一步法快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫的方法與流程

本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種一步法快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫的方法。
背景技術(shù)：
：下一代測(cè)序(next-generationsequencing，NGS)由于高通量、高靈敏度、高度自動(dòng)化等特性，近年來在疾病的研究和診斷治療中越來越多地被應(yīng)用。NGS技術(shù)能實(shí)現(xiàn)多基因平行檢測(cè)，比傳統(tǒng)檢測(cè)方法節(jié)省樣本，且靈敏度更高，能更真實(shí)還原腫瘤變異全景。但LifeNGS平臺(tái)中傳統(tǒng)的構(gòu)建擴(kuò)增子文庫的方法步驟繁瑣，需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增、消化、加接頭、純化等步驟，需要花費(fèi)約5h；并且由于多步驟操作中需要開蓋，因此文庫易被污染，文庫損失率高；另外在傳統(tǒng)的構(gòu)建擴(kuò)增子文庫的方法中，單個(gè)樣品建立文庫的成本較高，為200-1000元/例。公開于該
背景技術(shù)：
部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種一步法快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫的方法。該方法可以簡(jiǎn)便、快速的經(jīng)1步PCR構(gòu)建擴(kuò)增子文庫，且由于在PCR起始前就引入barcode，使得樣本及文庫間交叉污染的可能性大大降低，并能簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地分區(qū)的要求，該方法還能將單個(gè)樣品建立文庫的成本控制在30元/例。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：一種用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法，包括以下步驟：1、合成用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合，所述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合包括：根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物，所述上游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第一接頭序列(Bridge序列)和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列；根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物，所述下游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第二接頭序列(trP1序列)和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列；上游通用引物，所述上游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第三接頭序列(A序列)、barcode序列和第一接頭序列；和下游通用引物，所述下游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的通用序列(Uni序列)和第二接頭序列；2、構(gòu)建DNA樣品的PCR反應(yīng)體系,將根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物、上游通用引物和下游通用引物混合以作為PCR反應(yīng)體系中的引物組合；3、進(jìn)行PCR。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述第一接頭序列包括SEQID:1序列，SEQID:1序列的核苷酸序列為GGCATACGTCCTCGTCTA。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述第二接頭序列包括SEQID:2序列，SEQID:2序列的核苷酸序列為TCTATGGGCAGTCGGTGAT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述第三接頭序列包括SEQID:3序列，SEQID:3序列的核苷酸序列為CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述通用序列包括SEQID:4序列，SEQID:4序列的核苷酸序列為CCACTACGCCTCCGCTTTCCTC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，用于構(gòu)建同一個(gè)DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合中，上游通用引物中的barcode序列相同；用于構(gòu)建不同DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合中，上游通用引物中的barcode序列不同。barcode序列是與樣品相對(duì)應(yīng)的，不同樣品之間的barcode序列不同，只要能區(qū)分不同樣品就可以，因此barcode序列不是特異性的，其序列可以變動(dòng)。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)任意一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)任意一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物、上游通用引物和下游通用引物的濃度均為100μM。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，當(dāng)同一個(gè)PCR反應(yīng)中的目標(biāo)擴(kuò)增子的數(shù)量＞1時(shí)，所述根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物為根據(jù)每一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物的組合，所述根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物為根據(jù)每一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物的組合。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)任意一種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物和根據(jù)該目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物的摩爾比為1:1；所述上游通用引物和下游通用引物的摩爾比為1:1。上游通用引物和下游通用引物的具體用量要根據(jù)PCR擴(kuò)增時(shí)目標(biāo)擴(kuò)增子的數(shù)量進(jìn)行調(diào)整，如：PCR擴(kuò)增時(shí)，需擴(kuò)增5種目標(biāo)擴(kuò)增子和需擴(kuò)增22種目標(biāo)擴(kuò)增子時(shí)，上游通用引物和下游通用引物的具體用量可能不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段確定上游通用引物和下游通用引物的具體用量。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述DNA樣品為基因組DNA。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，基因組DNA提取自組織樣本或福爾馬林固定石蠟包埋樣本。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述目標(biāo)擴(kuò)增子包括選自下組22種目標(biāo)擴(kuò)增子中的至少一個(gè)：ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:5所示：TAAGGGACAAGCAGCCACACCCCATTCTTGAGGGGCTGAGGTGGAAGAGACAGGCCCGGAGGGGTGAGGCAGTCTTTACTCACCTGTAGATGTCTCGGGCCATCCCGAAGTCTCCAATCTTGGCCACTCTTCCAGGGCCTGGACAGGTCAAGAGGCAGT；ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:6所示：CGGAGGAAGGACTTGAGGTCTCCCCCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACCGGGGCAGGGATTGCAGGCTCACCCCAATGCAGCGAACAATGTTCTGGTGGTTGAATTTGCTGCAGAGCAGAGAGGGATGTAACCAAAATTAACTGAGCTGAGTCTGG；BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:7所示：CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAG；EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:8所示：TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGG；EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:9所示：ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGT；EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:10所示：GAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACAC；EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:11所示：CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTA；ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:12所示：CATACCCTCTCAGCGTACCCTTGTCCCCAGGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCG；KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:13所示：AGTCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTGTCGAGAATATCCAAGAGACAGGTTTCTCCATCAATTACTACTTGCTTCCTGTAGGAATCCTGAGAAGGGAGAAACACAGTCTGGATTATTACAGTGCA；KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:14所示：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTT；MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:15所示：TCGATCTGCCATGTGTGCATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATTTTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGGTAAGTCACATCAGTTCCC；MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:16所示：CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGCTCTTTCTTTCTCTCTGTTTTAAGATCTGGGCAGTGAATTAGTTCGCTACGATGCAAGAGTACACACTCCTCATTTGGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGTAAGCCCAACTACAGAAATGGTTTCAAATGAATCTGTAGACTACCGAGCT；MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:17所示：ATGTTACGCAGTGCTAACCAAGTTCTTTCTTTTGCACAGGGCATTTTGGTTGTGTATATCATGGGACTTTGTTGGACAATGATGGCAAGAAAATTCACTGTGCTGTGAAATCCTTGAACAGTAAGTGGCATTTTATTTAACCATGGAGTATACTTTTGTGGTTTGCAAC；MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:18所示：CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTCTTGCCAGAGACATGTATGATAAAGAATACTATAGTGTACACAACAAAACAGGTGCAAAGCTGCCAGTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAGTCTGCAAACTCAAAAGTTTACCACCAAGTCAGATGTG；NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:19所示：TTCGCCTGTCCTCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATCCAGTATGTCCAACAAACAGGTTTCACCATCTATAACCACTTGTTTTCTGTAAGAATCCTGGGGGTG；NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:20所示：TGAGAGACAGGATCAGGTCAGCGGGCTACCACTGGGCCTCACCTCTATGGTGGGATCATATTCATCTACAAAGTGGTTCTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCACCTGCTCCAACCACCACCAGTTTGTACTCAG；PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:21所示：GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAGATTCTCTGTTTCTTTTTCTTTATTACAGAAAAAATAACTGAATTTGGCTGATCTCAGCATGTT；PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:22所示：ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGACATTGCATACATTCGAAAGACCCTAGCCTTAGATAAAACTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAAAAATGGATTG；TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:23所示：CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGGCAGCTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTACTCAGGATAGGAAAAGAG；TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:24所示：GCAAGTGGCTCCTGACCTGGAGTCTTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTAGGAGATAACACAGGCCCAAGA；TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:25所示：CCCCAGTTGCAAACCAGACCTCAGGCGGCTCATAGGGCACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAAATTTCCTTCCACTCGGATAAGATGCTGAGGAGGGGCCAGACCTAAGAGCAATCAGTGAGGAATCAGAGG；TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:26所示：ACCATCGCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGCGCCTCACAACCTCCGTCATGTGCTGTGACTGCTTGTAGATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGGGGGTGTGGAATCAACCCACAGCTGCACAGGGCAGGTCTTGGCCAGTTGGCAAAACATCTTGTTGAGGGCAGGGGAGTACTG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:27所示：ACTGCCTCTTGACCTGTCC；根據(jù)ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:28所示：TAAGGGACAAGCAGCCACAC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:29所示：CCAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGG；根據(jù)ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:30所示：CGGAGGAAGGACTTGAGGT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:31所示：CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTC；根據(jù)BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:32所示：CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:33所示：TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTG；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:34所示：CCAGGGACCTTACCTTATACACC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:35所示：ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCC；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:36所示：ACACAGCAAAGCAGAAACTCAC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:37所示：GAAGCCACACTGACGTGC；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:38所示：GTGTTCCCGGACATAGTCCAG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:39所示：CCGCAGCATGTCAAGATCACA；根據(jù)EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:40所示：TAAACAATACAGCTAGTGGGAAGGC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:41所示：CATACCCTCTCAGCGTACCC；根據(jù)ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:42所示：CGGACATGGTCTAAGAGGCAG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:43所示：TGCACTGTAATAATCCAGACTGTGT；根據(jù)KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:44所示：AGTCCTCATGTACTGGTCCCTC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:45所示：AAGGCCTGCTGAAAATGACTGA；根據(jù)KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:46所示：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTA。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:47所示：TCGATCTGCCATGTGTGCATT；根據(jù)MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:48所示：GGGAACTGATGTGACTTACCCT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:49所示：CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGC；根據(jù)MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:50所示：AGCTCGGTAGTCTACAGATTCATTT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:51所示：ATGTTACGCAGTGCTAACCAAG；根據(jù)MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:52所示：GTTGCAAACCACAAAAGTATACTCCA。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:53所示：CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTC；根據(jù)MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:54所示：CACATCTGACTTGGTGGTAAACTT。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:55所示：CACCCCCAGGATTCTTACAGAAAA；根據(jù)NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:56所示：TTCGCCTGTCCTCATGTATTGG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:57所示：CTGAGTACAAACTGGTGGTGGT；根據(jù)NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:58所示：TGAGAGACAGGATCAGGTCAGC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:59所示：GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAG；根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:60所示：AACATGCTGAGATCAGCCAAATTC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:61所示：ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGAC；根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:62所示：CAATCCATTTTTGTTGTCCAGCC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:63所示：CTCTTTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATC；根據(jù)TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:64所示：CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:65所示：TCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTAG；根據(jù)TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:66所示：GCAAGTGGCTCCTGACCTG。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:67所示：CCTCTGATTCCTCACTGATTGCTC；根據(jù)TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:68所示：CCCCAGTTGCAAACCAGAC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列如SEQID:69所示：CAGTACTCCCCTGCCCTCAA；根據(jù)TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列如SEQID:70所示：ACCATCGCTATCTGAGCAGC。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述目標(biāo)擴(kuò)增子為以下22種：ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:5所示；ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:6所示；BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:7所示；EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:8所示；EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:9所示；EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:10所示；EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:11所示；ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:12所示；KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:13所示；KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:14所示；MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:15所示；MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:16所示；MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:17所示；MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:18所示；NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:19所示；NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:20所示；PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:21所示；PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:22所示；TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:23所示；TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:24所示；TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:25所示；和TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴(kuò)增子，其序列如SEQID:26所示。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)上述22種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物的組合、根據(jù)上述22種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物的組合、上游通用引物和下游通用引物之間的摩爾比為：0.1-0.3：0.1-0.3：0.5-1：0.5-1，例如0.1:0.1:0.5:0.5。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，根據(jù)ALK基因的Chr2:29432588-29432707(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)ALK基因的Chr2:29443616-29443730(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)BRAF基因的Chr7:140453091-140453197(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55241604-55241726(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55242398-55242513(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55248970-55249096(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)EGFR基因的Chr7:55259505-55259621(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物；KRAS基因的Chr12:25380261-25380363(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)KRAS基因的Chr12:25398183-25398310(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物；根據(jù)MET基因的Chr7:116340233-116340335(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)MET基因的Chr7:116411880-116412005(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)MET基因的Chr7:116417426-116417546(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)MET基因的Chr7:116423399-116423499(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)NRAS基因的Chr1:115256507-115256586(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)NRAS基因的Chr1:115258651-115258755(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178936056-178936179(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)PIK3CA基因的Chr3:178952000-178952092(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)TP53基因的Chr17:7577027-7577154(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)TP53基因的Chr17:7577507-7577613(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)TP53基因的Chr17:7578182-7578298(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、和根據(jù)TP53基因的Chr17:7578389-7578537(Hg19)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物的摩爾比為：1:2:1:4:2:1:2:4:2:2:2:2:1:4:2:2:2:2:4:2:4:2。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，PCR反應(yīng)體系包括以下組分：PCR預(yù)混液10μl；DNA樣品1-8μl共20ng；用于構(gòu)建同一個(gè)DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合2μl；DNAase-freeH2O補(bǔ)足至20μl。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，所述PCR預(yù)混液為KAPAHiFiPCRKits2×。上述用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，進(jìn)行PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋荷鲜鲇糜跇?gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的方法在另一種實(shí)施方式中，PCR反應(yīng)結(jié)束后，還包括對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明基于PGM平臺(tái)設(shè)計(jì)的，使用其可以準(zhǔn)確的同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)區(qū)域(擴(kuò)增子)進(jìn)行有效擴(kuò)增。在使用其進(jìn)行建庫的過程中，本發(fā)明只涉及一輪PCR反應(yīng)及1輪產(chǎn)物純化步驟，大大的簡(jiǎn)化了現(xiàn)有商業(yè)化試劑盒的實(shí)驗(yàn)操作(如PCR過程、純化步驟以及消化加接頭等步驟)，節(jié)省了建庫時(shí)間，整個(gè)建庫流程只需2.5小時(shí)(包括了同一樣本的DNA和RNA建庫)。有效杜絕樣本及文庫污染。操作流程的大大簡(jiǎn)化使我們建庫過程更加的安全可靠，操作過程及步驟的減少有效的杜絕了建庫過程中有可能造成的文庫污染。簡(jiǎn)化的生物信息學(xué)分析流程。該方法所得到的擴(kuò)增子文庫結(jié)構(gòu)單一，數(shù)據(jù)可靠，所得文庫的DNA鏈組成簡(jiǎn)單明了，后續(xù)的生物信息學(xué)分析更加的簡(jiǎn)化。文庫構(gòu)建完成之后，只需Qubit2.0定量即可，省去了qPCR定量環(huán)節(jié)，進(jìn)一步縮短了建庫時(shí)間并減少了相應(yīng)的操作步驟，避免繁瑣的實(shí)驗(yàn)流程可能造成的實(shí)驗(yàn)誤差。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中擴(kuò)增子文庫構(gòu)建完成后檢測(cè)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分布圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中所得文庫里22個(gè)擴(kuò)增子的相關(guān)參數(shù)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。實(shí)施例1待測(cè)樣本為6份FFPE樣本(即：福爾馬林固定石蠟包埋樣本，F(xiàn)FPE代表Formalin-FixedandParrffin-Embedded)，其中4份為非小細(xì)胞肺癌患者的FFPE樣本，另外2份為非腫瘤患者的FFPE樣本。利用特異性設(shè)計(jì)的融合引物采用一步法對(duì)6份FFPE樣本構(gòu)建擴(kuò)增子DNA文庫，具體過程如下：1、基因組DNA的提?。菏褂肣iagenFFPEDNAKit(離心柱型)試劑盒提取FFPE樣本中的基因組DNA，具體步驟參照試劑盒操作說明，將所得基因組DNA溶解于Tris-HCl緩沖液，NanoDrop檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，用Qubit3.0檢測(cè)樣本DNA濃度后，將每份基因組DNA樣本稀釋到濃度為20ng/μl。2、設(shè)計(jì)并合成引物：根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物，所述上游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第一接頭序列和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列；根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物，所述下游融合引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第二接頭序列和根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性下游引物序列；上游通用引物，所述上游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的第三接頭序列、barcode序列和第一接頭序列；和下游通用引物，所述下游通用引物包括按照5’到3’的方向依次排列的通用序列和第二接頭序列。構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合中，根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列和特異性下游引物序列的信息如下：以下表格中給出了不同目標(biāo)擴(kuò)增子的信息，并給出了針對(duì)這些擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的特異性上游引物序列SpecialPrimerStart和特異性下游引物序列SpecialPrimerEnd。另外還給出了根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的上游融合引物、根據(jù)目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的下游融合引物、上游通用引物和下游通用引物的序列。Puf代表可選擇的上游通用引物，Pur代表下游通用引物。第一接頭序列為GGCATACGTCCTCGTCTA，第二接頭序列為TCTATGGGCAGTCGGTGAT，第三接頭序列為CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG，通用序列為CCACTACGCCTCCGCTTTCCTC。3、形成PCR反應(yīng)體系，具體PCR反應(yīng)體系如下：用于構(gòu)建同一個(gè)DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合通過以下方法配制：(1)將步驟2中合成的上游通用引物、下游通用引物、根據(jù)22種目標(biāo)擴(kuò)增子設(shè)計(jì)的各上游融合引物和各下游融合引物分別加水溶解至濃度100μM；(2)將22條序列號(hào)從小到大濃度分別為100μM的上游融合引物按照摩爾比為1:2:1:4:2:1:2:4:2:2:2:2:1:4:2:2:2:2:4:2:4:2混合得到上游融合引物組合，將22條濃度分別為100μM的下游融合引物按照與相應(yīng)上游融合引物等體積的量進(jìn)行混合得到下游融合引物組合，再將上游融合引物組合和下游融合引物組合等體積混合；(3)將濃度分別為100μM的上游通用引物和下游通用引物等體積混合；(4)再將上游融合引物組合、下游融合引物組合、上游通用引物和下游通用引物按照摩爾比為：0.1：0.1：0.5：0.5進(jìn)行混合，即得準(zhǔn)備好的用于構(gòu)建DNA樣品的擴(kuò)增子文庫的引物組合。6組不同的待檢樣本需要含有6個(gè)不同的barcode序列標(biāo)簽的引物組合分別對(duì)應(yīng)。4、進(jìn)行PCR程序，PCR儀使用Appliedbio-system的2720ThermalCycler，PCR反應(yīng)程序如下：5、PCR反應(yīng)結(jié)束后，用BeckmanCoulter公司的AgencourtAMPureXPKit(貨號(hào)A63880/A63881/A63882)進(jìn)行純化。操作步驟如下：1)提前30分鐘取出AgencourtAMPureXPKit，充分渦旋后，室溫靜置。2)PCR反應(yīng)結(jié)束后，將磁珠再次充分渦旋，向體系中加入20ul磁珠，反復(fù)吹打5次以上或充分渦旋，室溫靜置5分鐘。3)將EP管轉(zhuǎn)移至置于磁力架上，靜置5分鐘至溶液澄清后，用移液槍小心除去上清，注意不要觸碰磁珠。4)每管加入100ul新鮮配置的80％乙醇溶液，EP管置于磁力架上緩慢旋轉(zhuǎn)2圈，靜置5m，棄去上清。5)重復(fù)4步一次。6)將EP管打開，室溫靜置，使液體揮發(fā)干凈，以磁珠表面無光澤為準(zhǔn)，注意不要過分干燥磁珠。7)從磁力架上取下EP管，加入30ulPCR級(jí)純化水，渦旋混勻后，室溫靜置10分鐘。8)將上步的EP管置于磁力架上2分鐘或直至溶液澄清后，用移液槍在遠(yuǎn)離磁石的一面小心吸取上清液，注意不要觸碰磁珠。至此，擴(kuò)增子文庫構(gòu)建完成，圖1為文庫構(gòu)建完成后Agilent2200TapeStationSystems檢測(cè)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分布圖，橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度(FU)，lower峰為25bp位置marker，upper峰為1500bp位置marker，如圖1所示經(jīng)PCR擴(kuò)增后所得PCR產(chǎn)物集中在241-271bp范圍內(nèi)，圖1說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符合，從圖1可以判斷所構(gòu)建文庫的大小及文庫濃度。6、上機(jī)測(cè)序及結(jié)果分析上述通過融合引物一步法獲得的擴(kuò)增子文庫，使用IonPGM平臺(tái)的318芯片，進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，每個(gè)文庫的數(shù)據(jù)量為50Mbps。每個(gè)樣本平均測(cè)序深度不低于1600X，單個(gè)擴(kuò)增子測(cè)序深度均達(dá)到600X。所得測(cè)序結(jié)果如圖2所示，從圖2可以進(jìn)一步對(duì)22擴(kuò)增子的各擴(kuò)增子是否進(jìn)行了擴(kuò)增以及各擴(kuò)增子的擴(kuò)增均一性進(jìn)行分析。測(cè)序的結(jié)果經(jīng)過數(shù)據(jù)處理、生物信息學(xué)分析之后得到檢測(cè)基因的突變情況。數(shù)據(jù)處理過程包括測(cè)序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換、質(zhì)控、序列比對(duì)(參考基因組為NCBIGRCh37/Hg19)、突變位點(diǎn)分析等過程，通過數(shù)據(jù)處理分析后得到檢測(cè)樣本的突變信息。實(shí)際收集的樣本檢測(cè)情況如下：6例受檢者的FFPE樣本中，2例正常人樣本未檢測(cè)到腫瘤相關(guān)突變，4例腫瘤患者的FFPE樣本檢測(cè)結(jié)果中，Sample1檢測(cè)到p.R248W突變，sample2檢測(cè)到p.T790M突變，sample3檢測(cè)到p.G12A突變，Sample4檢測(cè)到p.E545K突變。該結(jié)果和sanger檢測(cè)的結(jié)果一致。充分說明了本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用性和良好特異性。前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。SEQUENCELISTING<110>北京泛生子基因科技有限公司<120>一步法快速構(gòu)建擴(kuò)增子文庫的方法<130>P170585DD1F<160>70<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1ggcatacgtcctcgtcta18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>2tctatgggcagtcggtgat19<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag30<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4ccactacgcctccgctttcctc22<210>5<211>159<212>DNA<213>人ALK基因的Chr2:29432588-29432707擴(kuò)增子<400>5taagggacaagcagccacaccccattcttgaggggctgaggtggaagagacaggcccgga60ggggtgaggcagtctttactcacctgtagatgtctcgggccatcccgaagtctccaatct120tggccactcttccagggcctggacaggtcaagaggcagt159<210>6<211>159<212>DNA<213>人ALK基因的Chr2:29443616-29443730擴(kuò)增子<400>6cggaggaaggacttgaggtctccccccgccatgagctccagcaggatgaaccggggcagg60gattgcaggctcaccccaatgcagcgaacaatgttctggtggttgaatttgctgcagagc120agagagggatgtaaccaaaattaactgagctgagtctgg159<210>7<211>163<212>DNA<213>人BRAF基因的Chr7:140453091-140453197擴(kuò)增子<400>7cctcaattcttaccatccacaaaatggatccagacaactgttcaaactgatgggacccac60tccatcgagatttcactgtagctagaccaaaatcacctatttttactgtgaggtcttcat120gaagaaatatatctgaggtgtagtaagtaaaggaaaacagtag163<210>8<211>169<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55241604-55241726擴(kuò)增子<400>8tgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagcttgtggagcctcttacacccagtgga60gaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaa120gtgctgggctccggtgcgttcggcacggtgtataaggtaaggtccctgg169<210>9<211>161<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55242398-55242513擴(kuò)增子<400>9acaattgccagttaacgtcttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaagg60tgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagc120caacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgctgtgt161<210>10<211>166<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55248970-55249096擴(kuò)增子<400>10gaagccacactgacgtgcctctccctccctccaggaagcctacgtgatggccagcgtgga60caacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatcac120gcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacac166<210>11<211>163<212>DNA<213>人EGFR基因的Chr7:55259505-55259621擴(kuò)增子<400>11ccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaa60gaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcct120gacaccagggaccaggctgccttcccactagctgtattgttta163<210>12<211>155<212>DNA<213>人ERBB2基因的Chr17:37880969-37881082擴(kuò)增子<400>12cataccctctcagcgtacccttgtccccaggaagcatacgtgatggctggtgtgggctcc60ccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacag120cttatgccctatggctgcctcttagaccatgtccg155<210>13<211>150<212>DNA<213>人KRAS基因的Chr12:25380261-25380363擴(kuò)增子<400>13agtcctcatgtactggtccctcattgcactgtactcctcttgacctgctgtgtcgagaat60atccaagagacaggtttctccatcaattactacttgcttcctgtaggaatcctgagaagg120gagaaacacagtctggattattacagtgca150<210>14<211>172<212>DNA<213>人KRAS基因的Chr12:25398183-25398310擴(kuò)增子<400>14aaagaatggtcctgcaccagtaatatgcatattaaaacaagatttacctctattgttgga60tcatattcgtccacaaaatgattctgaattagctgtatcgtcaaggcactcttgcctacg120ccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttcagcaggcctt172<210>15<211>146<212>DNA<213>人MET基因的Chr7:116340233-116340335擴(kuò)增子<400>15tcgatctgccatgtgtgcattccctatcaaatatgtcaacgacttcttcaacaagatcgt60caacaaaaacaatgtgagatgtctccagcatttttacggacccaatcatgagcactgctt120taatagggtaagtcacatcagttccc146<210>16<211>175<212>DNA<213>人MET基因的Chr7:116411880-116412005擴(kuò)增子<400>16ccatgatagccgtctttaacaagctctttctttctctctgttttaagatctgggcagtga60attagttcgctacgatgcaagagtacacactcctcatttggataggcttgtaagtgcccg120aagtgtaagcccaactacagaaatggtttcaaatgaatctgtagactaccgagct175<210>17<211>169<212>DNA<213>人MET基因的Chr7:116417426-116417546擴(kuò)增子<400>17atgttacgcagtgctaaccaagttctttcttttgcacagggcattttggttgtgtatatc60atgggactttgttggacaatgatggcaagaaaattcactgtgctgtgaaatccttgaaca120gtaagtggcattttatttaaccatggagtata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