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一種MZF1蛋白可結(jié)合DNA片段及在MZF1活性檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):11506058閱讀:1129來(lái)源:國(guó)知局
一種MZF1蛋白可結(jié)合DNA片段及在MZF1活性檢測(cè)中的應(yīng)用的制造方法與工藝

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域,更特別地,涉及一種mzf1蛋白可結(jié)合的dna片段及其在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。



背景技術(shù):

髓樣鋅指蛋白1(mzf1)是由人類(lèi)19號(hào)染色體mzf1基因編碼的一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白,屬于c2h2類(lèi)鋅指結(jié)構(gòu)蛋白家族,在人類(lèi)細(xì)胞中大量存在。mzf1蛋白全長(zhǎng)734個(gè)氨基酸,大約82055da,與靶基因結(jié)合后,通過(guò)其特有的鋅指結(jié)構(gòu)與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域dna相結(jié)合,在骨髓造血過(guò)程中發(fā)揮基因激活或抑制效應(yīng)。

mzf1基因發(fā)生突變后,會(huì)引起某些調(diào)節(jié)紊亂,甚至疾病的發(fā)生。然而,目前檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性mzf1活性仍然依靠westernblot或者qrcr等技術(shù),雖然靈敏度高,但檢測(cè)到的只是mzf1蛋白含量的差異,并不能直接體現(xiàn)其結(jié)合到靶序列后活性的改變。

因此,需要設(shè)計(jì)一種新的用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),mzf1蛋白結(jié)合的dna序列存在高度的保守性,其結(jié)合的dna核心序列為5'-agtgggga-3'或5’-cgggngagggggaa-3’(n表示a、t、c、g,如seqidno:1-4所示)。

基于以上研究,本發(fā)明提供了一種mzf1蛋白可結(jié)合的dna片段,其包含多個(gè)mzf1蛋白結(jié)合框,其中至少一個(gè)mzf1蛋白結(jié)合框的序列為5'-agtgggga-3',其余的mzf1蛋白結(jié)合框的序列5’-cgggngagggggaa-3’(n表示a、t、c、g,如seqidno:1-4所示)。

優(yōu)選地,當(dāng)包含多個(gè)mzf1蛋白結(jié)合框時(shí),每?jī)蓚€(gè)相鄰的mzf1蛋白結(jié)合框之間具有間隔序列。

優(yōu)選地,每?jī)蓚€(gè)相鄰的mzf1蛋白結(jié)合框之間的間隔序列為所述間隔序列為ta。

優(yōu)選地,所述dna片段的序列如seqidno:5所示。在研究過(guò)程中,我們?cè)囼?yàn)了多種組合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列的dna片段比其他組合方式對(duì)mzf1蛋白的結(jié)合效率更高。

本發(fā)明還提供了上述dna片段在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法,其包括以下步驟:

s1:將包括上述dna片段以及連接于所述dna片段下游的報(bào)告基因表達(dá)框的報(bào)告基因系統(tǒng)導(dǎo)入所述細(xì)胞;

s2:通過(guò)檢測(cè)所述報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)計(jì)算所述細(xì)胞內(nèi)mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性??蓪?bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度作為指示mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。

優(yōu)選地,所述報(bào)告基因系統(tǒng)為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),包括重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒,并且所述重組質(zhì)粒帶有所述dna片段以及連接在所述dna片段下游的熒光素酶i的表達(dá)框,所述對(duì)照質(zhì)粒帶有熒光素酶ii的表達(dá)框,所示熒光素酶i與所述熒光素酶ii激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)不同。將mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性表示為熒光素酶i激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與熒光素酶ii激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的比值。

優(yōu)選地,所述重組質(zhì)粒通過(guò)將所述dna片段插入至質(zhì)粒pgl3.0-basic的kpni與hindiii位點(diǎn)之間得到。

優(yōu)選地,所述對(duì)照質(zhì)粒為phrl-tk。

優(yōu)選地,s1具體包括:

s11:將所述細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁,并恢復(fù)形態(tài);

s12:將所述重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

優(yōu)選地,s2具體包括:

s21:轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時(shí),洗滌細(xì)胞;

s22:分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的熒光素酶i和熒光素酶ii的活性;

s23:將熒光素酶ii活性歸一化熒光素酶i活性得到值作為衡量mzf1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。

通過(guò)使用本發(fā)明的dna片段和方法,可直接針對(duì)性地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mzf1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,而非僅僅檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)的含量,從而使得能夠更準(zhǔn)確地分析mzf1作為轉(zhuǎn)錄因子在一些病理學(xué)發(fā)展中所起的作用。

附圖說(shuō)明

圖1為kpni與hindiii對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳照片;

圖2為分別轉(zhuǎn)染有pgl3.0-basic和pgl3.0-basic-mzf1的人結(jié)腸癌細(xì)胞系sw480、人宮頸癌細(xì)胞系hela、人乳腺癌細(xì)胞系mcf7細(xì)胞中的相對(duì)mzf1活性(即,螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)的統(tǒng)計(jì)圖;

圖3為分別轉(zhuǎn)染有pcdna3.1(+)空載體和pcdna3.1(+)-mzf1的人結(jié)腸癌細(xì)胞系sw480、人宮頸癌細(xì)胞系hela、人乳腺癌細(xì)胞系mcf7細(xì)胞中的相對(duì)mzf1活性(即,螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)的統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述,所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明,并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.構(gòu)建mzf1蛋白可結(jié)合的dna片段

發(fā)明人對(duì)mzf1進(jìn)行研究分析,發(fā)現(xiàn)mzf1蛋白結(jié)合的dna序列為5'-agtgggga-3',以及5'-cgggngagggggaa-3'(n表示a、t、c、g,如seqidno:1-4所示),合成該dna核心序列時(shí),本發(fā)明實(shí)施例在設(shè)計(jì)合成該dna核心序列時(shí),將這兩段dna核心序列分別重復(fù)兩次,以ta堿基進(jìn)行間隔,得到序列如seqidno:5所示的dna片段。

為保證載體構(gòu)建的成功,在末端加入相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的粘性末端,本例在5’端加入kpni酶切位點(diǎn)的粘性末端(catgg),在3’端加入hindiii酶切位點(diǎn)的粘性末端(ttcga),序列兩邊的粘性末端的設(shè)計(jì)有助于片段與載體的連接。

通過(guò)從頭合成的方法,分別合成該片段的兩條寡核苷酸鏈,其序列分別如seqidno:6和7所示,這兩條寡核苷酸鏈皆由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。兩條寡核苷酸鏈互補(bǔ)配對(duì)后形成包含kpni酶切位點(diǎn)粘性末端和hindiii酶切位點(diǎn)粘性末端的雙鏈dna片段。50μl退火體系如下:annealingbufferfordnaoligos(5x)10μl、寡核苷酸鏈(50μm)各10μl,余下為ddh2o。

充分混勻后,設(shè)置pcr儀程序進(jìn)行退火反應(yīng),形成dna雙鏈。用dna寡核苷酸退火緩沖液(購(gòu)自碧云天公司,貨號(hào)為d0251)將合成的兩條dna單鏈進(jìn)行退火處理,促使其互補(bǔ)配對(duì),形成5'端包含kpni酶切位點(diǎn)粘性末端和3'端包含hindiii酶切位點(diǎn)粘性末端的雙鏈dna。具體程序?yàn)椋?5℃退火2分鐘(目的是讓dnaoligo充分變性);每90秒下降1℃,降至25℃后結(jié)束反應(yīng)。dna退火產(chǎn)物用1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定(由于dna片段較小,電泳鑒定無(wú)法看到單一、特異的條帶),測(cè)濃度后置冰上備用,也可以-20℃凍存?zhèn)溆谩H绻嘶鸾Y(jié)束后打算進(jìn)行酶切等其它反應(yīng),最好用純化試劑盒進(jìn)行純化,或者確保退火產(chǎn)物在反應(yīng)體系中體積不超過(guò)5%,以避免annealingbuffer對(duì)后續(xù)的酶連反應(yīng)體系的干擾。

2.將mzf1蛋白可結(jié)合的dna片段插入熒光素酶表達(dá)載體

用內(nèi)切酶kpni和hindiii(購(gòu)自takara公司,kpni貨號(hào)為1618,hindiii貨號(hào)為1615)對(duì)上述pgl3-basic空載體進(jìn)行雙酶切,20μl酶切體系如下:10xquickcutgreenbuffer2μl,kpni1μl,hindiii1μl,pgl3-basic空載體1μg,余下為ddh2o。

充分混勻后,37℃酶切反應(yīng)90分鐘,用1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒雙酶切后的情況,然后切膠回收(dna膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司,貨號(hào)為dp209),回收結(jié)束后測(cè)樣品濃度,置冰上備用。

將退火得到的雙鏈dna連接至pgl3-basic熒光素酶表達(dá)載體上。10μl連接體系如下:dna連接酶(購(gòu)自takara公司,貨號(hào)為6022)5μl,雙鏈dna片段與經(jīng)雙酶切的pgl3.0-basic載體共5μl。為促進(jìn)酶連成功率,將dna片段與載體的摩爾比控制在10:1左右。充分混勻后,將酶連體系置于pcr儀中,16℃反應(yīng)1小時(shí),連接反應(yīng)結(jié)束后得到重組質(zhì)粒,置于冰上備用。

將重組質(zhì)粒(含有mzf1蛋白結(jié)合的dna片段的pgl3-basic表達(dá)載體)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。按照經(jīng)典的熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,具體方法如下:從-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α置于冰上解凍2-3分鐘,加入上述連接好的重組質(zhì)粒,輕輕混勻,冰上孵育20分鐘后42℃熱激60秒,迅速放至冰上靜置2分鐘,然后加入450μl不含抗生素的無(wú)菌lb液體培養(yǎng)基,放置于恒溫?fù)u床中復(fù)蘇1小時(shí),復(fù)蘇條件為37℃,200轉(zhuǎn)/分鐘。取復(fù)蘇后的菌液100μl均勻涂布于直徑為3.5厘米含氨芐青霉素(重組質(zhì)粒可耐受氨芐青霉素)的lb固體選擇培養(yǎng)基中。吸收10分鐘后,倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜。次日挑取單菌落至5-7ml含氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中,37℃,200轉(zhuǎn)/分鐘,搖菌繁殖12小時(shí)后提取質(zhì)粒,1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用內(nèi)切酶kpni和hindiii(購(gòu)自takara公司,kpni貨號(hào)為1618,hindiii貨號(hào)為1615)對(duì)上述提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,本發(fā)明實(shí)施例雙酶切鑒定如圖1所示(泳道5為marker,泳道1-4顯示為陽(yáng)性克隆)。陽(yáng)性組送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序,確認(rèn)dna片段已整合至pgl3-basic載體上。至此,含有mzf1蛋白結(jié)合的dna片段的pgl3-basic表達(dá)載體(以下均表示為pgl3.0-basic-mzf1)構(gòu)建成功。

3.pgl3-basic-mzf1轉(zhuǎn)染細(xì)胞

本發(fā)明實(shí)施例采用人結(jié)腸癌細(xì)胞系sw480、人宮頸癌細(xì)胞系hela、人乳腺癌細(xì)胞系mcf7細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。分別將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞均勻種植在24孔板內(nèi),每孔約10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,用10%胎牛血清,高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁并恢復(fù)形態(tài)后,將報(bào)告基因系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為60-80%為宜)。使用的轉(zhuǎn)染試劑為neofect(購(gòu)自零客創(chuàng)智生物科技有限公司,貨號(hào)為tf20121201)。50μl轉(zhuǎn)染體系如下:質(zhì)粒0.5μg,neofect轉(zhuǎn)染試劑0.5μl,余下為無(wú)血清培養(yǎng)基。

本實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒分別為:pgl3-basic空載體、pgl3.0-basic-mzf1、phrl-tk(帶有海腎熒光素酶基因的載體)、pcdna3.1(+)-mzf1(mzf1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,以下簡(jiǎn)稱(chēng)為pcdna3.1-mzf1)。

4.計(jì)算mzf1的活性

以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,計(jì)算mzf1活性。具體實(shí)驗(yàn)方法如下:轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時(shí),再棄培養(yǎng)基上清,用1xpbs清洗細(xì)胞3次,每次5分鐘,清洗細(xì)胞時(shí)注意操作輕柔,避免正面吹打細(xì)胞。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自蓋寧生物科技有新公司,貨號(hào)為gn201-01)進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明實(shí)施例為驗(yàn)證該報(bào)告基因系統(tǒng)是否具有活性,將pgl3.0-basic-mzf1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,檢測(cè)mzf1報(bào)告基因系統(tǒng)的活性,測(cè)定結(jié)果如圖2所示,處理組(轉(zhuǎn)染pgl3.0-basic-mzf1)熒光活性明顯高于對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pgl3.0-basic空載體)。

本發(fā)明實(shí)施例為驗(yàn)證該報(bào)告基因系統(tǒng)是否可以特異性檢測(cè)mzf1活性,將pcdna3.1(+)-mzf1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,結(jié)果如圖3所示,外源導(dǎo)入mzf1后,陽(yáng)性處理組(轉(zhuǎn)染pcdna3.1(+)-mzf1)熒光活性明顯高于對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.1(+)空載體)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例,并不用以限制本發(fā)明,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi),所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

<120>一種mzf1蛋白可結(jié)合dna片段及在mzf1活性檢測(cè)中的應(yīng)用

<130>1

<160>7

<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

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