一種利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法與流程

本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法。

背景技術(shù)：

十八碳四烯酸(18:4n-3)(SA)是一種重要的ω-3系列多不飽和脂肪酸(Δ6,9,12,15-全順式-十八碳四烯酸)，作為EPA的前體物質(zhì)，SA在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化效率比花生四烯酸高很多，具有輔助降低體內(nèi)膽固醇和甘油三酯的含量，促進(jìn)體內(nèi)飽和脂肪酸代謝的作用，從而降低血液粘稠度，增進(jìn)血液循環(huán)，提高組織供氧而消除疲勞。防止脂肪在血管壁的沉積，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展、預(yù)防腦血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病。目前SA主要來源于植物油(高SA大豆油)以及微藻。大豆來源主要存在SA相對(duì)含量低，受地域限制等諸多問題，從而導(dǎo)致氣味不良、純化成本高等。相反，微生物油脂(Single Cell Oils，SCO)不但容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，同時(shí)還克服了傳統(tǒng)高SA大豆存在受地域和氣候條件制約的問題，應(yīng)用前景廣闊。

鹽生紅胞藻(Rhodomonas salin or R.salina)屬Pyrenomonadaceae家族成員，為有鞭毛的單細(xì)胞紅藻。由于其富含長碳鏈多不飽和脂肪酸和天然色素-藻紅蛋白，R.salina已被視為一個(gè)極具潛力的資源藻種，在食品、化妝品、醫(yī)藥、科學(xué)研究以及水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面應(yīng)用廣泛。R.salina合成的多不飽和脂肪酸十八碳四烯酸(SA,18:4n-3)和α-亞麻酸(ALA 18:3n-3)分別占胞內(nèi)總脂肪的20–30.2％和20.7–29.9％。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請(qǐng)的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡化或省略以避免使本部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。

鑒于上述和/或現(xiàn)有利用鹽生紅胞藻(R.salina)生產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法存在的問題，提出了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的是提供一種利用不同波長和強(qiáng)度光源自養(yǎng)發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)生產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法，大幅度提高了鹽生紅胞藻(R.salina)生產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的效率，從而降低了生產(chǎn)成本。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法，包括，利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)鹽生紅胞藻；將鹽生紅胞藻接種到人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基，利用不同波長和強(qiáng)度的光培養(yǎng)鹽生紅胞藻。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述種子培養(yǎng)基包括甘油、Na₂EDTA、H₃BO₃、FeCl₃、MnSO₄、ZnSO₄、CoCl₂、HCl、HEPES bufferpH 7.8、Vitamin B₁₂中的一種或幾種。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述種子培養(yǎng)基包括占培養(yǎng)基質(zhì)量10％的甘油、Na₂EDTA·2H₂O 80mM、H₃BO₃2mM、FeCl₃·6H₂O 5.02mM、MnSO₄·H₂O 0.01mM、ZnSO₄·7H₂O 0.001mM、CoCl₂·6H₂O 0.001mM、HCl 0.1M、HEPES buffer pH 7.8、Vitamin B₁₂ 0.3g/L。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基包括NaCl、MgSO₄·7H₂O、KCl、NaNO₃、CaCl₂·2H₂O、KH₂PO₄、Tricine pH 7.8、NH₄Cl、Na₂EDTA·2H₂O、H₃BO₃、FeCl₃·6H₂O、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、CoCl₂·6H₂O、HCl、HEPES bufferpH 7.8或Vitamin B₁₂中的一種或幾種。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)鹽生紅胞藻，其是將鹽生紅胞藻以10～50％的接種量接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為21～30℃、100～200rpm下培養(yǎng)40～50h。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述利用不同波長和強(qiáng)度的光培養(yǎng)，其是利用不同波長和強(qiáng)度的光在溫度為21～30℃，pH值為5～9，通氣速率為0.01～10m³·min^-1，光照強(qiáng)度50～500為μmol m^-2s^-1的條件下，培養(yǎng)5～14天。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述利用不同波長和強(qiáng)度的光，其中，所述光包括紅光、藍(lán)光、紅藍(lán)混合光，其與發(fā)酵培養(yǎng)基液面的距離為15～30cm。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述紅藍(lán)混合光，其混合比例為藍(lán)光：紅光＝1:0.1～10。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述紅藍(lán)混合光，其混合比例為藍(lán)光：紅光＝1:1～5。

作為本發(fā)明所述利用鹽生紅胞藻產(chǎn)藻紅蛋白和多不飽和脂肪酸的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述紅光，其波長為590～670nm，波峰為640nm；所述藍(lán)光，其波長420～510nm，波峰為460nm。

本發(fā)明具有的有益效果：

本發(fā)明提升了鹽生紅胞藻(R.salina)發(fā)酵時(shí)菌體的生長速度、生物量、底物利用率、藻紅蛋白，總蛋白、多不飽和脂肪酸和總脂含量，生長速度提升3倍以上，藻紅蛋白增加8倍以上，總多不飽和脂肪酸增加4倍以上，生物量增加7倍以上，減少了鹽生紅胞藻(R.salina)收獲的問題，降低了生物質(zhì)濃縮以及目的產(chǎn)物提取的前處理成本。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：

圖1是本發(fā)明中不同強(qiáng)度白光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)生長情況示意圖；

圖2是本發(fā)明中不同強(qiáng)度白光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)藻紅蛋白合成情況示意圖；

圖3是本發(fā)明中不同強(qiáng)度紅光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)生長情況示意圖；

圖4是本發(fā)明中不同強(qiáng)度紅光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)藻紅蛋白合成情況示意圖；

圖5是本發(fā)明中不同強(qiáng)度藍(lán)光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)生長情況示意圖；

圖6是本發(fā)明中不同強(qiáng)度藍(lán)光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)藻紅蛋白合成情況示意圖；

圖7是本發(fā)明中不同強(qiáng)度紅藍(lán)混合光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)生長情況示意圖；

圖8是本發(fā)明中不同強(qiáng)度紅藍(lán)混合光照射條件發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)藻紅蛋白合成情況示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說明。

在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。

其次，此處所稱的“一個(gè)實(shí)施例”或“實(shí)施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個(gè)實(shí)施例中”并非均指同一個(gè)實(shí)施例，也不是單獨(dú)的或選擇性的與其他實(shí)施例互相排斥的實(shí)施例。

實(shí)施例1：

鹽生紅胞藻(R.salina)種子培養(yǎng)基：

鹽生紅胞藻來源海水、甘油10％、Na₂EDTA·2H₂O 80mM、H₃BO₃ 2mM、FeCl₃·6H₂O 5.02mM、MnSO₄·H₂O 0.01mM、ZnSO₄·7H₂O 0.001mM、CoCl₂·6H₂O 0.001mM、Na₂EDTA·2H₂O 50mM、HCl 0.1M、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂ 0.3g/L。

種子培養(yǎng)兩代，每代在裝液量50mL/250mL三角瓶中進(jìn)行，接種量20％(V/V)，23℃、120rpm下?lián)u床培養(yǎng)48h。第二代種子按20％(V/V)的接種量接入裝液量400mL/600mL爆氣式反應(yīng)器中，反應(yīng)器中為人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基，白光強(qiáng)度50～350μmol m^-2s^-1，發(fā)酵條件為23℃、通氣速率為0.1m³·min，發(fā)酵10天。

人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基成分為，NaCl 310mM、MgSO₄·7H₂O 10mM、KCl 8mM、NaNO₃12mM、CaCl₂·2H₂O 2mM、KH₂PO₄0.37mM、Tricine pH 7.8 25mM、NH₄Cl0.5mM、Na₂EDTA·2H₂O 0.27mM、H₃BO₃1.84mM、FeCl₃·6H₂O0.018mM、MnSO₄·H₂O0.097mM、ZnSO₄·7H₂O0.007mM、CoCl₂·6H₂O0.002mM、HCl0.1mM、FeCl₃·6H₂O3mM、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂0.13g/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示：

結(jié)果表明：

白光強(qiáng)度150μmol·m^-2·s^-1發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)，8天達(dá)最大生物量6.71×106個(gè)/mL，藻紅蛋白達(dá)到14.97mg/L，底物利用率為60.5％。總脂占干重8.56％，SA占總脂肪酸27.78％。

其中，總脂肪酸及總脂的測(cè)定如下，

總脂肪酸的提?。簩⒗鋬龈稍锖蟮募?xì)胞研磨均勻，精確稱取約1.00g加入7mL 20％HCl，75℃水浴震蕩60min。然后用20mL正己烷分三次提取脂質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶后，用氮?dú)獯党龤埩羧軇?。稱重并計(jì)算總脂含量。

總脂含量(％)＝m₁/m₂*100％

式中，m₁代表稱重得到總脂質(zhì)量(g)，m₂代表用于脂質(zhì)提取的凍干菌絲體質(zhì)量(g)。

脂肪酸組成的測(cè)定：毛細(xì)管柱(CP Sil-88:50.0m×250μm×0.20μm)，氮?dú)庾鳛檩d氣，F(xiàn)ID為檢測(cè)器。進(jìn)樣口的溫度為250℃，每次進(jìn)樣體積為1μL。柱溫條件：80℃持續(xù)2min，然后以10℃/min速度升溫到120℃，再以5℃/min升溫到180℃，持續(xù)2min，以2℃/min升溫到230℃，最后230℃持續(xù)5min。以歸一化法計(jì)算總脂中各脂肪酸的百分含量。

白光強(qiáng)度低于350μmol m^-2s^-1時(shí)，鹽生紅胞藻(R.salina)生物量、總脂含量高以及藻紅蛋白均與光照強(qiáng)度成正比，白光強(qiáng)度高于350μmol m^-2s^-1時(shí)會(huì)抑制鹽生紅胞藻(R.salina)的生長，尤其是藻紅蛋白的合成。

實(shí)施例2：

鹽生紅胞藻(R.salina)種子培養(yǎng)基：

鹽生紅胞藻來源海水、甘油10％、Na₂EDTA·2H₂O 80mM、H₃BO₃ 2mM、FeCl₃·6H₂O 5.02mM、MnSO₄·H₂O 0.01mM、ZnSO₄·7H₂O 0.001mM、CoCl₂·6H₂O 0.001mM、Na₂EDTA·2H₂O 50mM、HCl 0.1M、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂ 0.3g/L。

種子培養(yǎng)兩代，每代在裝液量50mL/250mL三角瓶中進(jìn)行，接種量20％(V/V)，23℃、120rpm下?lián)u床培養(yǎng)48h。第二代種子按20％(V/V)的接種量接入裝液量400mL/600mL爆氣式反應(yīng)器中，反應(yīng)器中為人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基，紅光強(qiáng)度50～350μmol m^-2s^-1，發(fā)酵條件為23℃、通氣速率為0.1m³·min^-1，發(fā)酵10天。其中，紅光的波長為590～670nm，波峰為640nm。

人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基成分為，NaCl 310mM、MgSO₄·7H₂O 10mM、KCl 8mM、NaNO₃12mM、CaCl₂·2H₂O 2mM、KH₂PO₄0.37mM、Tricine pH 7.8 25mM、NH₄Cl0.5mM、Na₂EDTA·2H₂O 0.27mM、H₃BO₃1.84mM、FeCl₃·6H₂O0.018mM、MnSO₄·H₂O0.097mM、ZnSO₄·7H₂O0.007mM、CoCl₂·6H₂O0.002mM、HCl0.1mM、FeCl₃·6H₂O3mM、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂0.13g/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示：

結(jié)果表明：

紅光強(qiáng)度250μmol m^-2s^-1發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)，10天達(dá)最大生物量1.31×10⁷個(gè)/mL。紅光強(qiáng)度150μmol m^-2s^-1發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)9天時(shí)藻紅蛋白達(dá)到37.60mg/L，底物利用率為75.5％。紅光強(qiáng)度350μmol m^-2s^-1發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)10天時(shí)總脂占干重11.12％，SA占總脂肪酸30.00％左右。

其中，總脂肪酸及總脂的測(cè)定如下，

總脂肪酸的提?。簩⒗鋬龈稍锖蟮募?xì)胞研磨均勻，精確稱取約1.00g加入7mL 20％HCl，75℃水浴震蕩60min。然后用20mL正己烷分三次提取脂質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶后，用氮?dú)獯党龤埩羧軇?。稱重并計(jì)算總脂含量。

總脂含量(％)＝m₁/m₂*100％

式中，m₁代表稱重得到總脂質(zhì)量(g)，m₂代表用于脂質(zhì)提取的凍干菌絲體質(zhì)量(g)。

脂肪酸組成的測(cè)定：毛細(xì)管柱(CP Sil-88:50.0m×250μm×0.20μm)，氮?dú)庾鳛檩d氣，F(xiàn)ID為檢測(cè)器。進(jìn)樣口的溫度為250℃，每次進(jìn)樣體積為1μL。柱溫條件：80℃持續(xù)2min，然后以10℃/min速度升溫到120℃，再以5℃/min升溫到180℃，持續(xù)2min，以2℃/min升溫到230℃，最后230℃持續(xù)5min。以歸一化法計(jì)算總脂中各脂肪酸的百分含量。

紅光強(qiáng)度低于50μmol m^-2s^-1時(shí)，鹽生紅胞藻(R.salina)生物量、總脂含量高以及藻紅蛋白合成均受到抑制。

實(shí)施例3：

鹽生紅胞藻(R.salina)種子培養(yǎng)基：

鹽生紅胞藻來源海水、甘油10％、Na₂EDTA·2H₂O 80mM、H₃BO₃ 2mM、FeCl₃·6H₂O 5.02mM、MnSO₄·H₂O 0.01mM、ZnSO₄·7H₂O 0.001mM、CoCl₂·6H₂O 0.001mM、Na₂EDTA·2H₂O 50mM、HCl 0.1M、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂ 0.3g/L。

種子培養(yǎng)兩代，每代在裝液量50mL/250mL三角瓶中進(jìn)行，接種量20％(V/V)，23℃、120rpm下?lián)u床培養(yǎng)48h。第二代種子按20％(V/V)的接種量接入裝液量400mL/600mL爆氣式反應(yīng)器中，反應(yīng)器中為人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基，藍(lán)光強(qiáng)度50～350μmol m^-2s^-1，發(fā)酵條件為23℃、通氣速率為0.1m³·min^-1，發(fā)酵10天。其中，藍(lán)光的波長為420～510nm，波峰為460nm。

人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基成分為，NaCl 310mM、MgSO₄·7H₂O 10mM、KCl 8mM、NaNO₃12mM、CaCl₂·2H₂O 2mM、KH₂PO₄0.37mM、Tricine pH 7.8 25mM、NH₄Cl0.5mM、Na₂EDTA·2H₂O 0.27mM、H₃BO₃1.84mM、FeCl₃·6H₂O0.018mM、MnSO₄·H₂O0.097mM、ZnSO₄·7H₂O0.007mM、CoCl₂·6H₂O0.002mM、HCl0.1mM、FeCl₃·6H₂O3mM、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂0.13g/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6所示：

結(jié)果表明：

藍(lán)光對(duì)鹽生紅胞藻中的天線色素的激發(fā)更加有效，從而提升葉綠體的轉(zhuǎn)化效率，為細(xì)胞提供更多的能量。藍(lán)光強(qiáng)度250μmol m^-2s^-1發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)，10天達(dá)最大生物量1.22×10⁷個(gè)/mL，底物利用率為75.8％。藻紅蛋白達(dá)到49.60mg/L，總脂占干重12.32％，SA占總脂肪酸31.15％。

其中，總脂肪酸及總脂的測(cè)定如下，

總脂肪酸的提?。簩⒗鋬龈稍锖蟮募?xì)胞研磨均勻，精確稱取約1.00g加入7mL 20％HCl，75℃水浴震蕩60min。然后用20mL正己烷分三次提取脂質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶后，用氮?dú)獯党龤埩羧軇?。稱重并計(jì)算總脂含量。

總脂含量(％)＝m₁/m₂*100％

式中，m₁代表稱重得到總脂質(zhì)量(g)，m₂代表用于脂質(zhì)提取的凍干菌絲體質(zhì)量(g)。

脂肪酸組成的測(cè)定：毛細(xì)管柱(CP Sil-88:50.0m×250μm×0.20μm)，氮?dú)庾鳛檩d氣，F(xiàn)ID為檢測(cè)器。進(jìn)樣口的溫度為250℃，每次進(jìn)樣體積為1μL。柱溫條件：80℃持續(xù)2min，然后以10℃/min速度升溫到120℃，再以5℃/min升溫到180℃，持續(xù)2min，以2℃/min升溫到230℃，最后230℃持續(xù)5min。以歸一化法計(jì)算總脂中各脂肪酸的百分含量。

藍(lán)光強(qiáng)度低于50μmol m^-2s^-1或高于250μmol m^-2s^-1時(shí)，鹽生紅胞藻(R.salina)生物量、總脂含量高以及藻紅蛋白合成均受到抑制。

實(shí)施例4：

鹽生紅胞藻(R.salina)種子培養(yǎng)基：

鹽生紅胞藻來源海水、甘油10％、Na₂EDTA·2H₂O 80mM、H₃BO₃ 2mM、FeCl₃·6H₂O 5.02mM、MnSO₄·H₂O 0.01mM、ZnSO₄·7H₂O 0.001mM、CoCl₂·6H₂O 0.001mM、Na₂EDTA·2H₂O 50mM、HCl 0.1M、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂ 0.3g/L。

種子培養(yǎng)兩代，每代在裝液量50mL/250mL三角瓶中進(jìn)行，接種量20％(V/V)，23℃、120rpm下?lián)u床培養(yǎng)48h。第二代種子按20％(V/V)的接種量接入裝液量400mL/600mL爆氣式反應(yīng)器中，反應(yīng)器中為人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基，紅藍(lán)混合光強(qiáng)度50～350μmol m^-2s^-1，發(fā)酵條件為23℃、通氣速率為0.1m³·min^-1，發(fā)酵10天。其中，藍(lán)光的波長為420～510nm，波峰為460nm。其中，紅光的波長為590～670nm，波峰為640nm。混合光中，藍(lán)光與紅光的比例為1:3。光源與發(fā)酵培養(yǎng)基液面的距離為15cm。

人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基成分為，NaCl 310mM、MgSO₄·7H₂O 10mM、KCl 8mM、NaNO₃12mM、CaCl₂·2H₂O 2mM、KH₂PO₄0.37mM、Tricine pH 7.8 25mM、NH₄Cl0.5mM、Na₂EDTA·2H₂O 0.27mM、H₃BO₃1.84mM、FeCl₃·6H₂O0.018mM、MnSO₄·H₂O0.097mM、ZnSO₄·7H₂O0.007mM、CoCl₂·6H₂O0.002mM、HCl0.1mM、FeCl₃·6H₂O3mM、HEPES buffer pH 7.8 10mM、Vitamin B₁₂0.13g/L。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7和圖8所示：

結(jié)果表明：

紅藍(lán)混合光強(qiáng)度250μmol m^-2s^-1發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)，9天達(dá)最大生物量1.23×10⁷個(gè)/mL。紅藍(lán)混合光強(qiáng)度150μmol m^-2s^-1發(fā)酵鹽生紅胞藻(R.salina)9天時(shí)藻紅蛋白達(dá)到53.17mg/L，底物利用率為91.8％，總脂占干重14.07％，SA占總脂肪酸26.43％。

其中，總脂肪酸及總脂的測(cè)定如下，

總脂肪酸的提?。簩⒗鋬龈稍锖蟮募?xì)胞研磨均勻，精確稱取約1.00g加入7mL 20％HCl，75℃水浴震蕩60min。然后用20mL正己烷分三次提取脂質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶后，用氮?dú)獯党龤埩羧軇?。稱重并計(jì)算總脂含量。

總脂含量(％)＝m₁/m₂*100％

式中，m₁代表稱重得到總脂質(zhì)量(g)，m₂代表用于脂質(zhì)提取的凍干菌絲體質(zhì)量(g)。

脂肪酸組成的測(cè)定：毛細(xì)管柱(CP Sil-88:50.0m×250μm×0.20μm)，氮?dú)庾鳛檩d氣，F(xiàn)ID為檢測(cè)器。進(jìn)樣口的溫度為250℃，每次進(jìn)樣體積為1μL。柱溫條件：80℃持續(xù)2min，然后以10℃/min速度升溫到120℃，再以5℃/min升溫到180℃，持續(xù)2min，以2℃/min升溫到230℃，最后230℃持續(xù)5min。以歸一化法計(jì)算總脂中各脂肪酸的百分含量。

紅藍(lán)混合光強(qiáng)度高于250μmol m^-2s^-1時(shí)，鹽生紅胞藻(R.salina)藻紅蛋白合成受到抑制。

實(shí)施例5(對(duì)比實(shí)施例)

將布朗葡萄藻接種于同實(shí)施例1～4中的種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)兩代，每代在裝液量50mL/250mL三角瓶中進(jìn)行，接種量20％(V/V)，23℃、120rpm下?lián)u床培養(yǎng)48h。第二代種子按20％(V/V)的接種量接入裝液量400mL/600mL爆氣式反應(yīng)器中，反應(yīng)器中為人工海水發(fā)酵培養(yǎng)基，紅藍(lán)混合光強(qiáng)度50～350μmol m^-2s^-1，發(fā)酵條件為23℃、通氣速率為0.1m³·min^-1，發(fā)酵10天。其中，藍(lán)光的波長為420～510nm，波峰為460nm。其中，紅光的波長為590～670nm，波峰為640nm?；旌瞎庵?，藍(lán)光與紅光的比例為1:3。光源與發(fā)酵培養(yǎng)基液面的距離為15cm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，布朗葡萄藻各組生長緩慢，在紅藍(lán)混合光下，只在300～350μmol m^-2s^-1有少量產(chǎn)物，個(gè)別組幾乎不生長。

由此可見，本發(fā)明提升了鹽生紅胞藻(R.salina)發(fā)酵時(shí)菌體的生長速度、生物量、藻紅蛋白，總蛋白、多不飽和脂肪酸和總脂含量，生長速度提升3倍以上，藻紅蛋白增加8倍以上，總多不飽和脂肪酸增加4倍以上，生物量增加7倍以上，減少了鹽生紅胞藻(R.salina)收獲的問題，降低了生物質(zhì)濃縮以及目的產(chǎn)物提取的前處理成本。

應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。