本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種融合膠原蛋白，更具體的說，涉及一種重組三元融合膠原蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，在動物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色，為生物科技產(chǎn)業(yè)最具關(guān)鍵性的原材料之一，也是需求量龐大的最佳生物醫(yī)藥材料，廣泛應(yīng)用于生醫(yī)材料、化妝品和食品工程等領(lǐng)域。負(fù)載有生長因子的膠原蛋白海綿兼有組織修復(fù)、促進創(chuàng)傷愈合、祛黃、嫩膚等功效。但是目前獲取的膠原蛋白成熟的工藝是采用動物組織提取的方式，存在哺乳動物牛組織及鳥類動物雞組織中提取的膠原蛋白易帶病毒，繼而傳染并危害人的健康。
乳糖酸（bionicacid）秉承了果酸的獨有功效，但性質(zhì)及其溫和，具卓越的保濕，抗氧化和皮膚修復(fù)功效。其抗氧化功能被醫(yī)學(xué)界廣泛采用，甚至被用于保存移植器官。乳糖酸配方的功效和性質(zhì)使其不僅適用于敏感性肌膚，更成為全球皮膚科醫(yī)生在各種微創(chuàng)美容術(shù)后修復(fù)患者皮膚的首選產(chǎn)品。
本發(fā)明提供的重組三元融合膠原蛋白是三種物質(zhì)通過融合發(fā)酵重組而成的一種蛋白，采用國際領(lǐng)先的重組融合復(fù)配技術(shù)，強化細(xì)胞生物活性，保持原有特性并提升優(yōu)化，這三種物質(zhì)分別為人源膠原蛋白，3gf生長因子及新一代乳糖酸，它們的高效融合可提高成長再生修復(fù)機能的誘導(dǎo)潛能，比單一物質(zhì)的成長潛能高得多。重組三元融合膠原蛋白復(fù)配以適當(dāng)輔料后，可進一步制備成凍干粉劑、納米微球、納米脂質(zhì)體、水劑、凝膠等半固體制劑，應(yīng)用于組織工程，藥學(xué)以及美容護膚領(lǐng)域。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供重組三元融合膠原蛋白（以下稱為重組3m融合膠原蛋白），該蛋白由三種物質(zhì)：類人膠原蛋白、3gf生長因子、新型乳糖酸的融合發(fā)酵而組成的一種蛋白，可以提高成長再生修復(fù)的誘導(dǎo)潛能。
所述重組3m融合膠原蛋白包括重組類人膠原蛋白和質(zhì)量配比為25～35%的新型乳糖酸；所述重組類人膠原蛋白是由類人膠原蛋白與3gf成長因子融合形成，其包括類人膠原蛋白至少80%序列同源的第一區(qū)和與每一種人細(xì)胞生長因子的至少80%的序列同源第二區(qū)，第一區(qū)和第二區(qū)之間設(shè)有連接肽。
其中，上述重組重組3m融合膠原蛋白中，所述連接肽的通式是（ggss）n，n=1～4的整數(shù)。
其中，上述重組重組3m融合膠原蛋白中，所述3gf成長因子為表皮細(xì)胞生長因子egf、胰島素成長因子igf、成纖維細(xì)胞成長因子fgf和角化細(xì)胞生長因子kgf中的任意三種。
其中，上述重組重組3m融合膠原蛋白中，所述新型乳糖酸的主要成分為葡萄糖酸內(nèi)酯和乳糖酸，以重量份計，葡糖酸內(nèi)脂1～10份、乳糖酸1～250份。
其中，上述重組重組3m融合膠原蛋白中，所述重組類人膠原蛋白由以下方法制備得到：
1）重組類人膠原蛋白的工程菌的構(gòu)建；
2）工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)；
3）重組類人膠原蛋白的誘導(dǎo)及表達；
4）重組類人膠原蛋白的提純。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟1），所述重組類人膠原蛋白的工程菌的構(gòu)建如下：
a、將編碼類人膠原蛋白的dna片段抽提出來，并由編碼3gf成長因子序列進行修飾后，再特定重復(fù)，然后進行連接，dna重組；
b、將上述重組dna轉(zhuǎn)入到大腸桿菌。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟2），所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母菌15～28g/l，葡糖糖18～36g/l，nahpo43.0～9.3g/l，(nh4)2so44.0～5.0g/l，fecl30.5～2.0g/l，cocl2·6h2o0.15～0.28g/l，znso40.15～0.26g/l。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟2），所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度33.5～34.5℃，ph7.0溶氧do20%，空氣流量為1.3～3，5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為500～900r/min，接種量6%，種子培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、卡那霉素0.55mg/l、葡萄糖5.5g/l，以葡萄糖濃度控制1.6%為宜，用do量控制在40%，但od600的值為100時收獲細(xì)胞。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟4），所述重組類人膠原蛋白的提純?nèi)缦拢杭?xì)胞經(jīng)離心收集后經(jīng)高壓細(xì)胞勻漿，然后用緩沖液抽提，經(jīng)過第一次乙酸緩沖液鹽析后，進行離子樹脂交換，再經(jīng)金屬離子螯合吸附，精制和除熱源，精品去冷凍干燥。
進一步的，本發(fā)明還提供了上述重組3m融合膠原蛋白在制備用于組織工程、藥學(xué)或美容護膚領(lǐng)域的活性添加劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的重組3m融合膠原蛋白，相比傳統(tǒng)的類人膠原蛋更容易被人體所吸收，吸收更快，更徹底，同時還能促進人體新陳代謝，促進創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)，祛黃，嫩膚，改善黃褐斑、雀斑等色素沉著、皺紋及膚色效果，是一種功效全面突破性新型融合膠原蛋白。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種重組三元融合膠原蛋白（以下稱為重組3m融合膠原蛋白），該蛋白由三種物質(zhì)：類人膠原蛋白、3gf生長因子、新型乳糖酸的融合發(fā)酵而組成的一種蛋白，可以提高成長再生修復(fù)的誘導(dǎo)潛能。
所述重組3m融合膠原蛋白包括重組類人膠原蛋白和質(zhì)量配比為25～35%的新型乳糖酸；所述重組類人膠原蛋白是由類人膠原蛋白與3gf成長因子融合形成，其包括類人膠原蛋白至少80%序列同源的第一區(qū)和與每一種人細(xì)胞生長因子的至少80%的序列同源第二區(qū)，第一區(qū)和第二區(qū)之間設(shè)有連接肽。
其中，上述重組重組3m融合膠原蛋白中，所述連接肽的通式是（ggss）n，n=1～4的整數(shù)，優(yōu)選n=3。
其中，上述重組重組3m融合膠原蛋白中，所述3gf成長因子為表皮細(xì)胞生長因子egf、胰島素成長因子igf、成纖維細(xì)胞成長因子fgf和角化細(xì)胞生長因子kgf中的任意三種；所述新型乳糖酸的主要成分為葡萄糖酸內(nèi)酯和乳糖酸，以重量份計，葡糖酸內(nèi)脂1～10份、乳糖酸1～250份。此配比可以達到對皮膚無刺激的去除皮膚角質(zhì)，改善黃褐斑、雀斑等色素沉著、皺紋及膚色效果。
其中，上述重組重組3m融合膠原蛋白中，所述重組類人膠原蛋白由以下方法制備得到：
1）重組類人膠原蛋白的工程菌的構(gòu)建；
2）工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)；
3）重組類人膠原蛋白的誘導(dǎo)及表達；
4）重組類人膠原蛋白的提純。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟1），所述重組類人膠原蛋白的工程菌的構(gòu)建如下：
a、將編碼類人膠原蛋白的dna片段抽提出來，并由編碼3gf成長因子序列進行修飾后，再特定重復(fù)，然后進行連接，dna重組；
b、將上述重組dna轉(zhuǎn)入到大腸桿菌。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟2），所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母菌15～28g/l，葡糖糖18～36g/l，nahpo43.0～9.3g/l，(nh4)2so44.0～5.0g/l，fecl30.5～2.0g/l，cocl2·6h2o0.15～0.28g/l，znso40.15～0.26g/l。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟2），所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度33.5～34.5℃，ph7.0溶氧do20%，空氣流量為1.3～3，5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為500～900r/min，接種量6%，種子培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、卡那霉素0.55mg/l、葡萄糖5.5g/l，以葡萄糖濃度控制1.6%為宜，用do量控制在40%，但od600的值為100時收獲細(xì)胞。
其中，上述重組類人膠原蛋白的方法步驟4），所述重組類人膠原蛋白的提純?nèi)缦拢杭?xì)胞經(jīng)離心收集后經(jīng)高壓細(xì)胞勻漿，然后用緩沖液抽提，經(jīng)過第一次乙酸緩沖液鹽析后，進行離子樹脂交換，再經(jīng)金屬離子螯合吸附，精制和除熱源，精品去冷凍干燥。
進一步的，本發(fā)明還提供了上述重組3m融合膠原蛋白在制備用于組織工程、藥學(xué)或美容護膚領(lǐng)域的活性添加劑中的應(yīng)用。將上述重組3m融合膠原蛋白配以適當(dāng)輔料通過一定工藝進一步制備成凍干粉劑、納米微球、納米脂質(zhì)體、水劑、凝膠等半固體制劑，應(yīng)用于組織工程，藥學(xué)以及美容護膚領(lǐng)域。
本發(fā)明重組3m融合膠原蛋白中：
類人膠原蛋白具備四個生物特性：1、能被生物吸收、2、被細(xì)胞粘附、3、形成新細(xì)胞上皮細(xì)胞、4、能被生物兼容。該膠原蛋白不僅具有動物體膠原蛋白原有功效，如：生物兼容性、生物吸收性、細(xì)胞粘附性、促新細(xì)胞形成和促上皮細(xì)胞形成，而且由于可形成三重復(fù)螺旋結(jié)構(gòu)，賦予其新功能，如熱可逆成膠原和在分子量及特性不變條件下的可加工性。而來自動物組織提取的膠原蛋白為三交叉螺旋結(jié)構(gòu)，它不可能在不減少分子量的前提下重溶解。
新型乳糖酸秉承了果酸的獨有功效，但性質(zhì)及其溫和，具卓越的保濕，抗氧化和皮膚修復(fù)功效。其抗氧化功能被醫(yī)學(xué)界廣泛采用，甚至被用于保存移植器官。乳糖酸配方的功效和性質(zhì)使其不僅適用于敏感性肌膚，更成為全球皮膚科醫(yī)生在各種微創(chuàng)美容術(shù)后修復(fù)患者皮膚的首選產(chǎn)品。
細(xì)胞生長因子是由機體細(xì)胞產(chǎn)生，能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增值和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮功能，是高活性多功能的多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白。egf（表皮生長因子）作用于皮膚表皮層，其主要作用是促進皮膚表皮修復(fù)，激活細(xì)胞。fgf（成纖維細(xì)胞生長因子）作用于中胚層，神經(jīng)外胚層，主要起深層修護，表皮修復(fù)，細(xì)胞重組、分化、激活等作用。rna/dna核糖核酸/脫氧核糖核酸作用于中胚層，有促進新生細(xì)胞生長的效用。
重組3m融合膠原蛋白由上述三種物質(zhì)通過融合發(fā)酵重組而成，采用國際領(lǐng)先的重組融合復(fù)配技術(shù)，強化細(xì)胞生物活性，保持原有特性并提升優(yōu)化，它們的高效融合可提高成長再生修復(fù)機能的誘導(dǎo)潛能，比單一物質(zhì)的成長潛能高得多。相比傳統(tǒng)的類人膠原蛋更容易被人體所吸收，吸收更快，更徹底，同時還能促進人體新陳代謝，促進創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)，祛黃，嫩膚，改善黃褐斑、雀斑等色素沉著、皺紋及膚色效果，是一種功效全面突破性新型融合膠原蛋白。
下面結(jié)合具體的實施例，進一步闡述本發(fā)明，實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，實施例中未注明具體條件的實施方法，通常按常規(guī)條件。
實施例1
重組3m融合膠原蛋白包括重組類人膠原蛋白和質(zhì)量配比為30%的新型乳糖酸；所述重組類人膠原蛋白是由類人膠原蛋白與3gf成長因子融合形成，其包括類人膠原蛋白至少80%序列同源的第一區(qū)和與每一種人細(xì)胞生長因子的至少80%的序列同源第二區(qū)，第一區(qū)和第二區(qū)之間設(shè)有連接肽；所述連接肽的通式是（ggss）n，n=3。所述3gf成長因子為表皮細(xì)胞生長因子egf、胰島素成長因子igf和成纖維細(xì)胞成長因子fgf；所述新型乳糖酸的主要成分為葡萄糖酸內(nèi)酯和乳糖酸，以重量份計，葡糖酸內(nèi)脂7份、乳糖酸80份。
所述重組類人膠原蛋白由以下方法制備得到：
1）重組類人膠原蛋白的工程菌的構(gòu)建：a、將編碼類人膠原蛋白的dna片段抽提出來，并由編碼3gf成長因子序列進行修飾后，再特定重復(fù)，然后進行連接，dna重組；b、將上述重組dna轉(zhuǎn)入到大腸桿菌；
2）工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)：所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母菌18g/l，葡糖糖20g/l，nahpo44.5g/l，(nh4)2so44.0g/l，fecl31.0g/l，cocl2·6h2o0.15g/l，znso40.15g/l；
所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度33.5℃，ph7.0溶氧do20%，空氣流量為1.3～3.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min，接種量6%，種子培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、卡那霉素0.55mg/l、葡萄糖5.5g/l，以葡萄糖濃度控制1.6%為宜，用do量控制在40%，但od600的值為100時將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到40℃誘導(dǎo)2.5h收獲細(xì)胞；
3）重組類人膠原蛋白的誘導(dǎo)及表達；
4）重組類人膠原蛋白的提純：細(xì)胞經(jīng)離心收集后經(jīng)高壓細(xì)胞勻漿，然后用緩沖液抽提，經(jīng)過第一次乙酸緩沖液鹽析后，進行離子樹脂交換，再經(jīng)金屬離子螯合吸附，精制和除熱源，精品去冷凍干燥。
實施例2
重組3m融合膠原蛋白包括重組類人膠原蛋白和質(zhì)量配比為30%的新型乳糖酸；所述重組類人膠原蛋白是由類人膠原蛋白與3gf成長因子融合形成，其包括類人膠原蛋白至少80%序列同源的第一區(qū)和與每一種人細(xì)胞生長因子的至少80%的序列同源第二區(qū)，第一區(qū)和第二區(qū)之間設(shè)有連接肽；所述連接肽的通式是（ggss）n，n=3。所述3gf成長因子為表皮細(xì)胞生長因子egf、胰島素成長因子igf和成纖維細(xì)胞成長因子fgf；所述新型乳糖酸的主要成分為葡萄糖酸內(nèi)酯和乳糖酸，以重量份計，葡糖酸內(nèi)脂10份、乳糖酸180份。
所述重組類人膠原蛋白由以下方法制備得到：
1）重組類人膠原蛋白的工程菌的構(gòu)建：a、將編碼類人膠原蛋白的dna片段抽提出來，并由編碼3gf成長因子序列進行修飾后，再特定重復(fù)，然后進行連接，dna重組；b、將上述重組dna轉(zhuǎn)入到大腸桿菌；
2）工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)：所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為：酵母菌26g/l，葡糖糖30g/l，nahpo48.2g/l，(nh4)2so45.0g/l，fecl32.0g/l，cocl2·6h2o0.25g/l，znso40.26g/l；
所述工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度33.5℃，ph7.0溶氧do20%，空氣流量為1.3～3.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min，接種量6%，種子培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、卡那霉素0.55mg/l、葡萄糖5.5g/l，以葡萄糖濃度控制1.6%為宜，用do量控制在40%，但od600的值為100時將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到40℃誘導(dǎo)2.5h收獲細(xì)胞；
3）重組類人膠原蛋白的誘導(dǎo)及表達；
4）重組類人膠原蛋白的提純：細(xì)胞經(jīng)離心收集后經(jīng)高壓細(xì)胞勻漿，然后用緩沖液抽提，經(jīng)過第一次乙酸緩沖液鹽析后，進行離子樹脂交換，再經(jīng)金屬離子螯合吸附，精制和除熱源，精品去冷凍干燥。
本發(fā)明方案所公開的技術(shù)手段不僅限于上述實施方式所公開的技術(shù)手段，還包括由以上技術(shù)特征任意組合所組成的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。