本發(fā)明屬于海藻多糖的提取技術領域，具體地，涉及一種d-海藻糖提純工藝。
背景技術：
海藻糖，也即d-海藻糖，是一種安全、可靠的天然糖類，1832年由wiggers將其從黑麥的麥角菌中首次提取出來，隨后的研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在自然界中許多食用動、植物及微生物體內(nèi)都廣泛存在，如人們?nèi)粘Ｉ钪惺秤玫哪⒐郊S、海藻類、豆類蝦、面包、啤酒廈酵母發(fā)酵食品中都有含量較高的海藻糖。
海藻糖具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抑制補體激活及吸收重金屬等功能，另外，因具有安全，可靠，環(huán)保的特性，將其用于獸藥的生產(chǎn)具有較高的市場前景。
在現(xiàn)有技術中，一般采用真空熱濃縮方法提取濃縮蕨麻多糖，該方法容易使蕨麻多糖的抗氧化活性降低，降低其的藥用價值，另外，現(xiàn)有的方法中僅對蕨麻多糖進行粗提純，提純出的粗蕨麻多糖內(nèi)含雜質(zhì)較多，不利于海藻糖的開發(fā)應用。
目前海藻糖制備方法主要有微生物抽提法、發(fā)酵法等。
微生物抽提法成本高，提取源有限，很大程度制約著海藻糖大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)酵法轉化率低，發(fā)酵液成分復雜，海藻糖的提取、精制困難，因而對降低生產(chǎn)成本、促進推廣應用等方面很不利。
cn200610016527.9公開了一種海藻糖的分離純化方法，具體步驟是：向每克海藻糖酶反應液中加入0.14-0.28個糖化酶單位，在50-60℃、ph3.5-5.5條件下水解6-12h，再向糖化酶酶解液中接種3-10%重量的釀酒酵母，在25-30℃，ph5.5-7.5條件下培養(yǎng)6-16h，鈍化后發(fā)酵液離心、超濾、離子交換、濃縮、結晶干燥得到海藻糖。但此法周期過長、海藻糖收率不高、后期發(fā)酵液中成分比較復雜，分離也有一定難度，不適合工業(yè)生產(chǎn)。
因此，如何發(fā)展一種可改善上述技術缺陷的褐藻糖膠提取方法，為相關技術領域急需解決的問題。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種d-海藻糖提純工藝。
本發(fā)明提供的一種d-海藻糖提純工藝，解決了現(xiàn)有技術中的方法提取的d-海藻糖純度低，d-海藻糖提取率低的問題。
根據(jù)本發(fā)明提供的一種d-海藻糖提純工藝，包括如下步驟：
步驟（1）：取新鮮海帶清洗3-5次，瀝干，切碎，用6-8倍于海帶重量的去離子水室溫浸泡1-2天，浸泡完成后進行打漿處理，制得漿液；
步驟（2）：向漿液中加入酸性纖維素酶，置于40-54℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在4.5-6.5之間，酶解過程中不停攪拌；
步驟（3）：加入堿性果膠酶，置于50-65℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在8.0-10.0之間，酶解過程中不停攪拌；
步驟（4）：離心機離心除雜，得到酶解液；
步驟（5）：將酶解液通過超濾膜進行超濾處理，酶解液依次經(jīng)過截留分子量為300的超濾膜及截留分子量為400的超濾膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提純?nèi)芤海?/p>
步驟（6）：將d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇混合進行脫水，使d-海藻糖從溶液中完全析出；
步驟（7）：使d-海藻糖從d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的混合溶液中完全分離出來；
步驟（8）：干燥得到提純的d-海藻糖。
優(yōu)選地，所述步驟（5）在進行超濾處理前，將所述超濾膜先用氫氧化鈉溶液清洗，再用清水進行清洗，使所述超濾膜的ph值達到7.0-7.4。
優(yōu)選地，所述步驟（7）中所述d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的體積比為1：4-5。
優(yōu)選地，所述步驟（4）中離心機轉速為1000-1200r/min，離心時間為20-30min。
優(yōu)選地，所述超濾處理過程中使用的過濾膜為聚偏氟乙烯濾膜。
優(yōu)選地，所述酸性纖維素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
優(yōu)選地，所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纖維素酶的方法為先將里氏木霉a3進行紫外線和亞硝基胍復合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，在30℃條件下培養(yǎng)5-8天，在15℃條件下放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到里氏木霉91-3菌株。
優(yōu)選地，所述步驟（8）干燥溫度為60-80℃。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
（1）本發(fā)明的特色包括兩個部分，一方面是在海藻糖從海帶細胞壁中釋放階段，本發(fā)明用酸性纖維素酶和堿性果膠酶對細胞壁進行離散，由于酶具有單一性，纖維素酶和果膠酶可以將細胞壁的主要組成成分纖維素和果膠質(zhì)分解，從而將細胞壁破壞，使其中的海藻糖釋放出來，在這個過程中由于本發(fā)明選擇在酸性纖維素酶和堿性果膠酶最適的ph條件和溫度條件進行，兩種酶的活性達到最大，結果使纖維素和果膠質(zhì)分解徹底，細胞壁離散完全，最終使海藻糖充分釋放；另一方面，由于海帶細胞壁中除了還有海藻糖外還含有其他糖類、蛋白質(zhì)、無機物等成分，因此必須要進行更進一步的分離才可獲得純度較高的海藻糖，海藻糖的分子量為320，因此本發(fā)明使用超濾方法，采用不同的超濾膜，較準確地將海藻糖分離出來。采用本發(fā)明的提純工藝可使提純率較一般的提純方法提高4到7個百分點；
（2）本發(fā)明未使用強酸、強堿及有毒的有機溶劑，做到了清潔環(huán)保，且本發(fā)明方法中所產(chǎn)生的廢棄液和廢渣可用來生產(chǎn)酵母膏，幾乎無排放；
（3）本發(fā)明提取的d-海藻糖具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抑制補體激活及吸收重金屬等作用，因此可用于獸藥的制備。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明提供的一種d-海藻糖提純工藝，解決了現(xiàn)有技術中的方法提取的d-海藻糖純度低，d-海藻糖提取率低的問題。
根據(jù)本發(fā)明提供的一種d-海藻糖提純工藝，包括如下步驟：
步驟（1）：取新鮮海帶清洗3-5次，瀝干，切碎，用6-8倍于海帶重量的去離子水室溫浸泡1-2天，浸泡完成后進行打漿處理，制得漿液。其中浸泡的目的是為了使海帶細胞膨脹，使細胞壁中的各種成分處于活躍狀態(tài)，利于酶解反應和分離提純；
步驟（2）：向漿液中加入酸性纖維素酶，置于40-54℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在4.5-6.5之間，酶解過程中不停攪拌。由于ph控制在4.5-6.5之間，溫度控制在40-54℃的時候，酸性纖維素酶的活性最高，因此酶解效果也是最好的，可將細胞壁中含有的纖維素酶解，從而破壞細胞壁，而使其中的褐藻糖膠釋放出來；
步驟（3）：加入堿性果膠酶，置于50-65℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在8.0-10.0之間，酶解過程中不停攪拌，由于ph控制在8.0-10.0之間，溫度控制在50-65℃的時候，果膠酶的活性最高，因此酶解效果也是最好的，可將細胞壁中含有的果膠質(zhì)酶解，從而破壞細胞壁，而使其中的褐藻糖膠釋放出來；
步驟（4）：離心機離心除雜，得到酶解液；
步驟（5）：將酶解液通過超濾膜進行超濾處理，酶解液依次經(jīng)過截留分子量為300的超濾膜及截留分子量為400的超濾膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提純?nèi)芤海?/p>
步驟（6）：將d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇混合進行脫水，使d-海藻糖從溶液中完全析出；
步驟（7）：使d-海藻糖從d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的混合溶液中分離出來；
步驟（8）：干燥得到提純的d-海藻糖。
優(yōu)選地，所述步驟（5）在進行超濾處理前，將所述超濾膜先用氫氧化鈉溶液清洗，再用清水進行清洗，使所述超濾膜的ph值達到7.0-7.4。
優(yōu)選地，所述步驟（7）中所述d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的體積比為1：4-5。
優(yōu)選地，所述步驟（4）中離心機轉速為1000-1200r/min，離心時間為20-30min。
優(yōu)選地，所述超濾處理過程中使用的過濾膜為聚偏氟乙烯濾膜。
優(yōu)選地，所述酸性纖維素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
優(yōu)選地，所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纖維素酶的方法為先將里氏木霉a3進行紫外線和亞硝基胍復合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，在30℃條件下培養(yǎng)5-8天，在15℃條件下放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到產(chǎn)纖維素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。
優(yōu)選地，所述步驟（8）干燥溫度為60-80℃。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
（1）本發(fā)明的特色包括兩個部分，一方面是在海藻糖從海帶細胞壁中釋放階段，本發(fā)明用酸性纖維素酶和堿性果膠酶對細胞壁進行離散，由于酶具有單一性，纖維素酶和果膠酶可以將細胞壁的主要組成成分纖維素和果膠質(zhì)分解，從而將細胞壁破壞，使其中的海藻糖釋放出來，在這個過程中由于本發(fā)明選擇在酸性纖維素酶和堿性果膠酶最適的ph條件和溫度條件進行，兩種酶的活性達到最大，結果使纖維素和果膠質(zhì)分解徹底，細胞壁離散完全，最終使海藻糖充分釋放；另一方面，由于海帶細胞壁中除了還有海藻糖外還含有其他糖類、蛋白質(zhì)、無機物等成分，因此必須要進行更進一步的分離才可獲得純度較高的海藻糖，海藻糖的分子量為320，因此本發(fā)明使用超濾方法，采用不同的超濾膜，較準確地將海藻糖分離出來。采用本發(fā)明的提純工藝可使提純率較一般的提純方法提高4到7個百分點；
（2）本發(fā)明未使用強酸、強堿及有毒的有機溶劑，做到了清潔環(huán)保，且本發(fā)明方法中所產(chǎn)生的廢棄液和廢渣可用來生產(chǎn)酵母膏，幾乎無排放；
（3）本發(fā)明提取的d-海藻糖具有抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抑制補體激活及吸收重金屬等作用，因此可用于獸藥的制備。
實施例1
本實施例提供的一種d-海藻糖提純工藝，包括如下步驟：
步驟（1）：取新鮮海帶清洗5次，瀝干，切碎，用6倍于海帶重量的去離子水室溫浸泡2天，浸泡完成后進行打漿處理，制得漿液；
步驟（2）：向漿液中加入酸性纖維素酶，置于40℃的水浴中酶解6h，ph控制在4.5，酶解過程中不停攪拌；
步驟（3）：加入堿性果膠酶，置于65℃的水浴中酶解2h，ph控制在10.0，酶解過程中不停攪拌；
步驟（4）：離心機離心除雜，得到酶解液；
步驟（5）：將酶解液通過超濾膜進行超濾處理，酶解液依次經(jīng)過截留分子量為300的超濾膜及截留分子量為400的超濾膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提純?nèi)芤海?/p>
步驟（6）：將d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇混合進行脫水，使d-海藻糖從溶液中完全析出；
步驟（7）：使d-海藻糖從d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的混合溶液中分離出來；
步驟（8）：干燥得到提純的d-海藻糖。
所述步驟（5）在進行超濾處理前，將所述超濾膜先用氫氧化鈉溶液清洗，再用清水進行清洗，使所述超濾膜的ph值達到7.0。
所述步驟（7）中所述d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的體積比為1：5。
所述步驟（4）中離心機轉速為1000r/min，離心時間為30min。
所述超濾處理過程中使用的過濾膜為聚偏氟乙烯濾膜。
所述酸性纖維素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纖維素酶的方法為先將里氏木霉a3進行紫外線和亞硝基胍復合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，在30℃條件下培養(yǎng)8天，在15℃條件下放置7天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到里氏木霉91-3菌株。
所述步驟（8）干燥溫度為80℃。
本實施例的提純工藝可使提純率較一般的提純方法提高5個百分點。
實施例2
本實施例提供的一種d-海藻糖提純工藝，包括如下步驟：
步驟（1）：取新鮮海帶清洗3次，瀝干，切碎，用8倍于海帶重量的去離子水室溫浸泡1天，浸泡完成后進行打漿處理，制得漿液；
步驟（2）：向漿液中加入酸性纖維素酶，置于54℃的水浴中酶解2h，ph控制在6.5，酶解過程中不停攪拌；
步驟（3）：加入堿性果膠酶，置于50℃的水浴中酶解6h，ph控制在8.0，酶解過程中不停攪拌；
步驟（4）：離心機離心除雜，得到酶解液；
步驟（5）：將酶解液通過超濾膜進行超濾處理，酶解液依次經(jīng)過截留分子量為300的超濾膜及截留分子量為400的超濾膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提純?nèi)芤海?/p>
步驟（6）：將d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇混合進行脫水，使d-海藻糖從溶液中完全析出；
步驟（7）：使d-海藻糖從d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的混合溶液中分離出來；
步驟（8）：干燥得到提純的d-海藻糖。
所述步驟（5）在進行超濾處理前，將所述超濾膜先用氫氧化鈉溶液清洗，再用清水進行清洗，使所述超濾膜的ph值達到7.0。
所述步驟（7）中所述d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的體積比為1：4。
所述步驟（4）中離心機轉速為1200r/min，離心時間為20min。
所述超濾處理過程中使用的過濾膜為聚偏氟乙烯濾膜。
所述酸性纖維素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纖維素酶的方法為先將里氏木霉a3進行紫外線和亞硝基胍復合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，在30℃條件下培養(yǎng)5天，在15℃條件下放置10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到里氏木霉91-3菌株。
所述步驟（8）干燥溫度為60℃。
本實施例的提純工藝可使提純率較一般的提純方法提高7個百分點。
實施例3
本實施例提供的一種d-海藻糖提純工藝，包括如下步驟：
步驟（1）：取新鮮海帶清洗4次，瀝干，切碎，用7倍于海帶重量的去離子水室溫浸泡1天，浸泡完成后進行打漿處理，制得漿液；
步驟（2）：向漿液中加入酸性纖維素酶，置于45℃的水浴中酶解4h，ph控制在5.0，酶解過程中不停攪拌；
步驟（3）：加入堿性果膠酶，置于55℃的水浴中酶解4h，ph控制在9.0，酶解過程中不停攪拌；
步驟（4）：離心機離心除雜，得到酶解液；
步驟（5）：將酶解液通過超濾膜進行超濾處理，酶解液依次經(jīng)過截留分子量為300的超濾膜及截留分子量為400的超濾膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提純?nèi)芤海?/p>
步驟（6）：將d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇混合進行脫水，使d-海藻糖從溶液中完全析出；
步驟（7）：使d-海藻糖從d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的混合溶液中分離出來；
步驟（8）：干燥得到提純的d-海藻糖。
所述步驟（5）在進行超濾處理前，將所述超濾膜先用氫氧化鈉溶液清洗，再用清水進行清洗，使所述超濾膜的ph值達到7.2。
所述步驟（7）中所述d-海藻糖提純?nèi)芤号c無水乙醇的體積比為1：4。
所述步驟（4）中離心機轉速為1100r/min，離心時間為25min。
所述超濾處理過程中使用的過濾膜為聚偏氟乙烯濾膜。
所述酸性纖維素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纖維素酶的方法為先將里氏木霉a3進行紫外線和亞硝基胍復合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，在30℃條件下培養(yǎng)6天，在15℃條件下放置8天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到里氏木霉91-3菌株。
所述步驟（8）干燥溫度為70℃。
本實施例的提純工藝可使提純率較一般的提純方法提高4個百分點。
以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。