一組丙型流感病毒LAMP檢測(cè)用引物及其應(yīng)用的制作方法

本申請(qǐng)屬于丙型流感病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(rt-lamp)檢測(cè)丙型流感病毒時(shí)所用引物序列的專利申請(qǐng)。

背景技術(shù)：

rt-lamp技術(shù)的原理是：設(shè)計(jì)兩對(duì)引物（一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物），特異性識(shí)別靶序列中的六個(gè)結(jié)合區(qū)域，在具有置換活性的bstdna聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶amv的催化下，使rna模板在特定恒溫環(huán)境中通過(guò)循環(huán)置換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)快速、特異、靈敏地?cái)U(kuò)增，從而達(dá)到檢測(cè)病毒的目的。

rt-lamp擴(kuò)增主要分為兩個(gè)階段，第一階段為啞鈴狀擴(kuò)增始發(fā)物的形成：內(nèi)引物fip和bip除了在3’端與模板互補(bǔ)外，其5’端還可與下游擴(kuò)增產(chǎn)物中的部分序列互補(bǔ)，使得新合成的單鏈產(chǎn)物兩端可形成一個(gè)類(lèi)似啞鈴狀的環(huán)形結(jié)構(gòu)。第二價(jià)段為循環(huán)擴(kuò)增階段：以第一階段形成的啞鈴狀的環(huán)形dna為模板，進(jìn)行周而復(fù)始的擴(kuò)增和延伸，擴(kuò)增的終產(chǎn)物是具有不同長(zhǎng)度、不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的dna混合物，其在電泳后的瓊脂糖凝膠上可形成連續(xù)的梯狀條帶。

從rt-lamp的原理和特點(diǎn)可以看出，與常規(guī)基因檢測(cè)方法相比，該方法在rna病毒的檢測(cè)方面應(yīng)該有著很大的優(yōu)勢(shì)。第一，操作簡(jiǎn)單：與傳統(tǒng)pcr方法相比，該反應(yīng)是在恒溫條件下進(jìn)行的，除了使用一些常用聚合酶外，不需要特殊的儀器設(shè)備和嫻熟的實(shí)驗(yàn)技能，只需要簡(jiǎn)單的恒溫裝置（如恒溫水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱等）即可完成檢測(cè)工作。第二，快速高效：rt-lamp反應(yīng)不需要經(jīng)歷普通pcr的變性、退火、復(fù)性等復(fù)雜過(guò)程，核酸擴(kuò)增在30~60min內(nèi)即可完成，且產(chǎn)物可達(dá)到10⁹~10¹⁰水平。另外該反應(yīng)省略了單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程中，只需在同一反應(yīng)管中添加逆轉(zhuǎn)錄酶，一步反應(yīng)即可完成實(shí)驗(yàn)操作，減小了污染的機(jī)率。第三，特異性強(qiáng)：只有在四條引物完全與靶序列中的六個(gè)結(jié)合區(qū)完全匹配的情況下，擴(kuò)增反應(yīng)才能順利進(jìn)行，任何一條不匹配反應(yīng)都無(wú)法進(jìn)行，故具有極強(qiáng)的特異性。第四，靈敏度高：對(duì)于病毒核酸的擴(kuò)增模板量可低至幾個(gè)拷貝，且產(chǎn)物擴(kuò)增迅速。第五，結(jié)果判定簡(jiǎn)便：利用普通的dna電泳和紫外燈等簡(jiǎn)單設(shè)備即可判斷是否有陽(yáng)性反應(yīng)?；蛘呃萌旧珓﹉nb的藍(lán)或紫色的變換，通過(guò)肉眼即可直接觀察到陰陽(yáng)性反應(yīng)。

丙型流感病毒（influenzacvirus）自1947年首次在美國(guó)分離得到以來(lái)，在日本、英國(guó)、希臘等多國(guó)相繼發(fā)現(xiàn)，特別是日本某些地區(qū)一直在持續(xù)監(jiān)測(cè)該病毒的流行情況。丙型流感病毒為正粘病毒科、丙型流感病毒屬的唯一種，是一種單股負(fù)鏈rna病毒，由7個(gè)rna片段組成，分別為：pb2、pb1、p3、he、np、mp和ns，可編碼9種蛋白質(zhì)。與甲型和乙型流感病毒一樣，丙型流感病毒也能夠普遍感染人群，引起發(fā)熱、流涕、咳嗽等感冒癥狀。

國(guó)外流行病學(xué)及血清學(xué)研究表明，丙型流感病毒對(duì)人的感染通常發(fā)生在兒童期，從1歲起血清陽(yáng)性百分率會(huì)隨著年齡逐漸增加，在20~30歲左右達(dá)到最高水平。我國(guó)郭元吉教授曾于1981年和1982年在豬群中分離到2株丙型流感病毒，破除了最初人們認(rèn)為人是丙型流感病毒的唯一自然宿主的說(shuō)法。但到目前為止沒(méi)有關(guān)于丙型流感病毒在中國(guó)人群中流行情況和感染狀況的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。

為了填補(bǔ)目前對(duì)丙型流感病毒監(jiān)測(cè)的空白，需要建立針對(duì)該病毒快速靈敏高效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。目前丙型流感病毒的檢測(cè)方法有病毒分離、單克隆抗體、rt-pcr、實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr等。丙型流感病毒可通過(guò)雞胚分離或通過(guò)犬腎細(xì)胞（mdck細(xì)胞）、人惡性黑色素瘤細(xì)胞株（hmv-ii細(xì)胞）分離，但是病毒分離難度較大、分離時(shí)間較長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際工作中高通量高效率的要求。常用的核酸和抗體檢測(cè)方法所需試劑和儀器的成本相對(duì)較高。因此，利用rt-lamp檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、成本較低、快速高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果可視的特點(diǎn)，如何建立針對(duì)丙型流感病毒的rt-lamp檢測(cè)方法，對(duì)于進(jìn)行大規(guī)模流行病學(xué)研究和感染狀況監(jiān)測(cè)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一組針對(duì)丙型流感病毒的、rt-lamp檢測(cè)用引物序列，并以此序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了檢測(cè)用試劑盒及丙型流感的rt-lamp檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案詳述如下。

一組丙型流感病毒lamp檢測(cè)用引物，包括外引物對(duì)inf-cf3/inf-cb3、內(nèi)引物對(duì)ifn-cfip/ifn-cbip兩對(duì)引物，引物序列如seqidno.1~4所示，具體如下：

inf-cf3：5’-ccaaataatggaaatggttgaag-3’，

inf-cb3：5’-tcttctccaaggccagta-3’；

ifn-cfip：5’-tctcaaccaagctgtgattgttc-tacgatcacccaaacgacta-3’，

ifn-cbip：5’-gagtaatgtctcagaaagtggaaga-tcgttcattgctgtgctg-3’。

利用所述丙型流感病毒lamp檢測(cè)用引物所制備的rt-lamp檢測(cè)用試劑盒，由如下組分構(gòu)成：

（1）rna提取液：trizol和rna酶抑制劑，

（2）反應(yīng)混合液：

包括bstdna聚合酶緩沖液，bstdna聚合酶，amv反轉(zhuǎn)錄酶，dntp，betaine（甜菜堿），mgcl2溶液，inf-cf3引物，inf-cb3引物，inf-cfip引物，inf-cbip引物，depc處理水，

（3）染色劑：染色劑hnb（羥基萘酚藍(lán)），

（4）陽(yáng)性對(duì)照樣品：重組質(zhì)粒inf-cpmd，所述重組質(zhì)粒inf-cpmd，其制備方法為，利用inf-cf3、inf-cb3為引物對(duì)，對(duì)丙型流感病毒rna樣品進(jìn)行rt-pcr，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pmd18-t載體連接構(gòu)建獲得；

（5）depc處理水。

需要解釋的是，所述重組質(zhì)粒inf-cpmd，其制備過(guò)程中相關(guān)具體操作按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行操作即可。

所述rt-lamp檢測(cè)用試劑盒，25次檢測(cè)用量各成分比例如下：

（1）rna提取液：trizol，25ml，rna酶抑制劑25μl；

（2）反應(yīng)混合液：

bstdna聚合酶緩沖液，（10×）、62.5μl；

bstdna聚合酶，8u/μl、25μl；

amv反轉(zhuǎn)錄酶，10u/μl、25μl；

dntp，10mm、62.5μl；

betaine（甜菜堿），25mm、25μl；

mgcl2溶液，150mm、25μl；

inf-cf3引物，5μm、25μl；

inf-cb3引物，5μm、25μl；

inf-cfip引物，10μm、25μl；

inf-cbip引物，10μm、25μl；

depc處理水，500μl；

（3）染色劑：染色劑hnb（羥基萘酚藍(lán)），5mm、25μl；

（4）陽(yáng)性對(duì)照樣品：重組質(zhì)粒inf-cpmd，0.1ng/μl、20μl；

（5）depc處理水，1ml。

需要解釋的是，試劑盒中相關(guān)試劑產(chǎn)品可由相關(guān)生物制劑公司中現(xiàn)有產(chǎn)品中選擇應(yīng)用，例如：neb公司的bstdna聚合酶，promega公司的rna酶抑制劑、dntp、amv反轉(zhuǎn)錄酶等。

利用所述rt-lamp檢測(cè)用試劑盒的丙型流感病毒的rt-lamp檢測(cè)方法，具體包括如下步驟：

（1）獲取待檢測(cè)樣品的rna樣本，具體操作為：將待測(cè)樣品（例如疑似患者的咽拭子）浸入到300μl無(wú)菌生理鹽水中，震蕩擠壓；

在獲得的液體中加1ml的trizol，充分混勻；

隨后加200μl氯仿，混勻并靜置5min，然后10000rpm離心5min；取上清置于等體積的冰的（0℃左右）異丙醇中，-20℃放置1小時(shí)，再10000rpm離心5min獲取沉淀；

沉淀用無(wú)水乙醇洗一次，陰干后加入10μl的depc處理水溶解備用；

（2）rt-lamp反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，

25μl反應(yīng)液的體積配比參考設(shè)計(jì)如下：

反應(yīng)混合液，22μl；

步驟（1）中待測(cè)樣品的rna樣本，3μl；

將反應(yīng)液1000rpm短暫（30s左右）離心以使反應(yīng)液混合均勻；

然后置于65℃水浴中90min，隨后80℃滅活5min；

以相同操作方式以陽(yáng)性對(duì)照樣品替代待測(cè)樣品的rna樣本進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)；

（3）結(jié)果判定：采用如下兩種方式之一進(jìn)行結(jié)果判定

a、凝膠電泳方式：對(duì)步驟（2）中rt-lamp反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，100v電泳30min，電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察電泳條帶，若出現(xiàn)階梯狀條帶，則視為丙型流感病毒檢測(cè)陽(yáng)性，否則，視為陰性；

b、顏色觀察方式：步驟（2）中rt-lamp反應(yīng)開(kāi)始前，在反應(yīng)體系中加入1μl的hnb染料，反應(yīng)結(jié)束后，觀察試管顏色，如果呈現(xiàn)藍(lán)色表示樣品陽(yáng)性，感染有丙型流感病毒，如果呈現(xiàn)紫色，表示樣品陰性，不含有丙型流感病毒。

通過(guò)對(duì)現(xiàn)有rna病毒檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)和完善，相較于現(xiàn)有丙型流感病毒檢測(cè)技術(shù)，本發(fā)明具有簡(jiǎn)便、快速、高效、靈敏等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在一下幾個(gè)方面：

1、具有極強(qiáng)的特異性：只有在四條引物完全與靶序列中的六個(gè)結(jié)合區(qū)完全匹配的情況下，擴(kuò)增反應(yīng)才能順利進(jìn)行；

2、便于操作：由于擴(kuò)增反應(yīng)是在恒溫條件下進(jìn)行的，無(wú)需pcr儀等昂貴儀器，只需要簡(jiǎn)單的恒溫裝置即可完成檢測(cè)工作，降低了對(duì)硬件設(shè)備的要求，易于推廣應(yīng)用；

3、反應(yīng)穩(wěn)定可靠：由于擴(kuò)增反應(yīng)不需要經(jīng)歷核酸的變復(fù)性過(guò)程和單獨(dú)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只需一步就可完成實(shí)驗(yàn)操作，既縮短了反應(yīng)所需的時(shí)間，又減少了rna酶和擴(kuò)增核酸污染的機(jī)率；

4、靈敏度較高：能夠快速擴(kuò)增模板量低至幾個(gè)拷貝的病毒核酸，具有較好靈敏度；

5、易于觀察和判定結(jié)果：根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)體系顏色，用肉眼即可直觀判定樣品是否為陽(yáng)性。

總體而言，基于現(xiàn)有環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(rt-lamp)原理，本發(fā)明首次將其應(yīng)用于丙型流感病毒檢測(cè)應(yīng)用中，應(yīng)用范圍廣泛，既可人用，也可獸用，具有操作流程一致度高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于丙型流感病毒檢測(cè)及預(yù)防體系的建立具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為特異性驗(yàn)證中電泳檢測(cè)結(jié)果，其中：m為電泳dnamarker；“甲”為甲型流感rna樣本；“乙”為乙型流感rna樣本；“丙”為丙型流感rna樣本；

圖2為特異性驗(yàn)證中的可視法結(jié)果；其中“甲”為甲型流感rna樣本；“乙”為乙型流感rna樣本；“丙”為丙型流感rna樣本；

圖3為敏感性驗(yàn)證中的電泳檢測(cè)結(jié)果；其中m為電泳dnamarker；1~5依次對(duì)應(yīng)5pg/μl、0.5pg/μl、0.05pg/μl、0.005pg/μl和0pg/μl的樣本濃度；0pg/μl的樣本濃度是用depc處理水代替rna樣本獲得；

圖4為敏感性驗(yàn)證中的可視法觀測(cè)的結(jié)果；其中1~5依次對(duì)應(yīng)5pg/μl、0.5pg/μl、0.05pg/μl、0.005pg/μl和0pg/μl的樣本濃度；0pg/μl的樣本濃度是用depc處理水代替rna樣本獲得；

圖5為敏感性驗(yàn)證中現(xiàn)有技術(shù)rt-pcr敏感性檢測(cè)結(jié)果；其中m為dnamarker，1~5依次對(duì)應(yīng)5pg/μl、0.5pg/μl、0.05pg/μl、0.005pg/μl和0pg/μl的樣本濃度；0pg/μl的樣本濃度是用depc處理水代替rna樣本獲得。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中涉及部分生物材料、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備等情況簡(jiǎn)要介紹如下。

生物材料：

丙型流感陽(yáng)性樣品，甲型、乙型、丙型流感待檢樣品（鼻咽拭子樣品），均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提供，其中待檢樣品為從湖南、河南、山東等地收集的樣本中所隨機(jī)挑選出來(lái)樣本；

pmd18-t載體，takara公司；

引物由華大基因公司合成提供；

實(shí)驗(yàn)試劑：

bstdna聚合酶、bstdna聚合酶緩沖液，neb公司；

rna酶抑制劑、dntp、amv反轉(zhuǎn)錄酶等，promega公司；

depc處理水，購(gòu)自江萊生物；

betaine（甜菜堿），購(gòu)自newenglandbiolabs公司；

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

分光光度計(jì)nano-200，杭州奧盛儀器有限公司；

pcr儀abi9700，美國(guó)appliedbiosystems公司；

實(shí)施例1

借助alignx和軟件primerexplorer4.0（http://primerexplorer.jp/e/），發(fā)明人選擇丙型流感病毒的mp基因的相對(duì)保守區(qū)（genbank:d26546.1），分別設(shè)計(jì)了四條引物，其中包括兩條外引物（inf-cf3、inf-cb3），兩條內(nèi)引物（inf-cfip、inf-cbip），以此作為丙型流感病毒lamp檢測(cè)用引物，引物序列如seqidno.1~4所示，具體如下：

inf-cf3：5’-ccaaataatggaaatggttgaag-3’，

inf-cb3：5’-tcttctccaaggccagta-3’；

ifn-cfip：5’-tctcaaccaagctgtgattgttc-tacgatcacccaaacgacta-3’，

ifn-cbip：5’-gagtaatgtctcagaaagtggaaga-tcgttcattgctgtgctg-3’。

實(shí)施例2

利用實(shí)施例1所設(shè)計(jì)的丙型流感病毒lamp檢測(cè)用引物制備了rt-lamp檢測(cè)用試劑盒，25次劑量各組份配比設(shè)計(jì)如下：

（1）rna提取液：trizol，25ml，rna酶抑制劑25μl；

（2）反應(yīng)混合液：

bstdna聚合酶緩沖液，（10×）、62.5μl；

bstdna聚合酶，8u/μl、25μl；

amv反轉(zhuǎn)錄酶，10u/μl、25μl；

dntp，10mm、62.5μl；

betaine（甜菜堿），25mm、25μl；

mgcl2溶液，150mm、25μl；

inf-cf3引物，5μm、25μl；

inf-cb3引物，5μm、25μl；

inf-cfip引物，10μm、25μl；

inf-cbip引物，10μm、25μl；

depc處理水，500μl；

（3）染色劑：染色劑hnb（羥基萘酚藍(lán)），5mm、25μl；

（4）陽(yáng)性對(duì)照樣品：重組質(zhì)粒inf-cpmd，0.1ng/μl、20μl；

（5）depc處理水，1ml。

需要解釋的是，試劑盒中相關(guān)試劑產(chǎn)品可由相關(guān)生物制劑公司中現(xiàn)有產(chǎn)品中選擇應(yīng)用，例如：neb公司的bstdna聚合酶，promega公司的rna酶抑制劑、dntp、amv反轉(zhuǎn)錄酶等，亦可選用其他公司產(chǎn)品，根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格對(duì)溶劑體系進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整即可；

需要解釋的是，本實(shí)施例中所用引物inf-cf3、inf-cb3、inf-cfip、inf-cbip由華大基因公司合成提供。

還需解釋的是，所述重組質(zhì)粒inf-cpmd，其制備過(guò)程中相關(guān)具體操作按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行操作即可。具體可參考如下制作過(guò)程。

首先，參照trizol試劑的說(shuō)明，從確定的丙型流感患者的鼻咽拭子中獲得病毒rna樣本，利用inf-cf3、inf-cb3引物對(duì)進(jìn)行rt-pcr，獲取目的片段；

rt-pcr反應(yīng)分為兩步，具體過(guò)程為：

rt反應(yīng)過(guò)程中，20μl反應(yīng)體系設(shè)計(jì)如下：

rt緩沖液（5×），4.0μl；

dntp，10mmol/l、1.0μl；

隨機(jī)引物，10μm、2.0μl；

rna酶抑制劑，1.0μl；

逆轉(zhuǎn)錄酶，5u/μl、1.0μl；

rna模板，3.0μl；

depc處理水，8.0μl；

反應(yīng)條件為，70℃、5min，42℃、30min，95℃、2min；反應(yīng)產(chǎn)物立即進(jìn)行后續(xù)pcr反應(yīng)或者-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

pcr反應(yīng)時(shí)，100μl反應(yīng)體系設(shè)計(jì)如下：

pcr緩沖液（10×），10μl；

dntp，10mm、5μl；

inf-cf3/inf-cb3混合引物，5μm、2μl；

taqdna聚合酶，5u/μl、1μl；

cdna模板，2μl；

depc處理水，80μl；

反應(yīng)條件為：95℃、2min預(yù)變性；94℃、30秒，56℃、30秒，72℃、30秒，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min；擴(kuò)增樣本直接使用或者置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其次，將上述rt-pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物與pmd18-t載體進(jìn)行連接。

最后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選、鑒定正確重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將正確重組質(zhì)粒保存?zhèn)溆眉纯伞?/p>

相關(guān)過(guò)程采用商品化試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體操作參考對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作即可，不再贅述。

實(shí)施例3

利用實(shí)施例2所制備的rt-lamp檢測(cè)用試劑盒的丙型流感病毒的rt-lamp檢測(cè)方法，具體包括如下步驟。

（1）獲取待檢測(cè)樣品的rna樣本，具體操作為：將待測(cè)樣品浸入到300μl無(wú)菌生理鹽水中，震蕩擠壓；在獲得的液體中加1ml的trizol，充分混勻；

隨后加200μl氯仿，混勻并靜置5min，然后10000rpm離心5min；取上清置于等體積的冰的（0℃左右）異丙醇中，-20℃放置1小時(shí)，再10000rpm離心5min獲取沉淀；

沉淀用無(wú)水乙醇洗一次，陰干后加入10μl的depc處理水溶解備用；

（2）rt-lamp反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，

25μl反應(yīng)液的體積配比參考設(shè)計(jì)如下：

反應(yīng)混合液，22μl；

步驟（1）中待測(cè)樣品的rna樣本，3μl；

所述22μl反應(yīng)混合液配方為：

bstdna聚合酶緩沖液，（10×）、2.5μl；

bstdna聚合酶，8u/μl、1μl；

amv反轉(zhuǎn)錄酶，10u/μl、1μl；

dntp，10mm、2.5μl；

betaine（甜菜堿），25mm、1μl；

mgcl2溶液，150mm、1μl；

inf-cf3引物，5μm、1μl；

inf-cb3引物，5μm、1μl；

inf-cfip引物，10μm、1μl；

inf-cbip引物，10μm、1μl；

depc處理水，9μl。

將反應(yīng)液1000rpm短暫離心（30秒左右）以使反應(yīng)液混合均勻；

然后置于65℃水浴中90min，隨后80℃滅活5min。

以相同操作方式以陽(yáng)性對(duì)照樣品替代待測(cè)樣品的rna樣本（即，以3μl陽(yáng)性質(zhì)粒替代待測(cè)樣品的rna樣本）進(jìn)行rt-lamp反應(yīng)；

（3）結(jié)果判定：采用如下兩種方式之一進(jìn)行結(jié)果判定

a、凝膠電泳方式：取步驟（2）中rt-lamp反應(yīng)產(chǎn)物5μl，進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，100v電泳30min，電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察電泳條帶，若出現(xiàn)階梯狀條帶，則視為丙型流感病毒檢測(cè)陽(yáng)性，否則，視為陰性；

b、顏色觀察方式：步驟（2）中rt-lamp反應(yīng)開(kāi)始前，在反應(yīng)體系中加入1μl的hnb染料，反應(yīng)結(jié)束后，觀察試管顏色，如果呈現(xiàn)藍(lán)色表示樣品陽(yáng)性，感染有丙型流感病毒，如果呈現(xiàn)紫色，表示樣品陰性，不含有丙型流感病毒。

特異性驗(yàn)證：

分別取甲型流感、乙型流感和丙型流感樣本各一份，按照上述步驟進(jìn)行操作，對(duì)rt-lamp反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖1所示，顏色結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，丙型流感樣本可見(jiàn)階梯狀的電泳條帶，顯示為陽(yáng)性；而其他兩型沒(méi)有，顯示為陰性。這一結(jié)果表明，該方法具有較好地特異性。

敏感性檢測(cè)：

取丙型流感樣本一份，利用分光光度計(jì)對(duì)所得rna樣品進(jìn)行計(jì)量，隨后進(jìn)行系列稀釋，最終形成5pg/μl、0.5pg/μl、0.05pg/μl、0.005pg/μl四個(gè)梯度濃度，按照上述步驟進(jìn)行檢測(cè)，以檢測(cè)反應(yīng)的敏感度。檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4所示。從圖中可以看出，檢測(cè)敏感度最低為0.05pg/μl，也即總量為0.15pg的rna樣本仍然可被準(zhǔn)確檢出（需要注意的是，上述敏感度是采用實(shí)施例2的試劑盒所得結(jié)果）。

采用同樣樣品濃度的rna樣品，按照現(xiàn)有的rt-pcr兩步法進(jìn)行檢測(cè)，引物采用inf-cf3、ifn-cb3。結(jié)果顯示（如圖5所示），在樣本濃度為0.05pg/μl，也即總含量為0.15pg的病毒rna時(shí)，rt-pcr的條帶就已經(jīng)看不見(jiàn)。此結(jié)果表明，本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法，其敏感度較現(xiàn)有rt-pcr法最少超過(guò)10倍。

臨床樣本陽(yáng)性率檢測(cè)對(duì)比

對(duì)流感季節(jié)收集的425份具有流感癥狀的臨床咽拭子樣本，分別按照上述方法和現(xiàn)有rt-pcr法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下表所示：

。

從上表可以看出，rt-lamp方法患者丙型流感病毒陽(yáng)性8例，而常規(guī)rt-pcr方法檢測(cè)到5份陽(yáng)性。說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)的rt-pcr法，可以用于臨床檢驗(yàn)。

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<110>河南昂睿生物科技有限公司

<120>一組丙型流感病毒lamp檢測(cè)用引物及其應(yīng)用

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