一種具有線粒體直接靶向效應(yīng)的熒光探針及其合成方法和應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及一種線粒體熒光探針，具體涉及一種具有線粒體直接靶向效應(yīng)的熒光探針及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的細(xì)胞器，不僅具有為細(xì)胞供給能量、參與代謝等重要功能，而且參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等重要的生物過程。大量研究表明，線粒體的數(shù)量、分布、結(jié)構(gòu)、功能變化與神經(jīng)退行性病變(如帕金森癥、阿爾茲海默癥)、代謝型疾病(如ii型糖尿病、肥胖癥)、癌癥及心血管疾病等病癥密切相關(guān)。線粒體被冠以“細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)細(xì)胞器”和“細(xì)胞死亡之馬達(dá)”等稱號(hào)，與之相關(guān)的“線粒體學(xué)”已經(jīng)成為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在藥物作用機(jī)制研究中，藥物通過與靶點(diǎn)相互作用來發(fā)揮藥物作用，而線粒體通常是主要靶細(xì)胞器，因此合成開發(fā)一種可直接靶向線粒體的小分子熒光探針尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有線粒體直接靶向效應(yīng)的熒光探針，以及它的合成方法和應(yīng)用。

本發(fā)明所述的具有線粒體直接靶向效應(yīng)的熒光探針具有如下式(i)所示結(jié)構(gòu)：

上述式(i)所示化合物的合成方法為：取如下式(ii)所示化合物和甘氨酸乙酯(c4h9no2)，溶于二甲基亞砜或n,n-二甲基甲酰胺中，于加熱條件下反應(yīng)，所得反應(yīng)物倒入冰水中，過濾，得到目標(biāo)物粗品；

上述合成方法的合成路線如下：

上述合成方法中所涉及的式(ii)所示化合物作為反應(yīng)物參與反應(yīng)，其化學(xué)名稱為4-溴-n-(3,4-亞甲二氧基苯乙基)-1,8-萘二甲酰亞胺(4-bromo-n-(3,4-methylenedioxy-phenethylamin)-1,8-naphthalimide)，在本申請中簡稱na-1a。該化合物可參照公開號(hào)為cn104557887a的發(fā)明專利中公開的方法進(jìn)行合成，也可自行設(shè)計(jì)合成路線進(jìn)行合成。

本發(fā)明所述合成方法中，式(ii)所示化合物和甘氨酸乙酯的物質(zhì)的量之比通常為1：1～1：1.2，優(yōu)選甘氨酸乙酯的摩爾量稍大于式(ii)所示化合物的物質(zhì)的量，便于反應(yīng)充分進(jìn)行。

本發(fā)明所述合成方法中，在反應(yīng)之前還可以加入適量的三乙胺作為縛酸劑，以提高目標(biāo)物的產(chǎn)率。通常情況下，三乙胺和甘氨酸乙酯的物質(zhì)的量之比為1：1～3：1。

本發(fā)明所述合成方法中，反應(yīng)優(yōu)選是在80～150℃條件下進(jìn)行，更優(yōu)選是在100～135℃條件下進(jìn)行。反應(yīng)是否完全可以通過tlc跟蹤檢測。

上述合成方法制得的是式(i)化合物的粗品，可采用現(xiàn)有常規(guī)的純化方法(如萃取、硅膠柱層析等)對其進(jìn)行純化以提高式(i)化合物的純度。通常采用硅膠柱層析來進(jìn)行純化，具體是將制得的目標(biāo)物粗品經(jīng)硅膠柱層析，用由體積比為100：1～1：1的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫劑洗脫，洗脫液蒸除溶劑，得到純化后的目標(biāo)產(chǎn)物。所述組成洗脫劑的石油醚和乙酸乙酯的體積比優(yōu)選為20：1～5：1。優(yōu)選在進(jìn)行硅膠柱層析之前先對粗產(chǎn)物進(jìn)行萃取以減少硅膠的負(fù)擔(dān)，具體可用如乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿等萃取劑進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，除去溶劑后再進(jìn)行硅膠柱層析。

本發(fā)明還包括上述熒光探針在細(xì)胞內(nèi)線粒體的熒光顯微成像中的應(yīng)用。所述的細(xì)胞具體為非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株nci-h460。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種新的具有線粒體直接靶向效應(yīng)的熒光探針及它的合成方法。申請人的實(shí)驗(yàn)表明該熒光探針對線粒體具有直接靶向效應(yīng)但對細(xì)胞無明顯抑制作用，具有較好的潛在價(jià)值，有望作為直接靶向線粒體的熒光探針。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例6制得的最終產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中細(xì)胞孵育化合物na-2a后5h胞漿蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；

圖3為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中細(xì)胞孵育化合物na-2a后5h線粒體蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；

圖4為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中細(xì)胞未孵育化合物na-2a胞漿蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；

圖5為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中細(xì)胞未孵育化合物na-2a線粒體蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；

圖6為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中未經(jīng)給藥處理提取線粒體單獨(dú)孵育化合物na-2a后5h線粒體蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果；

圖7為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2中陰性對照細(xì)胞熒光檢測結(jié)果；

圖8為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2中細(xì)胞孵育5h時(shí)熒光檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述,以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容,但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1：na-1a即式(ii)所示化合物的合成

稱取4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于150ml乙醇中，攪拌并加入3,4-亞甲二氧苯乙胺(4-溴-1,8-萘二甲酸酐和3,4-亞甲二氧苯乙胺的摩爾比為1：1.5)，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)進(jìn)程使用薄層色譜進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系冷卻至室溫，過濾并保留濾餅，使用乙醇淋洗濾餅，即得黃色固體(產(chǎn)率約為90％)。

對所得黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，具體波譜特性如下：

(1)核磁共振氫譜，其譜圖如圖1所示。

¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:8.53(ddd,j＝9.5,7.9,1.0hz,2h),8.31(d,j＝7.9hz,1h),8.20(d,j＝7.9hz,1h),7.99–7.96(m,1h),6.85(d,j＝1.6hz,1h),6.80(s,1h),6.69(dd,j＝7.9,1.7hz,1h),5.97(s,2h),4.20–4.15(m,2h),2.84(t,j＝7.5hz,2h)。

(2)核磁共振碳譜，其譜圖如圖2所示。

¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ:162.86,162.82,147.36,145.78,132.78,132.54,131.72,131.50,131.11,129.90,129.30,128.94,128.36,122.79,122.01,121.61,109.09,108.33,100.82,41.39,33.19。

因此，可確定上述黃色固體產(chǎn)物即為4-溴-n-(3,4-亞甲二氧基苯乙基)-1,8-萘二甲酰亞胺，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式(ii)所示：

實(shí)施例2：na-1a的合成

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

反應(yīng)溫度改為60℃，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率約為75％)。

對所得黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例3：na-1a的合成

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

反應(yīng)溫度改為80℃，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率約為85％)。

對所得黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例4：na-1a的合成

重復(fù)實(shí)施例1，不同的是：

反應(yīng)溶劑改為甲醇，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率約為85％)。

對所得黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例5：na-1a的合成

重復(fù)實(shí)施例1，不同的條件是：

反應(yīng)原料4-溴-1,8-萘二甲酸酐和3,4-亞甲二氧苯乙胺的物質(zhì)的量之比改為1:1，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率約為65％)。

對所得黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例6：式(i)所示化合物即4-(乙氧羰基甲氨基)-n-(3，4-亞甲二氧苯乙基)-1，8-萘二甲酰亞胺(以下簡稱na-2a)的合成

稱取na-1a溶于二甲基亞砜中，加入甘氨酸乙酯和三乙胺(na-1a、甘氨酸乙酯和三乙胺的摩爾比為1：1.2：2)，反應(yīng)溫度135℃，反應(yīng)進(jìn)程使用薄層色譜進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系冷卻至室溫，倒入冰水中，有黃色固體析出，使用乙酸乙酯萃取三次，收集合并酯層并用無水mgso4干燥，減壓除去溶劑，所得粗產(chǎn)物進(jìn)行硅膠柱層析分離純化(v石油醚：v乙酸乙酯＝20：1～5：1)，得到亮黃色固體(產(chǎn)率為65％)。

對所得亮黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質(zhì)譜分析，具體波譜特性如下：

(1)核磁共振氫譜，其譜圖數(shù)據(jù)如下所示。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.66(d,j＝8.4hz,1h),8.46(d,j＝7.2hz,1h),8.26(d,j＝8.5hz,1h),8.14(s,1h),7.74(t,j＝7.8hz,1h),6.90–6.75(m,2h),6.67(dd,j＝10.7,9.0hz,2h),5.97(s,2h),4.29(d,j＝5.5hz,2h),4.17(q,j＝7.1hz,4h),2.90–2.74(m,2h),1.23(s,3h)。

(2)核磁共振碳譜，其譜圖數(shù)據(jù)如下所示。

¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:170.38,164.07,163.26,150.81,147.72,146.10,134.38,133.18,131.25,130.11,129.68,128.86,125.23,122.45,121.93,120.68,109.44,109.31,108.66,104.88,101.16,61.26,40.63,40.42,40.21,40.00,39.79,39.58,39.37,33.84,14.59。

(3)電噴霧質(zhì)譜，其譜圖如圖1所示，esi-msm/z：445.14[m-h]^-

因此，可確定上述亮黃色固體產(chǎn)物即為4-(乙氧羰基甲氨基)-n-(3，4-亞甲二氧苯乙基)-1，8-萘二甲酰亞胺，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式(i)所示：

實(shí)施例7：na-2a的合成

重復(fù)實(shí)施例6，不同的是：

反應(yīng)溫度改為80℃，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率為25％)。

對所得亮黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質(zhì)譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例8：na-2a的合成

重復(fù)實(shí)施例6，不同的是：

反應(yīng)溫度改為100℃，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率為38％)。

對所得亮黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質(zhì)譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例9：na-2a的合成

重復(fù)實(shí)施例6，不同的是：

反應(yīng)原料na-2a和甘氨酸乙酯的物質(zhì)的量之比改為1:1，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率為40％)。

對所得亮黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質(zhì)譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例10：na-2a的合成

重復(fù)實(shí)施例6，不同的是：

反應(yīng)原料甘氨酸乙酯和三乙胺的物質(zhì)的量之比改為1:1，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率為20％)。

對所得亮黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質(zhì)譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例11：na-2a的合成

重復(fù)實(shí)施例6，不同的是：

反應(yīng)溶劑改為n,n-二甲基甲酰胺，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率為60％)。

對所得亮黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質(zhì)譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例12：na-2a的合成

重復(fù)實(shí)施例6，不同的是：

反應(yīng)溶劑改為乙二醇單甲醚，其余反應(yīng)條件不變，未生成目標(biāo)化合物。

實(shí)施例13：na-2a的合成

重復(fù)實(shí)施例6，不同的是：

合成方法不加入三乙胺，其余反應(yīng)條件不變(產(chǎn)率為15％)。

對所得亮黃色固體進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質(zhì)譜分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物。

為充分說明本發(fā)明所述熒光探針具有直接靶向作用于線粒體的特性，申請人對其進(jìn)行了下述試驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)例1：在細(xì)胞原位水平檢測化合物na-2a是否直接靶向線粒體

a)化合物孵育

(1)選取非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株nci-h460接種于70mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長至對數(shù)生長期(細(xì)胞貼壁面積約為70％～75％)時(shí)，小心移去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，使用pbs清洗兩次，加入5ml新dmem培養(yǎng)液。

(2)稱取適量化合物na-2a儲(chǔ)液(-20℃)，加入培養(yǎng)皿中使其終濃度為5μm，作用5h，同時(shí)設(shè)置不加藥的對照組。

b)線粒體的分離

(1)作用5h后，小心移去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，使用pbs清洗兩次，用濃度為0.25％胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞。加入5mldmem培養(yǎng)基，吹散并收集貼壁細(xì)胞，在離心機(jī)上以2000rpm離心10min；

(2)棄去上清液，加1ml冰浴預(yù)冷的pbs，清洗細(xì)胞一次，2000rpm離心1min；

(3)棄去上清pbs，加入適量含pmsf的線粒體分離試劑，冰上孵育30min，定時(shí)吹散細(xì)胞，防止細(xì)胞沉淀；

(4)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)大小的玻璃勻漿器中，勻漿40次左右；

(5)將細(xì)胞勻漿轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃，1000g離心10min；

(6)小心將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在4℃，3500g離心10min；

(7)收集部分上清，在收集時(shí)注意勿觸及沉淀。小心除去剩余上清，沉淀即為分離得到的線粒體。

c)na-2a與線粒體孵育

(1)將上述步驟(b)中對照組提取的線粒體分為2份，取其中1份與5μm的na-2a充分混勻后于37℃恒溫水浴中孵育5h；

(2)孵育結(jié)束后于4℃，9000g離心10min；

(3)小心除去上清液，加入100μl線粒體儲(chǔ)存液混勻，4℃9000g離心10min；

(4)完全去除上清，沉淀即為孵育na-2a后得到的線粒體；

d)線粒體和胞漿蛋白質(zhì)的提取

(1)依據(jù)細(xì)胞胞漿的量加入100-200μlripa裂解液和pmsf混勻，冰上超聲裂解30min，每10min振蕩混勻細(xì)胞裂解液，使其充分裂解。ripa裂解液與pmsf的比例為100:1；

(2)依據(jù)線粒體量加入40～80μl線粒體裂解液和pmfs(線粒體裂解液:pmsf＝100:1)，混勻，冰上超聲裂解20min，每5min震蕩混勻細(xì)胞裂解液，使線粒體充分裂解。

(3)將胞漿和線粒體的裂解液分別移至1.5mlep管中，4℃12000rpm，離心10min；

(4)小心收集上清液，即為裂解后所得蛋白樣品，用于質(zhì)譜檢測。

e)na-2a孵育提取的胞漿和線粒體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢測

將經(jīng)步驟(d)處理所得樣品隨即進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析，結(jié)果如圖1～6所示。其中，圖1為實(shí)施例6制得的最終產(chǎn)物na-2a溶解在dmso中的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖2為細(xì)胞孵育化合物na-2a后5h胞漿蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖3為細(xì)胞孵育化合物na-2a后5h線粒體蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖4為細(xì)胞未孵育化合物na-2a胞漿蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖5為細(xì)胞未孵育化合物na-2a線粒體蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果；圖6為未經(jīng)給藥處理提取線粒體單獨(dú)孵育化合物na-2a后5h的線粒體蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果。分析結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株nci-h460中na-2a可以直接進(jìn)入線粒體中。

實(shí)驗(yàn)例2：na-2a與線粒體共定位分析

1)用75％(體積濃度)酒精浸泡處理細(xì)胞爬片專用玻璃片，將處理好的玻片置于6孔板的每個(gè)孔內(nèi)，備用。

2)選取非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株nci-h460除去原有培養(yǎng)液后，使用pbs清洗貼壁細(xì)胞，移除pbs緩沖液，加入1ml0.25％胰蛋白酶，靜置半分鐘，移除胰酶后，將培養(yǎng)置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化1min，加入新鮮培養(yǎng)液吹打貼壁細(xì)胞至細(xì)胞懸浮。

3)按每孔500μl細(xì)胞懸浮液分別加入6孔板各孔中，將孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)日，待細(xì)胞完全貼壁生長。

4)使用na-2a稀釋液(5μm)加入各孔中與細(xì)胞孵育5h，同時(shí)設(shè)置陰性對照。

5)移除培養(yǎng)液，用pbs清洗2次，每次5min。

6)每孔加入500μl預(yù)先37℃孵育30min的redcmxros線粒體紅色熒光探針儲(chǔ)液于室溫再次孵育45min。

7)除去孔中液體，用pbs清洗2次，每次5min。

8)在載玻片上滴加一滴抗熒光猝滅封片液，蓋上貼有細(xì)胞的玻片，避免出現(xiàn)氣泡，用快干膠固定封片。

9)使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光檢測。結(jié)果如圖7～8所示，其中圖7為陰性對照細(xì)胞熒光檢測結(jié)果；圖8為細(xì)胞孵育5h時(shí)熒光檢測結(jié)果。分析結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株nci-h460中na-2a同redcmxros線粒體紅色熒光探針在細(xì)胞中位置相同，說明na-2a可以直接靶向線粒體。