耐熱賴氨酸氨肽酶的發(fā)酵方法與流程

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種耐熱賴氨酸氨肽酶的發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

賴氨酸氨肽酶作為一種外切型蛋白酶，在食品、醫(yī)藥和化工等多種領(lǐng)域都有很重要的應(yīng)用?？捎糜谌コ鞍姿庖褐械目辔?、蛋白質(zhì)的深度水解、生物活性肽的制備或用作重組蛋白固定劑或蛋白序列測定所需的工具酶等，在食品、醫(yī)藥保健與化工行業(yè)應(yīng)用前景廣闊。

畢赤酵母，作為一種被廣泛應(yīng)用的宿主，已經(jīng)成功的表達(dá)了上百種外源蛋白，能夠進(jìn)行高密度發(fā)酵，提高外源蛋白的表達(dá)水平。與傳統(tǒng)的搖瓶發(fā)酵相比，畢赤酵母高密度發(fā)酵具有如下特點(diǎn)：(1)較高的生物量；(2)反應(yīng)體系所需空間小，成本低；(3)可通過提供純氧和補(bǔ)料，使發(fā)酵過程中溶氧和營養(yǎng)更充分滿足菌體產(chǎn)酶。

具備耐熱特點(diǎn)的蛋白水解酶類在提取及水解蛋白原料方面有很明顯的優(yōu)勢。譬如原料水解前預(yù)處理后不需降溫就可以加酶水解，蛋白結(jié)構(gòu)變性后更有利于蛋白水解酶的快速作用，大大提高了水解效率，且賴氨酸作為一種必須氨基酸和強(qiáng)化營養(yǎng)食品中的常用氨基酸，其制備與應(yīng)用方面的研究意義重大。但目前使用畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)出耐熱賴氨酸氨肽酶的方法過程較復(fù)雜，產(chǎn)量不高，極大的限制了其應(yīng)用和研究。

此外，采用現(xiàn)有技術(shù)分離耐熱賴氨酸氨肽酶時，會出現(xiàn)使酶失活的現(xiàn)象，因而也限制了該酶的應(yīng)用研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種耐熱賴氨酸氨肽酶的發(fā)酵方法，采用本發(fā)明的發(fā)酵方法，能夠提高胞外賴氨酸氨肽酶的表達(dá)水平，且本發(fā)明的純化步驟能夠保證賴氨酸氨肽酶的活性不受影響，本發(fā)明的賴酸氨肽酶與內(nèi)切酶協(xié)同水解蛋白時，能夠先水解賴氨酸，然后再水解亮氨酸。

在一方面，本發(fā)明提供了一種耐熱賴氨酸氨肽酶的發(fā)酵方法，包括以下步驟：

(1)將重組畢赤酵母種子液按8-12％接種量接種至bsm培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，重組畢赤酵母為含有來源于銅綠假單胞菌nj-814的賴氨酸氨肽酶基因的畢赤酵母菌，銅綠假單胞菌nj-814的保藏編號為cgmccno.7638；

(2)當(dāng)培養(yǎng)基中的初始甘油耗完后，流加甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基，當(dāng)od600達(dá)到350-450后停止流加，然后流加甲醇水溶液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，當(dāng)酶活下降時停止發(fā)酵培養(yǎng)，得到耐熱賴氨酸氨肽酶。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，在初始轉(zhuǎn)速為450-550r·min^-1，通氣量為2vvm，30℃的條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速度為17-19ml·h^-1·l^-1。

進(jìn)一步地，在步驟(1)中，重組畢赤酵母種子液的制備方法包括以下步驟：將活化后的重組畢赤酵母在bmgy培養(yǎng)基中，于25-35℃，200-250r·min^-1的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，流加甲醇水溶液之前還包括饑餓培養(yǎng)1.5-2.5h的步驟，饑餓培養(yǎng)時不流加任何碳源。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，流加甲醇水溶液時，在1-2h內(nèi)，甲醇水溶液流加速度為1.0-1.5ml·h^-1·l^-1，2h-3h時，甲醇水溶液流加速度1.5-2.5ml·h^-1·l^-1，3h后恒速流加，且恒速流加速度為2.5-3.0ml·h^-1·l^-1。在誘導(dǎo)初期的低流速流加控制，避免了過高的甲醇濃度對重組酵母的毒害作用，有利于甲醇利用酶系的合成并逐步提高菌體對甲醇的耐受能力。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45-55％的甘油和1.0-1.5％的ptm1。優(yōu)選的，甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，甲醇水溶液中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0-1.5％的ptm1。每100mlptm1微量鹽溶液中含有以下質(zhì)量百分比的各組分：0.008％nai，0.3％mnso4·h2o，0.6％cuso4·5h2o，0.02％na2moo4，0.002％硼酸，2％znso4·7h2o，0.05％cocl2，6.5％feso4·7h2o，5ml硫酸，0.02％生物素。

進(jìn)一步地，在步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)過程中溶氧為20％-30％。通過控制轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓維持溶氧。

進(jìn)一步地，耐熱賴氨酸氨肽酶的基因序列如seqidno.1所示。

進(jìn)一步地，在步驟(2)之后，還包括以下純化步驟：

(s1)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％-60％的硫酸銨對耐熱賴氨酸氨肽酶進(jìn)行鹽析，然后透析；

(s2)對透析得到的產(chǎn)物進(jìn)行陰離子交換層析；

(s3)濃縮、過濾層析得到的耐熱賴氨酸氨肽酶液，然后經(jīng)凝膠過濾層析。

進(jìn)一步地，在步驟(s2)中，采用hitrapqhp陰離子交換柱進(jìn)行陰離子交換層析。

進(jìn)一步地，在步驟(s2)中，陰離子交換層析時使用50mmtris-hcl緩沖液，其中，除雜時，緩沖液中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28％的nacl；洗脫目的蛋白時，緩沖液中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42％的nacl。

進(jìn)一步地，在步驟(s3)中，過濾時使用的膜的截留分子量為20-40kda。

進(jìn)一步地，在步驟(s3)中，采用superdextm7510/300gl過濾柱進(jìn)行凝膠過濾層析。

進(jìn)一步地，在步驟(s1)中，耐熱賴氨酸氨肽酶還可以為搖瓶發(fā)酵獲得的粗酶液。

粗酶液的制備方法包括以下步驟：將重組畢赤酵母的單菌落在bmgy培養(yǎng)基中230rpm下培養(yǎng)18h，然后轉(zhuǎn)入bmmy培養(yǎng)基中在25℃、ph＝5.0的條件下培養(yǎng)120h，每隔24h向培養(yǎng)液中添加終濃度1.5％的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，將得到的發(fā)酵液離心后，上清液即為賴氨酸氨肽酶粗酶液，其中重組畢赤酵母為含有來源于銅綠假單胞菌nj-814的賴氨酸氨肽酶基因的畢赤酵母菌，銅綠假單胞菌nj-814的保藏編號為cgmccno.7638，畢赤酵母菌為巴斯德畢赤酵母菌株gs115。

由于本發(fā)明涉及的耐熱賴氨酸氨肽酶的n端與c端掛組氨酸標(biāo)簽后，其活性會受到影響，因此采用上述方法進(jìn)行純化。

采用上述純化方法所制備的耐熱賴氨酸氨肽酶可水解酪蛋白，具體包括以下步驟：

將耐熱賴氨酸氨肽酶與堿性蛋白酶在80℃下協(xié)同水解酪蛋白，水解時間為3h，酪蛋白的濃度為10％，耐熱賴氨酸氨肽酶的添加量為90u/g。

進(jìn)一步地，每升bmgy培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量的各組分：蛋白胨20g，甘油10g，酵母膏10g，ynb(無氨基酵母氮源)，)13.4g，生物素0.4g，100mm磷酸鹽緩沖液(ph6.0)。

進(jìn)一步地，每升bmmy培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量的各組分：蛋白胨20g，甲醇10g，酵母膏10g，ynb13.4g，生物素0.4g，100mm磷酸鹽緩沖液(ph6.0)。

進(jìn)一步地，每升bsm培養(yǎng)基中包括以下質(zhì)量百分比的各組分：4％甘油，1.49％mgso4·7h2o，0.413％koh，1.82％k2so4，2.67％85％磷酸，0.093％caso4，0.435％ptm1。

進(jìn)一步地，每100mlptm1微量鹽溶液中含有以下質(zhì)量百分比的各組分：0.008％nai，0.3％mnso4·h2o，0.6％cuso4·5h2o，0.02％na2moo4，0.002％硼酸，2％znso4·7h2o，0.05％cocl2，6.5％feso4·7h2o，5ml硫酸，0.02％生物素。

本發(fā)明涉及的重組畢赤酵母由申請?zhí)枮?01510379603.1的中國專利所公開的方法所構(gòu)建。銅綠假單胞菌nj-814的保藏編號為cgmccno.7638保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.7638。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供了一種耐熱賴氨酸氨肽酶的發(fā)酵方法的高密度發(fā)酵方法，在有效解決該耐熱賴氨酸氨肽酶基因在細(xì)菌中無法高效表達(dá)的難題基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高賴氨酸氨肽酶產(chǎn)量；由于該酶上游構(gòu)建n端與c端掛組氨酸標(biāo)簽后活性受到影響，因此純化時不能用金屬螯合親和層析法，本發(fā)明采用經(jīng)反復(fù)優(yōu)化獲得的特定條件下的組合純化方案：分級鹽析—hitrapqhp離子交換層析—superdex75凝膠過濾層析，得到純化的酶，解決了上述難題，從而為研究耐熱賴氨酸氨肽酶的特性、構(gòu)效等提供了良好的基礎(chǔ)；本發(fā)明提供了耐熱賴氨酸氨肽酶在水解酪蛋白原料中的應(yīng)用，為進(jìn)一步拓寬該酶協(xié)同水解蛋白原料的研究建立了良好基礎(chǔ)。

本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)出的賴氨酸氨肽酶，不僅具有很好的遺傳穩(wěn)定性，且具有良好的溫度穩(wěn)定性，為氨肽酶的產(chǎn)業(yè)化和在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是甘油補(bǔ)料階段重組畢赤酵母的生長曲線；

圖2是賴氨酸氨肽酶的產(chǎn)量與甲醇誘導(dǎo)時間的關(guān)系曲線；

圖3是不同純化程度的酶的電泳圖；

圖4是純化后的賴氨酸氨肽酶的sds-page測試結(jié)果；

圖5是純化后的賴氨酸氨肽酶在不同溫度下的酶活測試結(jié)果；

圖6圖示了純化后的賴氨酸氨肽酶的溫度穩(wěn)定性結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

(1)本發(fā)明賴氨酸氨肽酶的酶活力測定方法如下：

以l-亮氨酸-對硝基苯胺為底物，加入2mlph＝9.0的tris-hcl緩沖液，取1ml稀釋酶液和1ml底物(底物濃度為2mm)，于80℃反應(yīng)10min，然后在405nm處測定吸光值，計算酶活力。其中，賴氨酸氨肽酶的酶活是指：在一定條件下，其每分鐘分解l-賴氨酸-對硝基苯胺產(chǎn)生1μm的對硝基苯胺所需要的酶量，即為一個酶活單位，計算公式如下：

其中abs為405nm處吸光值。

(2)本發(fā)明菌體濕重測定方法：精確吸取1ml菌液于已稱重的2mlep管中，高速離心5min后棄去上清，所得重量減去空離心管重量為酵母濕重(單位為g·ml^-1)。

(3)本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基涉及以下幾種：

md培養(yǎng)基(g/l.h):葡萄糖20，瓊脂20，ynb13.4，生物素0.4；

mm培養(yǎng)基(g/l):甲醇5ml/l，瓊脂20，ynb13.4，生物素0.4；

bmgy培養(yǎng)基(g/l):蛋白胨20，甘油10，酵母膏10，ynb13.4，生物素0.4，100mm磷酸鹽緩沖液ph6.0；

bmmy培養(yǎng)基(g/l):蛋白胨20，甲醇10，酵母膏10，ynb13.4，生物素0.4，100mm磷酸鹽緩沖液ph6.0；

bsm上罐培養(yǎng)基：4％甘油，1.49％mgso4·7h2o，0.413％koh，1.82％k2so4，2.67％85％磷酸，0.093％caso4，0.435％ptm1。

甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基：50％甘油，1.2％ptm1。

ptm1微量鹽溶液(100ml)：0.008％nai，0.3％mnso4·h2o，0.6％cuso4·5h2o，0.02％na2moo4，0.002％硼酸，2％znso4·7h2o，0.05％cocl2，6.5％feso4·7h2o，5ml硫酸，0.02％生物素，微孔濾膜過濾，4℃保存。

本發(fā)明使用的菌株包括：大腸桿菌e.colijm109、畢赤酵母gs115、申請?zhí)枮?01510379603.1的中國專利所公開的方法構(gòu)建重組畢赤酵母菌。

實(shí)施例1耐熱賴氨酸氨肽酶的高密度發(fā)酵

采用重組畢赤酵母菌作為發(fā)酵菌株，具體發(fā)酵方法如下：

(1)挑取活化的重組畢赤酵母到25ml的bmgy搖瓶中(共培養(yǎng)18瓶)，于30℃、230r·min^-1的搖床中培養(yǎng)20h，所得發(fā)酵液即為上罐種子液。

(2)將裝有4lbsm培養(yǎng)基的7l發(fā)酵罐滅菌處理，待儀器連接后，泵流加氨水至ph電極的顯示值為5.0，控制初始轉(zhuǎn)速為500r·min^-1，通氣量為2vvm，發(fā)酵溫度為30℃。分批加入17.4ml過膜除菌的ptm1溶液和種子液，種子液按10％接種量接種至發(fā)酵罐中，校準(zhǔn)溶氧電極。通過控制轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓維持溶氧在20％以上。

(3)do值是反映酵母生長的重要參數(shù)，do值開始極速上升表明發(fā)酵液中的甘油已消耗完全，此時需要補(bǔ)加甘油來獲得更多的菌體。此階段流加含12ml·l^-1ptm1的甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基，其中甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％，甘油補(bǔ)料培養(yǎng)基流加速度為18.15ml·h^-1·l^-1，定期取樣測各參數(shù)。

(4)當(dāng)od600達(dá)到400后，立即停止甘油補(bǔ)料，然后饑餓培養(yǎng)2h。酵母只在無甘油的培養(yǎng)基中代謝甲醇，所以待溶氧急速上升時，需饑餓培養(yǎng)一段時間以耗盡甘油。

(5)當(dāng)甘油耗盡后，加甲醇水溶液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。開始甲醇誘導(dǎo)時，調(diào)節(jié)溫度為28℃，以泵流加方式加入含12ml·l^-1的ptm1的甲醇溶液。設(shè)置初始2h內(nèi)的甲醇流加速度為1ml·h^-1·l^-1，隨后通過空氣泵逐漸提高甲醇流加速度，3h內(nèi)甲醇流加速度達(dá)到3ml·h^-1·l^-1，此后以該流加速度繼續(xù)流加甲醇。甲醇誘導(dǎo)階段每隔12h取樣，測發(fā)酵液od600、菌體濕重、氨肽酶酶活以及蛋白含量，當(dāng)酶活下降時(流加甲醇后84h)停止發(fā)酵培養(yǎng)。

圖1是甘油補(bǔ)料階段重組畢赤酵母的生長曲線，如圖1所示，在甘油補(bǔ)料過程中，發(fā)酵液od600、菌體濕重以及蛋白含量均保持上升。圖2是賴氨酸氨肽酶的產(chǎn)量與甲醇誘導(dǎo)時間的關(guān)系曲線，圖2表明，當(dāng)初始誘導(dǎo)菌體量od600為400時，誘導(dǎo)84h后上清液氨肽酶酶活達(dá)到最高，其為7.8u·ml^-1，是搖瓶產(chǎn)酶水平的2.14倍。

對上述獲得的耐熱賴氨酸氨肽酶進(jìn)行純化，選擇40％-60％的硫酸銨進(jìn)行鹽析后過夜透析。然后收集透析液，使透析液經(jīng)過hitrapqhp陰離子交換層析，用含有nacl的50mm的tris-hcl緩沖液((ph8.5)進(jìn)行洗脫，首先使用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28％的nacl的緩沖液進(jìn)行除雜，然后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42％的nacl緩沖液洗脫目的蛋白；收集酶活最高的洗脫峰，然后利用30kda超濾管濃縮，過膜后使用superdextm7510/300gl凝膠過濾層析進(jìn)一步分離純化，得到純化后的耐熱賴氨酸氨肽酶。

實(shí)施例2耐熱賴氨酸氨肽酶的純化及性質(zhì)研究

采用申請?zhí)枮?01510379603.1的中國專利所公開的方法構(gòu)建重組畢赤酵母菌，將重組畢赤酵母菌單菌落在bmgy培養(yǎng)基中230rpm震蕩18h，積累菌體后于25mlbmmy(ph＝5.0)培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)120h，每隔24h向培養(yǎng)液中添加終濃度1.5％的甲醇進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)。將獲得的發(fā)酵液在10000rpm條件下離心5min，上清即為耐熱賴氨酸氨肽酶粗酶液。

將上述粗酶液以10％的梯度進(jìn)行硫酸銨分級鹽析，并檢測每步殘留酶活，最終選擇40％-60％的硫酸銨進(jìn)行鹽析后過夜透析。然后收集透析液，使透析液經(jīng)過hitrapqhp陰離子交換層析，用含有nacl的50mm的tris-hcl緩沖液((ph8.5)進(jìn)行洗脫，首先使用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28％的nacl的緩沖液進(jìn)行除雜，然后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42％的nacl緩沖液洗脫目的蛋白；收集酶活最高的洗脫峰，然后利用30kda超濾管濃縮，過膜后使用superdextm7510/300gl凝膠過濾層析進(jìn)一步分離純化，得到純化后的耐熱賴氨酸氨肽酶。其比酶活達(dá)36.42u/mg，純化倍數(shù)達(dá)3.95，純化結(jié)果見圖3。圖3是不同純化程度的酶的電泳圖，其中，圖中m代表marker(標(biāo)記)；圖中1對應(yīng)凝膠過濾層析后的電泳結(jié)果；圖中2對應(yīng)hitrapqhp陰離子交換層析后的電泳結(jié)果；圖中3對應(yīng)原始發(fā)酵液，圖中4代表硫酸銨鹽析后的電泳結(jié)果。從圖中看出，采用組合分離手段，其純化程度大大提高。

表1是耐熱賴氨酸氨肽酶的純化結(jié)果，表1表明，經(jīng)過鹽析、hitapqhp柱層析及superdex75柱層析純化后，比酶活從粗酶液的9.21提高到36.41，純化倍數(shù)達(dá)3.95倍。其中鹽析及q柱除去了大量雜蛋白，而凝膠柱superdex75對賴氨酸氨肽酶起了精制作用。

表1耐熱賴氨酸氨肽酶的純化結(jié)果

將上述純化后的賴氨酸氨肽酶與去糖基化酶endohf混合，37℃恒溫加熱4h。加熱變性后，取樣進(jìn)行sds-page測試，結(jié)果如圖4所示，從圖4中可看到大的蛋白條帶消失，只存在小的蛋白條帶，說明該酶發(fā)生了部分糖基化。

將上述純化后的賴氨酸氨肽酶置于不同溫度下進(jìn)行酶活測定，并將酶液在不同溫度(30℃、60℃、70℃、80℃)下分別保溫1h、2h和3h，檢測殘留酶活，將測得的最高酶活定義為100％，其他酶活占最高酶活的百分比為相對酶活，結(jié)果如圖5-6，圖5表明，在80℃下，賴氨酸氨肽酶的酶活最高，隨著溫度的升高，其酶活逐漸增大，溫度高于80℃后，其酶活略有下降，說明其最適溫度為80℃。從圖6可看出，該氨肽酶在50℃-70℃保留2h時，殘留酶活在80％以上，說明該重組氨肽酶在70℃以下依然具有良好的穩(wěn)定性。與原始菌產(chǎn)酶相比，采用去糖基化酶水解和電泳分析驗(yàn)證該賴氨酸氨肽酶，可發(fā)生部分的糖基化，雖沒有進(jìn)一步提高其溫度穩(wěn)定性，但對其正確折疊及胞外分泌的高效表達(dá)有一定的幫助。

實(shí)施例3耐熱賴氨酸氨肽酶的酶解應(yīng)用

用50mmph＝9.0的tris-hcl溶液配制10％的酪蛋白溶液，添加3000u·g^-1(e/s)的堿性蛋白酶粉末，50℃反應(yīng)3h，沸水浴15min，冷卻。加入90u·g^-1的耐熱賴氨酸氨肽酶，80℃恒溫震蕩3h，沸水浴10min，12000r·min^-1條件下離心取上清，然后測水解產(chǎn)物的多肽分布。將上清液與10％三氯乙酸1:1混合，靜置1h，15000r·min^-1離心后取上清，測氨基酸含量。結(jié)果見表2-3。

表2是水解產(chǎn)物的多肽分布測試結(jié)果，從表中可看出，雙酶水解液(即同時使用耐熱賴氨酸氨肽酶和堿性蛋白酶)中180da以下的多肽含量明顯增加，進(jìn)一步比較雙酶協(xié)同以及單獨(dú)使用內(nèi)切堿性蛋白酶的兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)該酶的另外一個水解特點(diǎn)，即在有內(nèi)切酶存在時，該酶會優(yōu)先水解賴氨酸再水解亮氨酸，使用耐熱賴氨酸氨肽酶和堿性蛋白酶的協(xié)同水解和使用內(nèi)切酶單獨(dú)水解的結(jié)果相比，前者的亮氨酸提高幅度為2.5倍，而賴氨酸含量則提高了8倍，這種協(xié)同水解的規(guī)律和特點(diǎn)給今后特定蛋白原料水解的選擇提供了依據(jù)。

表2水解產(chǎn)物的多肽分布測試結(jié)果

表3是水解產(chǎn)物的氨基酸含量測試結(jié)果，結(jié)果表明水解液中總氨基酸含量大幅度提高且其中的賴氨酸和亮氨酸含量提高比例最大，符合該酶的水解特色。與不加酶的空白對照(未酶解)相比，使用氨肽酶、堿性蛋白酶、雙酶水解液中的游離氨基酸總量均顯著增加，分別為空白對照的10.5倍、22.5倍和65倍。

表3水解產(chǎn)物的氨基酸含量測試結(jié)果

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>耐熱賴氨酸氨肽酶的發(fā)酵方法

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1500

<212>dna

<213>賴氨酸氨肽酶基因序列

<400>1

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