-氨基異丁酸，“ac”表示乙酰基，并且“pr”表示丙酰基。由“$”表示的氨基酸是由全碳交聯(lián)體連接的α-mes5-戊烯基-丙氨酸烯烴氨基酸，其包含一個雙鍵。由“$r5”表示的氨基酸是由全碳交聯(lián)體連接的α-mer5-戊烯基-丙氨酸烯烴氨基酸，其包含一個雙鍵。由“$s8”表示的氨基酸是由全碳交聯(lián)體連接的α-mes8-辛烯基-丙氨酸烯烴氨基酸，其包含一個雙鍵。由“$r8”表示的氨基酸是由全碳交聯(lián)體連接的α-mer8-辛烯基-丙氨酸烯烴氨基酸，其包含一個雙鍵?！癮hx”表示氨基環(huán)己基連接體。該交聯(lián)體是直鏈全碳交聯(lián)體，其在每個氨基酸的α碳之間包含8個或11個碳原子。由“$/”表示的氨基酸是并非由任何交聯(lián)體連接的α-mes5-戊烯基-丙氨酸烯烴氨基酸。由“$/r5”表示的氨基酸是未由任何交聯(lián)體連接的α-mer5-戊烯基-丙氨酸烯烴氨基酸。由“$/s8”表示的氨基酸是未由任何交聯(lián)體連接的α-mes8-辛烯基-丙氨酸烯烴氨基酸。由“$/r8”表示的氨基酸是未由任何交聯(lián)體連接的α-mer8-辛烯基-丙氨酸烯烴氨基酸。由“amw”表示的氨基酸是氨基酸α-me色氨酸。由“aml”表示的氨基酸是氨基酸α-me亮氨酸。由“amf”表示的氨基酸是氨基酸α-me苯丙氨酸。由“2ff”表示的氨基酸是氨基酸2-氟-苯丙氨酸。由“3ff”表示的氨基酸是氨基酸3-氟-苯丙氨酸。由“st”表示的氨基酸是包含兩條戊烯基丙氨酸烯烴側(cè)鏈且如所示每條側(cè)鏈與另一氨基酸交聯(lián)的氨基酸。由“st//”表示的氨基酸是包含兩條不交聯(lián)的戊烯基丙氨酸烯烴側(cè)鏈的氨基酸。由“％st”表示的氨基酸是包含兩條戊烯基丙氨酸烯烴側(cè)鏈且如所示每條側(cè)鏈通過完全飽和的烴交聯(lián)與另一氨基酸交聯(lián)的氨基酸。由“ba”表示的氨基酸是β-丙氨酸。交聯(lián)氨基酸的名稱內(nèi)的小寫字母“e”或“z”(例如“$er8”或“$zr8”)表示雙鍵構(gòu)型(分別為e或z)。在其它情況下，諸如“a”或“f”的小寫字母表示d氨基酸(例如，分別為d-丙氨酸或d-苯丙氨酸)。指定為“nmw”的氨基酸表示n-甲基色氨酸。指定為“nmy”的氨基酸表示n-甲基酪氨酸。指定為“nma”的氨基酸表示n-甲基丙氨酸。“kbio”表示連接至賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基的生物素基團。指定為“sar”的氨基酸表示肌氨酸。指定為“cha”的氨基酸表示環(huán)己基丙氨酸。指定為“cpg”的氨基酸表示環(huán)戊基甘氨酸。指定為“cba”的氨基酸表示環(huán)丁基丙氨酸。指定為“f4i”的氨基酸表示4-碘代苯丙氨酸?！?l”表示n15同位素亮氨酸。指定為“f3cl”的氨基酸表示3-氯苯丙氨酸。指定為“f4cooh”的氨基酸表示4-羧基苯丙氨酸。指定為“f34f2”的氨基酸表示3,4-二氟苯丙氨酸。指定為“6clw”的氨基酸表示6-氯色氨酸。指定為“$rda6”的氨基酸表示經(jīng)由二炔鍵交聯(lián)至第二炔基氨基酸的α-mer6-己炔基-丙氨酸炔基氨基酸。指定為“$da5”的氨基酸表示α-mes5-戊炔基-丙氨酸炔基氨基酸，其中該炔烴與第二炔基氨基酸形成二炔鍵的一半。指定為“$ra9”的氨基酸表示經(jīng)由炔烴復(fù)分解反應(yīng)與第二炔基氨基酸交聯(lián)的α-mer9-壬炔基-丙氨酸炔基氨基酸。指定為“$a6”的氨基酸表示經(jīng)由炔烴復(fù)分解反應(yīng)與第二炔基氨基酸交聯(lián)的α-mes6-己炔基-丙氨酸炔基氨基酸。指定“iso1”或“iso2”指示該擬肽大環(huán)化合物是單一異構(gòu)體。

指定為“cit”的氨基酸表示瓜氨酸。分別指定為“cou4”、“cou6”、“cou7”和“cou8”的氨基酸表示下列結(jié)構(gòu)：

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物以超過一種異構(gòu)體獲得，例如這是由于交聯(lián)體結(jié)構(gòu)中雙鍵的構(gòu)型(e與z)。此類異構(gòu)體能夠或不能通過常規(guī)的色譜法分離。在一些實施方案中，一種異構(gòu)體相對于其它異構(gòu)體具有改善的生物學(xué)性質(zhì)。在一個實施方案中，擬肽大環(huán)化合物的e交聯(lián)體烯烴異構(gòu)體相對于其z對應(yīng)物具有更好的溶解度、更好的靶標(biāo)親和性、更好的體內(nèi)或體外效力、更高的螺旋度或提高的細胞透性。在一個實施方案中，擬肽大環(huán)化合物的z交聯(lián)體烯烴異構(gòu)體相對于其e對應(yīng)物具有更好的溶解度、更好的靶標(biāo)親和性、更好的體內(nèi)或體外效力、更高的螺旋度或提高的細胞透性。

表1c顯示了示例性的擬肽大環(huán)化合物：

表1c

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物不包括表2a所示的擬肽大環(huán)化合物：

表2a

在表2中，x表示s或任意氨基酸。所示的肽可包含n-末端封端基團如乙?；蛄硗獾倪B接體，如在封端基團與肽序列的起點之間的β-丙氨酸。

在一些實施方案中，擬肽大環(huán)化合物不包含如表2a所示的擬肽大環(huán)化合物結(jié)構(gòu)。

在其它實施方案中，擬肽大環(huán)化合物不包括表2b所示的擬肽大環(huán)化合物。

表2b

在一些實施方案中，本文公開的擬肽大環(huán)化合物不包含如表2b所示的擬肽大環(huán)化合物結(jié)構(gòu)。

表2c示出了包含d-氨基酸的非交聯(lián)多肽的實例。

實施例3：與mdmx復(fù)合的擬肽大環(huán)化合物的x射線共晶學(xué)

對于與肽46(表2b)的共結(jié)晶，在開始進行結(jié)晶實驗前，將來自在dmso中的100mm儲備溶液的化學(xué)計算量的化合物加入到斑馬魚mdmx蛋白質(zhì)溶液中，并在4℃下靜置過夜。該程序與popowicz等人描述的過程相似，有一些變化，如下文所述。使用pet15b載體從大腸桿菌bl21(de3)表達系統(tǒng)中獲得蛋白質(zhì)(殘基15-129，l46v/v95l)。使細胞在37℃下生長并用1mmiptg以0.7細胞的od600進行誘導(dǎo)以使細胞在23℃下再生長18小時。使用ni-nt瓊脂糖隨后使用superdex75緩沖液(采用50mmnapo4、ph8.0、150mmnacl、2mmtcep進行)純化蛋白質(zhì)，然后濃縮至24mg/ml。將緩沖液更換為20mm的tris(ph8.0，50mmnacl，2mmdtt)用于結(jié)晶實驗。采用nextal(qiagen)ams篩#94得到初始晶體，且最終優(yōu)化的儲液為2.6mams，75mm的hepes，ph7.5。晶體在4℃下按常規(guī)作為薄片生長，并通過含有濃縮的(3.4m)丙二酸酯牽引它們進行冷沉淀保護，然后就驟冷，儲存，并在液氮中裝運。

在aps，在100°k且波長的光束線31-id(sgx-cat)下進行數(shù)據(jù)的收集。光束線配備有rayonix225-he探測器。對于數(shù)據(jù)收集，采用0.8秒的曝光時間使晶體以1°的增量在整個180°進行旋轉(zhuǎn)。使用mosflm/scala(ccp4；參見theccp4suite:programsforproteincrystallography.actacrystallogr.d50,760-763(1994)；p.r.evans.jointccp4以及esf-eacbmnewsletter33,22-24(1997))以空間群c2(晶胞：a＝109.2786，b＝81.0836，α＝90，β＝89.8577，γ＝90°)對數(shù)據(jù)進行處理并縮減。采用程序molrep(ccp4；參見a.vagin&a.teplyakov.j.appl.cryst.30,1022-1025(1997))的分子置換通過采用由popowicz等(2z5s；參見g.m.popowicz,a.czarna,u.rothweiler,a.szwagierczak,m.krajewski,l.weber&t.a.holak.cellcycle6,2386-2392(2007))確定的結(jié)構(gòu)的mdmx分量進行，并識別了在非對稱單元中的兩個分子。采用程序refmac僅對斑馬魚mdmx的兩個分子進行初始精煉(ccp4；參見g.n.murshudov,a.a.vagin&e.j.dodson.actacrystallogr.d53,240-255(1997))產(chǎn)生0.3424的r-因子(rfree＝0.3712)和鍵的rmsd值和角度(1.698°)。對于從gln¹⁹開始且包括所有的脂肪族釘(staple)的釘肽成分的電子密度是非常明確的。使用cnx(accelrys)及數(shù)據(jù)進一步細化為的分辨率產(chǎn)生了被很好地精煉(rf＝0.2601,rfree＝0.3162,rmsd及rmsd角＝0.916°)的模型(由來自mdmx的1448個原子、來自釘肽的272個原子和46個水分子組成)。

本實施例的結(jié)果示于圖1和圖2中。

實施例4：α-螺旋度的圓二色性(cd)分析

使用帶有第2版jascospectramanager系統(tǒng)軟件的jascoj-815分光偏振計(jascoinc.,easton,md)通過cd光譜法分析肽溶液。使用珀爾帖(peltier)溫度控制器保持對光單元的溫度控制。結(jié)果表示為從公式[θ]＝θobs·mrw/10*l*c計算得到的平均摩爾橢圓度[θ](degcm2dmol-1)，在該公式中，θobs為觀察到的以毫度為單位的橢圓度，mrw為肽的平均殘基重量(肽的分子量/殘基數(shù))，l為以厘米為單位的單元的光程長度，c為以mg/ml為單位的肽濃度。通過氨基酸分析確定肽濃度。在溫和cd緩沖液(20mm磷酸，ph2)中制備肽的儲備溶液。使用該儲備溶液在溫和cd緩沖液或含有50％三氟乙醇(tfe)的cd緩沖液中制備0.05mg/ml的肽溶液，以用于在10mm光程單元中的分析。在4℃下，從195至250nm，以0.2nm的增量以及每分鐘50nm的掃描速度掃描肽溶液的可變波長測量值。報告了六次掃描的平均值。

表3示出針對選定的擬肽大環(huán)化合物的圓二色性數(shù)據(jù)：

表3

實施例5：利用熒光偏振(fp)對mdm2的直接結(jié)合測定

該測定按照以下一般方案進行：

1.將mdm2(內(nèi)部，41kd)稀釋到fp緩沖液(高鹽緩沖液-200mmnacl，5mmchaps，ph7.5)中，從而制備10μμ工作儲備溶液。

2.將30μl10μμ蛋白質(zhì)儲備溶液添加到96孔黑色he微孔板(moleculardevices)的a1和b1孔中。

3.將30μlfp緩沖液填充到第a2至a12、b2至b12、c1至c12和d1至d12列中。

4.蛋白質(zhì)儲備液從a1、b1經(jīng)2或3倍系列稀釋至a2、b2；a2、b2稀釋至a3、b3；...在最后一個稀釋點達到個位數(shù)的nm濃度。

5.用dmso將1mm(在100％dmso中)fam標(biāo)記的線性肽稀釋到100μμ(1:10稀釋)。然后，用水從100μμ稀釋到10μμ(1:10稀釋)，然后用fp緩沖液從10μμ稀釋到40nm(1:250稀釋)。這就是工作溶液，其在孔中將是10nμ濃度(1:4稀釋)。將稀釋的fam標(biāo)記的肽保持在暗處，直至使用。

6.將10μl10nμfam標(biāo)記的肽添加到各孔中并溫育，在不同時間點讀數(shù)。5-fam-baltfehywaqlts-nh2(seqidno:943)的kd為約13.38nm。

實施例6：對mdm2的競爭性熒光偏振測定

該測定按照以下一般方案進行：

1.將mdm2(內(nèi)部，41kd)稀釋到fp緩沖液(高鹽緩沖液-200mmnacl，5mmchaps，ph7.5.)中，從而制備84nm(2x)工作儲備溶液。

2.將20μl84nm(2x)蛋白質(zhì)儲備溶液添加到96孔黑色he微孔板(moleculardevices)的各孔中。

3.用dmso將1mm(在100％dmso中)fam標(biāo)記的線性肽稀釋到100μμ(1:10稀釋)。然后，用水從100μμ稀釋到10μμ(1:10稀釋)，然后用fp緩沖液從10μμ稀釋到40nm(1:250稀釋)。這就是工作溶液，其在孔中將是10nμ濃度(1:4稀釋)。將稀釋的fam標(biāo)記的肽保持在暗處，直至使用。

4.用fp緩沖液制備未標(biāo)記的肽劑量板，從1μμ(終濃度)肽開始，并使用以下稀釋方案為6個點制備5倍系列稀釋。

用dmso將10mm(在100％dmso中)稀釋到5mm(1:2稀釋)。然后，用h2o從5mm稀釋到500μμ(1:10稀釋)，然后用fp緩沖液從500μμ稀釋到20μμ(1:25稀釋)。從20μμ(4x)為6個點制備5倍系列稀釋。

5.將10μl系列稀釋的未標(biāo)記的肽轉(zhuǎn)移到充填有20μl84nm蛋白質(zhì)的各孔中。

6.將10μl10nμ(4x)fam標(biāo)記的肽添加到各孔中并溫育3小時以讀數(shù)。

實施例7：利用熒光偏振(fp)對mdmx的直接結(jié)合測定

該測定按照以下一般方案進行：

1.將mdmx(內(nèi)部，40kd)稀釋到fp緩沖液(高鹽緩沖液-200mmnacl，5mmchaps，ph7.5)中，從而制備10μμ工作儲備溶液。

2.將30μl10μμ蛋白質(zhì)儲備溶液添加到96孔黑色he微孔板(moleculardevices)的a1和b1孔中。

3.將30μlfp緩沖液填充到第a2至a12、b2至b12、c1至c12和d1至d12列中。

4.蛋白質(zhì)儲備液從a1、b1經(jīng)2或3倍系列稀釋到a2、b2；a2、b2稀釋到a3、b3；...在最后一個稀釋點達到個位數(shù)的nm濃度。

5.用dmso將1mm(在100％dmso中)fam標(biāo)記的線性肽稀釋到100μμ(1:10稀釋)。然后，用水從100μμ稀釋到10μμ(1:10稀釋)，然后用fp緩沖液從10μμ稀釋到40nm(1:250稀釋)。這就是工作溶液，其在孔中將是10nμ濃度(1:4稀釋)。將稀釋的fam標(biāo)記的肽保持在暗處，直至使用。

6.將10μl10nμfam標(biāo)記的肽添加到各孔中并溫育，在不同時間點讀數(shù)。

5-fam-baltfehywaqlts-nh2(seqidno:943)的kd為約51nm。

實施例8：對mdmx的競爭性熒光偏振測定

該測定按照以下一般方案進行：

1.將mdmx(內(nèi)部，40kd)稀釋到fp緩沖液(高鹽緩沖液-200mmnacl，5mmchaps，ph7.5)中，從而制備300nm(2x)工作儲備溶液。

2.將20μl300nm(2x)蛋白質(zhì)儲備溶液添加到96孔黑色he微孔板(moleculardevices)的各孔中。

3.用dmso將1mm(在100％dmso中)fam標(biāo)記的線性肽稀釋到100μμ(1:10稀釋)。然后，用水從100μμ稀釋到10μμ(1:10稀釋)，然后用fp緩沖液從10μμ稀釋到40nm(1:250稀釋)。這就是工作溶液，其在孔中將是10nμ濃度(1:4稀釋)。將稀釋的fam標(biāo)記的肽保持在暗處，直至使用。

4.用fp緩沖液準(zhǔn)備未標(biāo)記的肽劑量板，從5μμ(終濃度)肽開始，并使用以下稀釋方案為6個點制備5倍系列稀釋。

5.用dmso將10mm(在100％dmso中)稀釋到5mm(1:2稀釋)。然后，用h2o從5mm稀釋到500μμ(1:10稀釋)，然后用fp緩沖液從500μμ稀釋到20μμ(1:25稀釋)。從4μμ(4x)為6個點制備5倍系列稀釋。

6.將10μl系列稀釋的未標(biāo)記的肽轉(zhuǎn)移到填充有20μl300nm蛋白質(zhì)的各孔中。

7.將10μl10nμ(4x)fam標(biāo)記的肽添加到各孔中并溫育3小時以讀數(shù)。

實施例5-8的結(jié)果在表4中示出。使用下列標(biāo)度：“+”表示大于1000nm的值，“++”表示大于100nm且小于或等于1000nm的值，“+++”表示大于10nm且小于或等于100nm的值，而“++++”表示小于或等于10nm的值。

表4

實施例9：競爭性結(jié)合elisa(mdm2和mdmx)

在室溫下將p53-his6蛋白質(zhì)(“his6”公開為seqidno:1501)(30nm/孔)在96孔immulon板的孔中包被過夜。在實驗當(dāng)天，使用自動

elisa洗板器用1xpbs-吐溫20(0.05％)洗板，在室溫下采用elisa微孔封閉將板封閉30分鐘；通過用1xpbs-吐溫20(0.05％)洗板以洗掉過量的封閉劑。在無菌水中將肽從10mmdmso儲備液稀釋至500μμ工作儲備液，在0.5％dmso中進行進一步稀釋，以在樣品中保持dmso濃度恒定。向孔中加入50μl體積的2x期望濃度的肽，隨后添加稀釋的gst-mdm2或gst-hmdx蛋白質(zhì)(最終濃度：10nm)。在室溫下溫育樣品2h，用pbs-吐溫20(0.05％)洗板，之后添加100μl的在hrp穩(wěn)定緩沖液中稀釋至0.5μg/ml的hrp偶聯(lián)抗gst抗體[hypromatrix，inc]。在與檢測抗體溫育30min后，洗板，并與100μl/孔的tmb-e底物溶液溫育高達30分鐘；用1mhcl停止反應(yīng)，并在微孔板閱讀器上在450nm下測量吸光度。使用graphpadprism軟件分析數(shù)據(jù)。

實施例10：細胞活力分析

該分析按照以下一般方案進行：

細胞接種：在測定前一天對細胞進行胰蛋白酶化，計數(shù)，并以預(yù)定密度接種在96孔板中。對使用中的各個細胞系，使用以下細胞密度：

●sjsa-1：7500個細胞/孔

●rko：5000個細胞/孔

●rko-e6：5000個細胞/孔

●hct-116：5000個細胞/孔

●sw-480：2000個細胞/孔

●mcf-7：5000個細胞/孔

在研究當(dāng)天，在室溫下將培養(yǎng)基替換為含有11％fbs的新鮮培養(yǎng)基(測定培養(yǎng)基)。每孔添加180μl測定培養(yǎng)基。不含細胞的對照孔接收200μl培養(yǎng)基。

肽稀釋：所有稀釋均在室溫下進行并在室溫下添加至細胞。

·在dmso中制備肽的10mm儲備液。使用dmso作為稀釋劑，利用1:3稀釋方案連續(xù)稀釋儲備液，以得到10、3.3、1.1、0.33、0.11、0.03、0.01mm的溶液。使用無菌水將連續(xù)dmso稀釋的肽稀釋33.3倍。這產(chǎn)生了10x工作儲備液的范圍。也為對照孔準(zhǔn)備了dmso/無菌水(3％dmso)混合物。

·因此工作儲備濃度范圍μμ將是300、100、30、10、3、1、0.3和0μμ。使用多通道在各稀釋步驟充分混合。

·h行含有對照。h1-h3將接收20μl測定培養(yǎng)基。h4-h9將接收20μl3％dmso-水載體。h10-h12將含有不含細胞的單獨培養(yǎng)基對照。

·陽性對照：mdm2小分子抑制劑nutlin-3a(10mm)用作陽性對照。使用與肽相同的稀釋方案稀釋nutlin。

向細胞添加工作儲備液：

·向適當(dāng)?shù)目字刑砑?0μl10x期望濃度，以在孔中在200μl總體積中達到終濃度。(20μl300μμ肽+180μl培養(yǎng)基中的細胞＝在孔中在200μl體積中的30μμ終濃度)。使用移液管輕柔混合數(shù)次。因此，使用的終濃度范圍將是30、10、3、1、0.3、0.1、0.03和0μμ(對于強的肽，包括進一步的稀釋)。

·對照包括未獲得肽但與包含肽的孔包含相同濃度的dmso的孔，和不含細胞的孔。

·在37℃在潮濕的5％co2氣氛下溫育72小時。

·使用來自promega的mtt試劑測定細胞的活力。sjsa-1、rko、rko-e6、hct-116細胞的活力在第3天測定，mcf-7細胞在第5天測定，而sw-480細胞在第6天測定。在指定的溫育時間結(jié)束時，使板回到室溫。從各孔中移除80μl測定培養(yǎng)基。向各孔添加15μl解凍的mtt試劑。

·將板在37℃在潮濕的5％co2氣氛下溫育2h，并按照生產(chǎn)商的方案添加100μl增溶試劑。于室溫在攪拌下溫育1h，并在synergybiotek多板閱讀器上讀取570nm處的吸光度。

·使用graphpadprism分析工具分析相對于dmso對照的細胞活力。

試劑：

·invitrogen細胞培養(yǎng)基

i.falcon96孔透明細胞培養(yǎng)處理板(nunc353072)

·dmso(sigmad2650)

·rpmi1640(invitrogen72400)

·mtt(promegag4000)

儀器：用于吸光度讀出的多板閱讀器(synergy2)。

來自細胞活力試驗的結(jié)果在表5和6中示出。使用下列標(biāo)度：“+”表示大于30μm的值，“++”表示大于15μm且小于或等于30μm的值，“+++”表示大于5μm且小于或等于15μm的值，而“++++”表示小于或等于5μm的值?！癷c50比”表示p53+/+細胞中的平均ic50相對于p53-/-細胞中的平均ic50的比值。

表5

表6

實施例11：p21elisa測定

該測定按照以下一般方案進行：

細胞接種：

·在測定前一天對sjsa1細胞進行胰蛋白酶化，計數(shù)，并以7500個細胞/100μl/孔的密度接種在96孔板中。

·在研究當(dāng)天，將培養(yǎng)基替換為新鮮的rpmi-11％fbs(測定培養(yǎng)基)。每孔添加90μl測定培養(yǎng)基。不含細胞的對照孔接收100μl培養(yǎng)基。

肽稀釋：

·在dmso中制備肽的10mm儲備液。使用dmso作為稀釋劑，利用1:3稀釋方案連續(xù)稀釋儲備液，以得到10、3.3、1.1、0.33、0.11、0.03、0.01mm的溶液。使用無菌水將連續(xù)dmso稀釋的肽稀釋33.3倍。這產(chǎn)生了10x工作儲備液范圍。也為對照孔準(zhǔn)備了dmso/無菌水(3％dmso)混合物。

·因此工作儲備液濃度范圍μμ將是300、100、30、10、3、1、0.3和0μμ。使用多通道在各稀釋步驟充分混合。

·h行含有對照。h1-h3將接收10ul測定培養(yǎng)基。h4-h9將接收10ul3％dmso-水載體。h10-h12將含有不含細胞的單獨培養(yǎng)基對照。

·陽性對照：hdm2小分子抑制劑nutlin-3a(10mm)用作陽性對照。使用與肽相同的稀釋方案稀釋nutlin。

向細胞添加工作儲備液：

·向適當(dāng)?shù)目字刑砑?0μl10x期望濃度，以在孔中在100μl總體積中達到終濃度。(10μl300μμ肽+90μl培養(yǎng)基中的細胞＝在孔中在100μl體積中的30μμ終濃度)。因此，使用的終濃度范圍將是30、10、3、1、0.3和0μμ。

·對照將包括未獲得肽但與包含肽的孔包含相同濃度的dmso的孔，和不含細胞的孔。

·溫育后20h，吸出培養(yǎng)基；用1xpbs(不含ca⁺⁺/mg⁺⁺)洗滌細胞，并在冰上在60μl1x細胞裂解緩沖液(稀釋到1x并補充有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的cellsignalingtechnologies10x緩沖液)中裂解30min。

·將板在4℃下以5000rpm的速度離心8min；收集澄清的上清液并于-80℃冷凍直至進一步使用。

蛋白質(zhì)估計：

·使用來自thermofisher的bca蛋白質(zhì)檢測試劑盒和bsa標(biāo)準(zhǔn)來測定裂解物的總蛋白質(zhì)含量。通常預(yù)期每孔約6-7μg蛋白質(zhì)。

·每孔使用50μl裂解物來建立p21elisa。

人類總p21elisa：elisa測定方案按照生產(chǎn)商的說明書進行。各孔使用50μl裂解物，并且各孔一式三份建立。

試劑：

·-cell-basedassay(-)-nutlin-3(10mm)：caymanchemicals，目錄號600034

·-optimem，invitrogen目錄號51985

·-cellsignaling裂解緩沖液(10x)，cellsignalingtechnology，目錄號9803

·-蛋白酶抑制劑混合片(迷你)，rochechemicals，目錄號04693124001

·-磷酸酶抑制劑混合片，rochechemicals，目錄號04906837001

·-人類總p21elisa試劑盒，r&dsystems，dyc1047-5

·-終止溶液(1mhcl)，cellsignalingtechnologies，目錄號7002

儀器：微型離心機-eppendorf5415d和用于吸光度讀出的多板閱讀器(synergy2)。

實施例12：胱天蛋白酶3檢測試驗：

該試驗按照以下一般方案進行：

細胞接種：在測定前一天對sjsa1細胞進行胰蛋白酶化，計數(shù)，并以7500個細胞/100μl/孔的密度接種在96孔板中。在研究當(dāng)天，將培養(yǎng)基替換為新鮮的rpmi-11％fbs(測定培養(yǎng)基)。每孔添加180μl測定培養(yǎng)基。不含細胞的對照孔接收200μl培養(yǎng)基。

肽稀釋：

·在dmso中制備肽的10mm儲備液。使用dmso作為稀釋劑，利用1:3稀釋方案連續(xù)稀釋儲備液，以得到10、3.3、1.1、0.33、0.11、0.03、0.01mm的溶液。使用無菌水將連續(xù)dmso稀釋的肽稀釋33.3倍。這產(chǎn)生了10x工作儲備液范圍。也為對照孔準(zhǔn)備了dmso/無菌水(3％dmso)混合物。

·因此工作儲備液濃度范圍μμ將是300、100、30、10、3、1、0.3和0μμ。使用多通道在各稀釋步驟充分混合。向適當(dāng)?shù)目字刑砑?0ul10x工作儲備液。

·h行含有對照。h1-h3將接收20ul測定培養(yǎng)基。h4-h9將接收20ul3％dmso-水載體。h10-h12將含有不含細胞的單獨培養(yǎng)基對照。

·陽性對照：mdm2小分子抑制劑nutlin-3a(10mm)用作陽性對照。使用與肽相同的稀釋方案稀釋nutlin。

向細胞添加工作儲備液：

·向適當(dāng)?shù)目字刑砑?0μl10x期望濃度，以在孔中在100μl總體積中達到終濃度。(10μl300μμ肽+90μl培養(yǎng)基中的細胞＝在孔中在100μl體積中的30μμ終濃度)。因此，使用的終濃度范圍將是30、10、3、1、0.3和0μμ。

·對照將包括未獲得肽但與包含肽的孔包含相同濃度的dmso的孔，和不含細胞的孔。

·溫育后48h，從各孔中吸出80μl培養(yǎng)基；每孔添加100μl胱天蛋白酶3/7glo測定試劑(promega胱天蛋白酶3/7glo測定系統(tǒng)，g8092)，于室溫在輕柔振蕩下溫育1h。

·在synergybiotek多板閱讀器上對讀取發(fā)光。

·數(shù)據(jù)作為胱天蛋白酶3對經(jīng)dmso處理的細胞的激活而進行分析。

自來實施例11和12的結(jié)果示于表7中：

表7

實施例13：由擬肽大環(huán)化合物引起的細胞裂解

提前一天以7500個細胞/孔并使用100ul/孔的生長培養(yǎng)基將

sjsa-1細胞鋪設(shè)在透明平底板(costar，目錄號353072)中，保留h行10-12列為空用于單獨放置培養(yǎng)基。在試驗當(dāng)天，將培養(yǎng)基更換為rpmi1％fbs培養(yǎng)基，每孔90ul培養(yǎng)基。

在100％的dmso中制備擬肽大環(huán)化合物的10mm儲備溶液。然后將擬肽大環(huán)化合物在100％的dmso中進行連續(xù)稀釋，然后進一步在無菌水中稀釋20倍，以制備各擬肽大環(huán)化合物在5％dmso/水中濃度為500um至62.5um的工作儲備溶液。

將10ul的各化合物加入到90ul的sjsa-1細胞中，以在含0.5％dmso的培養(yǎng)基中得到50um至6.25um的終濃度。陰性對照(非裂解)樣品為單獨的0.5％dmso，而陽性對照(裂解)樣品包括10um蜂毒肽和1％tritonx-100。

將細胞板在37℃下溫育1小時。在溫育1小時后，通過顯微鏡檢查細胞的形態(tài)，然后在室溫下將該板在1200rpm下離心5分鐘。對于每個擬肽大環(huán)化合物和對照樣品，將40ul上清液轉(zhuǎn)移到透明的分析板上。使用來自caymen的目錄號#1000882的ldh細胞毒性分析試劑盒測定ldh的釋放。

結(jié)果示于表8中：

表8

實施例14：p53grip試驗

thermoscientific*bioimagep53-hdm2redistributeassay監(jiān)測響應(yīng)于藥物化合物或其它刺激物，蛋白質(zhì)與mdm2的相互作用以及gfp-標(biāo)記的p53的細胞轉(zhuǎn)位。重組cho-hir細胞穩(wěn)定地表達與增強綠色熒光蛋白(egfp)的c末端融合的人p53(1-312)和pde4a4-hdm2(1-124)，后者是pde4a4和hdm2(1-124)之間的融合蛋白。它們提供了用于檢測實驗條件對p53和mdm2的相互作用的影響的即用型測定系統(tǒng)。使用hcs平臺進行成像和分析。

將cho-hir細胞常規(guī)維持在補充有1％青霉素-鏈霉素、0.5mg/ml遺傳霉素、1mg/mlzeocin和10％fbs的hamf12培養(yǎng)基中。在進行測定之前18-24h，使用培養(yǎng)基以7000個細胞/100μl/孔的密度將細胞接種至96孔板中。第二天，更新培養(yǎng)基，并向細胞添加pd177至3μμ的最終濃度以激活灶形成。對照孔保持為不含pd-177溶液。用pd177刺激后24h，用opti-mem培養(yǎng)基洗滌細胞一次，并向細胞添加50μl補充有pd-177(6μμ)的opti-mem培養(yǎng)基。在無菌水中將肽從10mmdmso儲備液稀釋至500μμ工作儲備液，在0.5％dmso中進行進一步稀釋，以保持樣品中的dmso濃度恒定。最終的最高dmso濃度是0.5％，并將其用作陰性對照。使用caymanchemicalscell-basedassay(-)-nutlin-3(10mm)作為陽性對照。使用與將50μl2x期望濃度的肽添加至適當(dāng)?shù)目字邢嗤南♂尫桨赶♂宯utlin以達到最終期望濃度。然后在濕潤的5％co2氣氛和37℃下，細胞與肽溫育6h。在溫育期之后，在室溫下通過輕輕地吸出培養(yǎng)基并每孔添加150μl固定溶液來固定細胞20分鐘。每次用200μlpbs/孔洗滌固定的細胞4次。在最后一次洗滌結(jié)束時，添加100μl1μμhoechst染色液。將密封的板在黑暗中溫育至少30分鐘，用pbs洗滌，以除去過量的染色劑，并向每孔中添加pbs。培養(yǎng)板可在4℃下于黑暗中儲存長達3天。利用位于使用針對hoechst和gfp的10x物鏡、xf-100濾光器組的cellomicsarrayscan儀器上的分子轉(zhuǎn)位模塊對p53/mdm2的轉(zhuǎn)位進行成像。輸出參數(shù)是mean-circringaveintenratio(核和細胞質(zhì)的平均熒光強度的比例(孔平均值))。將用于圖像分析的每孔最小可接受細胞數(shù)設(shè)置成500個細胞。

實施例15：使用sp315、sp249和sp154進行mcf-7乳腺癌研究

進行異種移植研究以測試sp315、sp249和sp154在mcf-7乳腺癌異種移植模型中抑制裸鼠的腫瘤生長的效力。在一組中還測試了陰性對照的釘肽、sp252、sp154的點突變(第19位f到a)；該肽在sjsa-1體外活力試驗中已經(jīng)顯示無活性。在腫瘤細胞移植前一天(-1天)，將緩釋90天的0.72mg的17β-雌二醇丸(innovativeresearch,sarasota,fl)皮下(sc)植入至頸部上的后頸上。在第0天將mcf-7腫瘤細胞皮下植入至雌性裸(crl:nu-foxn1nu)鼠的側(cè)腹。在第18天，使用卡尺測量所得到的sc腫瘤，以確定它們的長度和寬度，并對小鼠進行稱重。使用公式(長x寬2)/2計算出腫瘤的尺寸，并表示為立方毫米(mm³)。將腫瘤小于85.3mm3或大于417.4mm3的小鼠從隨后的組形成中排除。隨機形成13組小鼠，每組10只，以使組平均腫瘤尺寸基本等同(組的平均值±組的標(biāo)準(zhǔn)偏差＝180.7±17.5mm³)。

sp315、sp249、sp154和sp252的給藥溶液從在媒質(zhì)中配制的肽制備，該媒質(zhì)含有在ph7的10mm組氨酸緩沖鹽水中的濃度為50mg/ml的mpeg(2k)-dspe。該制劑在研究期間制備一次。該媒質(zhì)用作隨后的研究中的媒質(zhì)對照物。

針對各組指定不同的治療方案。第1組，作為媒質(zhì)陰性對照組，在第18-39天接收到以每周三次8ml/kg體重靜脈內(nèi)(iv)施用的煤質(zhì)。第2和3組分別接收到以每周三次30mg/kg或一周兩次40mg/kg靜脈注射的sp154。第4組接收到以每周三次靜脈注射的6.7mg/kg的sp249。第5、6、7和8組分別接收到每周三次26.7mg/kg、每周兩次20mg/kg、每周兩次30mg/kg靜脈注射的sp315。第9組接收到以每周三次靜脈注射的30mg/kg的sp252。

在給藥期間，對小鼠進行稱重并每周1-2次測量腫瘤。關(guān)于腫瘤體積的結(jié)果示于圖3-6中，且與媒質(zhì)組相比的腫瘤生長抑制率、體重變化和體重減輕值≥20％的小鼠的數(shù)目或死亡的小鼠的數(shù)目示于表9中。根據(jù)％tgi＝100-[(tuvol^{已治療的天數(shù)-第x天}–tuvol^{已治療的天數(shù)-第18天})/(tuvol^{媒質(zhì)陰性對照-第x天}-tuvol^{媒質(zhì)陰性對照-第18天})*100計算腫瘤生長抑制率(tgi)，其中x為正在進行治療效果評定的那一天。對于該腫瘤模型，第1組、媒質(zhì)陰性對照組顯示了良好的腫瘤生長速率。

對于sp154，在以每周兩次40mg/kg給藥的組中，2只小鼠在治療期間死亡，表明這種給藥方案是不可耐受的。每周三次30mg/kg的sp154的給藥方案耐受性良好，并取得了84％的tgi。

對于sp249，在以每周三次6.7mg/kg給藥的組中，4只小鼠在治療期間死亡，表明這種給藥方案是不可耐受的。

用于sp315的所有給藥方案均顯示出良好的耐受性，無顯著的體重減輕或死亡。采用每周兩次40mg/kg的sp315的給藥產(chǎn)生了最高的tgi(92％)。每周三次26.7mg/kg、每周兩次20mg/kg、每周兩次30mg/kg的sp315的給藥方案分別產(chǎn)生86％、82％和85％的tgi。

對于sp252，在體外試驗中沒有顯示出明顯的活性的sp154的點突變，采用每周三次30mg/kg的給藥具有較好的耐受性，無明顯的體重減輕或死亡。而在第32天前觀察到88％的tgi，該tgi在第39天前減少至41％。

本實施例的結(jié)果示于圖3-6中并總結(jié)于表9中。

表9

*p≤0.05相比于載體對照

實施例21：擬肽大環(huán)化合物的溶解度測定

首先將擬肽大環(huán)化合物溶解于純的n,n-二甲基乙酰胺(dma，sigma-aldrich，38840-1l-f)中以制備在20-140mg/ml的濃度范圍的20x儲備溶液。將dma儲備溶液在含有2％solutol-hs-15、25mm組氨酸、45mg/ml甘露醇的水性載體中稀釋20倍，以獲得擬肽大環(huán)化合物在5％dma、2％solutol-hs-15、25mm組氨酸、45mg/ml甘露醇中的1-7mg/ml的終濃度。通過反復(fù)移液或輕輕渦旋將終溶液輕輕地混合，然后在室溫下將終溶液在超聲波水浴中超聲處理10分鐘。然后，使用7x目視放大器在通風(fēng)櫥中進行仔細的目視觀察，以確定沉淀物是否在底部上或作為懸浮物存在。根據(jù)需要檢測另外的濃度范圍，以確定每種擬肽大環(huán)化合物的最大溶解度極限。

來自實施例的結(jié)果示于圖7中。

實施例22：使用boc保護的氨基酸制備擬肽大環(huán)化合物

如實施例2所述制備包含在第“i”位的r8氨基酸和在第“i+7”位的s5氨基酸的擬肽大環(huán)化合物的前體。在第“i+3”位的氨基酸為在固相合成中被合并的boc保護的色氨酸。具體而言，在固相合成中使用如下所示的boc保護的色氨酸(市售的，例如，購自novabiochem)：

在進行切割和脫保護步驟之前，使用釕催化劑進行復(fù)分解反應(yīng)。通過hplc分析確定環(huán)化后得到的組合物主要含有具有包含反式烯烴(“iso2”，包含在e構(gòu)型中的雙鍵)的交聯(lián)體的初級擬肽大環(huán)化合物。出乎意料的是，分別觀察到比例為90:10的反式和順式產(chǎn)物。